李晨晨,李夢麗,張濤

(食品科學與技術國家重點實驗室(江南大學),江蘇 無錫,214122)

人乳對嬰幼兒來說是天然的滋養(yǎng)劑,對其生長發(fā)育具有非常顯著的效果,并具有很多牛乳粉所沒有的,促進健康成長的益生功能。其成分復雜且豐富,含有許多生物分子,如免疫球蛋白、先天性糖蛋白、生物活性肽、抗體、糖脂、游離脂肪酸、細胞因子和趨化因子等[1]。人乳中主要含有2種碳水化合物：乳糖和人乳寡糖(human milk oligosaccharides,HMOs)。乳糖是人乳的主要營養(yǎng)成分之一,具有很高的營養(yǎng)價值。HMOs是人乳中含量僅次于乳糖和脂類的第三大成分,它是200多種不易消化和非營養(yǎng)性碳水化合物的復雜混合物[2]。在研究人乳和牛乳之間的各種成分差異中發(fā)現(xiàn),一個主要的差異是人乳中存在HMOs,而在牛乳和目前市場上的嬰兒配方奶粉中則幾乎沒有。

20世紀30年代,低聚寡糖被認為是母乳中的雙歧因子,于1954年GY?RGY等[3]就發(fā)現(xiàn)并鑒定了母乳中最豐富的低聚寡糖。作為母乳中具有益生功能的成分,它可以調節(jié)腸道菌群環(huán)境,促進有益菌群的生長,還可以作為抗黏附抗菌劑,阻礙病菌與人體腸道黏膜細胞的結合,調節(jié)免疫系統(tǒng),對促進大腦發(fā)育也有重要的作用。由于HMOs的種類繁多、結構復雜且大多數(shù)合成困難,目前市場上出現(xiàn)的嬰幼兒配方奶粉中添加的大多是低聚半乳糖(galacto oligosaccharides,GOS)和低聚果糖(fructo oligosaccharide,FOS),以此來模擬HMOs的部分功能。目前在HMOs中,2′-巖藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose,2′-FL)和乳酰-N-新四糖(lactoyl-N-neotetraose,LNnT)被廣泛研究,與其他母乳低聚糖相比,這2種母乳低聚糖化學結構相對簡單,在母乳中含量較為豐富。歐盟認定這兩者作為新型食品,通過科學和技術資料得出2′-FL和LNnT可以1.2 g/L和0.6 g/L的質量濃度單獨或組合添加到嬰兒配方奶粉中。美國食品藥品監(jiān)督管理局也認證2′-FL和LNnT可作為安全的食品進行添加和使用[4]。由于HMOs的生物學效應,近期嬰兒配方奶粉公司,如雀巢、強生等,對引入主要的HMOs至嬰兒配方奶粉中產(chǎn)生了極大的興趣,試圖開發(fā)盡可能接近母乳的強化配方奶粉。但由于價格及合成水平等的限制,目前還沒有形成工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。隨著科學的進一步發(fā)展,更多種類復雜的HMOs合成研究會越來越完善,市場化規(guī)模的生產(chǎn)也會逐步走向成熟。

1 人乳寡糖的結構與功能

1.1 HMOs的結構組成

HMOs是由3～14個單糖組成的低聚糖,主要以游離形式存在于母乳中,其基本單體分為以下5種,分別是D-葡萄糖(Glc)、D-半乳糖(Gal)、N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine,GlcNAc)、L-巖藻糖(Fuc)和唾液酸[以N-乙酰神經(jīng)氨酸(N-acetylneuraminic acid,Neu5Ac)作為主要形式][5]。這些單糖以不同的方式結合成結構復雜的200多種低聚糖。從結構上來說,通常在寡糖的還原末端存在乳糖結構(Gal-β-1,4-Glc),乳糖通過α-1,2或α-1,3巖藻糖基化和α-2,3或α-2,6唾液酸化的末端能夠產(chǎn)生4種低聚寡糖,分別為：2′-巖藻糖基乳糖(2′-fucosyllactose,2′-FL),3-巖藻糖基乳糖(3-fucosyllactose,3-FL),3′-唾液酸乳糖(3′-sialyllactose,3′-SL)和6′-唾液酸乳糖(6′-sialyllactose,6′-SL),見圖1。同時,在乳糖結構基礎上,以β-1,3或β-1,6鍵連接半乳糖β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖(Gal-β-1,3-GlcNAc,LNB,I型鏈結構)或者連接N-乙酰氨基乳糖(Gal-β-1,4-GIcNAc,LacNAc,II型鏈結構)延伸糖鏈,可以構建形成HMOs的核心結構,它們被分為四核到十核的核心結構[6]。前面4個核心結構分別是乳酰-N-四糖(lacto-N-tetrose,LNT)、乳酰-N-新四糖(lacto-N-neotetraose,LNnT)、乳酰-N-六糖(lacto-N-hexaose,LNH)和乳酰-N-新六糖(lacto-N-neohexaose,LNnH),見表1。這些主鏈結構可以被修飾,所以在母乳中HMOs大致可以分為3種類型,巖藻糖基化的HMOs、唾液酸化的HMOs和非巖藻糖基化的中性HMOs,其中巖藻糖基化的HMOs和非巖藻糖基化的中性HMOs同屬于中性HMOs,而唾液酸化的HMOs則屬于酸性HMOs。在這之中,中性HMOs占HMOs總量的75%以上。在母乳中分泌最豐富的HMOs是2′-FL,約占總HMOs的30%,是目前研究最為廣泛的低聚寡糖之一。由于HMOs的濃度和組成變化很大,其種類和含量隨著個體和時間的變化都會呈現(xiàn)差異之處,不同的女性分泌的寡糖類型不同,同一人在不同哺乳時期含量也有所不同,如在成熟乳中約為12～14 g/L,而初乳中約為20～24 g/L[7]。此外,與足月分娩的婦女相比,早產(chǎn)婦女含巖藻糖基化或唾液酸化的HMOs百分比差異更大。

圖1 人乳寡糖結構圖Fig.1 Structure diagram of human milk oligosaccharides

表1 人乳寡糖的核心結構[8-9]Table 1 Core structure of human milk oligosaccharides

1.2 HMOs的功能

HMOs在嬰幼兒生長發(fā)育的過程中起到不可替代的重要作用,它可以影響腸道微生物群的內在組成,為有益的腸道細菌提供能量來源。研究表明,HMOs進入人體后并不被消化吸收,而是直接到達大腸,通過刺激腸道內的有益菌群(雙歧桿菌和乳桿菌)的增殖生長,有效抑制腸道有害菌群的繁衍,改善腸道微環(huán)境,維護機體的健康狀態(tài)[10]。一些體外研究表明,HMOs可促進某些雙歧桿菌的生長,嬰兒體內的雙歧桿菌在添加HMOs的培養(yǎng)基上生長良好,其中2′-FL作為碳水化合物的唯一來源。隨著時間的推移,嬰兒雙歧桿菌消耗所有HMOs,包括其單糖和雙糖代謝物[11]。另有研究表明,24個益生菌菌株中,只有來自嬰兒的長雙歧桿菌亞種ATCC 15697和M-63能夠發(fā)酵 2′-FL、3-FL、3′-SL 和6′-SL,所以HMOs可作為嬰兒雙歧桿菌的首選底物[12]。此外,嬰兒雙歧桿菌能夠產(chǎn)生短鏈脂肪酸,有利于共生的非致病性細菌的生長,由3個月嬰兒的細菌多樣性報告[13]顯示,其體內的有益雙歧桿菌數(shù)量定殖增加,而病原菌的定殖數(shù)量則在減少。

HMOs可以作為黏膜表面病原體的誘餌受體,對宿主的健康狀況產(chǎn)生影響,同時也可以通過增強腸道屏障功能改善宿主防御機制。在HMOs中,2′-FL可以抑制空腸彎曲桿菌感染以及與其相關的黏膜炎癥的發(fā)生。體外研究表明,2′-FL能使空腸彎曲桿菌的侵襲力減弱80%,抑制黏膜促炎信號的釋放[14]。對嬰兒進行的一項前瞻性研究表明,2′-FL的有益作用包括減少與空腸彎曲桿菌相關腹瀉的發(fā)作次數(shù),對治療壞死性小腸結腸炎也有良好的療效[15]。同時,LNnT可減少動物模型肺中肺炎鏈球菌的數(shù)量,通過調節(jié)腸道微生物菌群來預防壞死性小腸結腸炎、念珠菌病和一些免疫相關疾病的發(fā)生,從而降低早產(chǎn)兒死亡率和發(fā)病率的風險性[16]。

HMOs的一個重要特性是免疫調節(jié),通過直接調節(jié)腸細胞的基因表達,使細胞表面聚糖和其他細胞反應的表達發(fā)生變化,調節(jié)淋巴細胞因子的產(chǎn)生,使TH1/TH2反應更加平衡[17]。對于HMOs來說,它既可以局部作用于黏膜等相關淋巴組織,也可以在全身水平上起作用。尤其是2′-FL,可以通過抑制CD14誘導,直接抑制內毒素介導的腸毒性大腸桿菌侵襲T84和H4腸上皮細胞時的炎癥反應,而炎癥的抑制作用則激發(fā)了HMOs作為天然免疫系統(tǒng)刺激物時所表現(xiàn)出的免疫應答[18]。據(jù)報道,通過剖腹產(chǎn)出生且食用添加2′-FL的嬰兒配方奶粉的兩歲兒童與食用未添加2′-FL的嬰兒配方奶粉的兒童相比,發(fā)生與免疫球蛋白E相關的過敏反應的風險更低[19]。

HMOs及其代謝產(chǎn)物,如唾液酸,在大腦發(fā)育、神經(jīng)傳遞和突觸形成中起著重要的作用。唾液酸作為大腦最佳發(fā)育和認知所必需的營養(yǎng)素,在嬰幼兒發(fā)育成長過程中的作用不言而喻,HMOs作為唾液酸的來源也顯得尤為重要[20]。巖藻糖和2′-FL同時也具有刺激大腦發(fā)育的作用,食用2′-FL可以影響嚙齒動物的認知領域,改善學習和記憶能力[21]。HMOs中的3′-SL 和6′-SL 也可以通過調節(jié)腸—腦軸支持正常的微生物群落和應激期間的行為反應[22]。因此采用母乳喂養(yǎng)的嬰兒,其大腦發(fā)育更加完善、神經(jīng)突觸更加豐富、神經(jīng)系統(tǒng)也更加發(fā)達。

2 HMOs的分離檢測及結構鑒定

2.1 HMOs的分離檢測

HMOs的種類繁多,結構復雜，其種類和含量也存在個體差異,不同 Lewis血型乳母體內HMOs 的種類和含量不同,從而增加了HMOs分離的難度。對母乳進行分離,通常需要去除母乳中的脂肪和蛋白質,目前常用的去除脂肪和蛋白質的傳統(tǒng)方法[23]有下面幾種,一是利用HMOs具有親水性的特性,通過低溫離心去除脂肪,后加入乙醇來沉淀蛋白質;二是可利用分子量大小的不同采用超濾進行分離,HMOs作為小分子親水性物質可以透過超濾膜,而脂肪和蛋白質是大分子則不能通過;第三種,由于HMOs可溶于乙腈,而脂肪不溶于乙腈,蛋白質則被乙腈沉淀,從而達到分離的目的。經(jīng)過上述處理后,母乳中的脂肪和蛋白質被去除,剩下的物質主要是乳糖和寡糖,需要把高含量的乳糖去除,達到分離HMOs的目的。尺寸排阻色譜法作為分離HMOs的傳統(tǒng)方法,可以根據(jù)分離物的分子大小和形狀,按照順序被洗脫出色譜柱而達到分離的目的。但隨著分離技術的進步,更高水平的技術層出不窮,固相萃取(solid-phase extraction,SPE)作為樣品前處理技術而被廣泛應用,具有高通量、易自動化、操作靈活等優(yōu)點。LEBRILLA 團隊針對HMOs設計了一個高通量SPE處理流程[24],該流程同時實現(xiàn)了寡糖還原、脫鹽、脫乳糖以及分離中性糖和酸性糖等目標,對樣品純化和粗分離具有良好的效果。

近些年來,HMOs的研究越來越成為熱點,其分離檢測也吸引了很多科研人員的關注,越來越多的高水平分離技術應運而生。目前常用的分離技術主要有高效陰離子交換色譜(high performance anion exchange chromatography,HPAEC)、親水作用色譜(hydrophilic inter action chromatography,HILIC)、石墨化碳液相色譜(graphitized carbon liquid chromatography,PGC-LC)、毛細管電泳(capillary electrophoresis,CE)等方法。

HPAEC是根據(jù)電荷的不同,在堿性環(huán)境下以陰離子形式交換到色譜柱上,與脈沖安培檢測器(pulsed ampere detector,PAD)聯(lián)用,形成HPAEC-PAD,該方法已被廣泛應用于HMOs的定性和定量分析,它可以進行寡糖單體的分離分析,尤其是對寡糖異構體有很好的分離效果。THURL等[25]使用 HPAEC方法研究了不同人群和不同哺乳期寡糖含量的變化情況,對中性和酸性HMOs進行了分析。親水作用色譜作為一種新型的色譜分離技術,克服了正相色譜和反相色譜在極性化合物分離過程中的不足,具有良好的分離選擇性和高靈敏度,一般在進行HILIC分析時,首先會對寡糖進行衍生化處理,來改善峰型、分離選擇性(尤其是異構體)及檢測靈敏度。AUSTIN等[26]利用親水作用色譜-熒光檢測法應用于加標嬰兒配方奶粉的檢測,效果良好。對于石墨化碳液相色譜,可以對寡糖很好地進行保留以及分離,尤其對寡糖異構體能夠很好地區(qū)分。而毛細管電泳可與紫外檢測器連用于檢測衍生化的HMOs,也可與質譜連用,進行唾液酸化HMOs的分離檢測。

2.2 HMOs的結構鑒定

糖分子的結構非常復雜，HMOs的結構分析包括單糖組成分析、寡糖序列分析、巖藻糖和唾液酸修飾位點分析。從20世紀80年代開始，有機質譜的發(fā)展給糖類化合物的結構分析帶來了較大的進展。按分析器種類分，目前常應用于HMOs 結構分析的質譜有飛行時間質譜(time-of-flight mass spectrometry, TOF-MS)和傅里葉變換離子回旋共振質譜(Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry, FTICR-MS)，后者較前者來說，分辨效率相對高但是價格昂貴?；|輔助激光解析(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)和電噴霧(electrospray ionization, ESI)技術的發(fā)明，使HMOs的結構解析取得了突破性的進展。1994年，STAHL等[27]首先采用基質輔助激光解析電離-飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)法檢測了中性和酸性HMOs的組成輪廓，此方法快速準確，且靈敏度高、操作方法簡便。NINONUEVO[28]和LOCASCIO等[29]采用基質輔助激光解析電離-傅里葉變換離子回旋共振質譜(MALDI-FTICR-MS)快速檢測了不同樣品中的HMOs的組成數(shù)量和響應的相對強度。電噴霧質譜(ESI-MS)的應用擴展了質譜的質量測定范圍，其二級碎片結構還可以提供寡糖的連接順序和連接鍵構型信息。相對于質譜來說，核磁共振是一種新出現(xiàn)的結構鑒定技術，它的出現(xiàn)給糖類結構解析帶來新的發(fā)展和進步。在進行鑒定分析時不需要標準品即可進行定性分析，這對于HMOs中未知糖的定性分析具有明顯優(yōu)勢，但其對樣品的純度要求相對較高。隨著分離解析技術的進步，質譜和核磁共振技術也經(jīng)常聯(lián)合用于寡糖的鑒定分析。

3 HMOs的合成

由于自然界天然合成的功能性糖類化合物產(chǎn)量無法滿足科學研究和人類生產(chǎn)生活的需求,生產(chǎn)開發(fā)功能性糖類化合物已成為科研人員一項挑戰(zhàn)性的項目。目前,除了從母乳中直接分離HMOs外,體外合成的方法主要有化學合成法和生物合成法。下面對體外化學合成和生物合成法作進一步介紹。

3.1 化學合成法

1999 年ALY等[30]首次用化學方法,經(jīng)過34步反應合成了LNT及LNnT,但收率僅為0.6%。隨后SHERMAN等[30]以丙烯基乳糖和乳糖作為原料,將硫苷法引入到LNT衍生物的合成中,由于此合成策略反應步驟多,最終收率也不理想,僅為8.6%。固相合成技術把寡糖連接到一個不溶性物質上,如玻璃珠或樹脂,實現(xiàn)反應產(chǎn)物和過量反應物快速分離,這一技術被應用于合成已確定結構的寡糖上。近些年來,有人提出利用“一鍋酶法”,通過多種酶連續(xù)合成寡糖,其基本原理就是通過調控供體和受體的活性,使得兩步或者多步糖基化反應連續(xù)進行。2012年,HSU等[31]以LNnT為底物,利用此法合成的LNFP III最終得率可達到49.6%。2015年,CHEN等[32]從乳糖苷開始,使用一系列激酶、異構酶、尿苷轉移酶和糖基轉移酶,通過兩步法合成LNnT,得率在81%。2016年,ZHAO等[33]同樣利用此法合成LNFP I,得率可達到95%。用“一鍋酶法”合成的產(chǎn)物產(chǎn)率較之前雖有所提高,但仍存在反應步數(shù)過多的問題,如合成產(chǎn)物LNFP III就需要10步反應才行。而有的產(chǎn)物則無法連續(xù)反應,只能分步進行,利用此法產(chǎn)物產(chǎn)率仍然得不到提升。

化學合成法雖然在合成HMOs方面取得了很大的進展,然而大量有機溶劑的使用、嚴苛的反應條件、冗長的反應級數(shù)等因素都使得其生產(chǎn)成本昂貴,有毒試劑的存在也限制了HMOs在食品領域的廣泛應用。

3.2 生物合成法

3.2.1 酶法合成

由于化學合成HMOs存在自身局限性,為了克服這些缺點,科研人員的研究熱點逐漸轉移到生物合成上來,生物合成法具有安全無污染、運用范圍廣的特點。生物合成HMOs有酶法合成和微生物發(fā)酵合成兩種途徑。酶法合成具有立體和化學選擇性,對不同底物具有選擇特異性。酶法合成體現(xiàn)在酶的促進催化作用上,通常表現(xiàn)在底物、輔助因子和供體存在下合成的特異性表達。

用于合成HMOs的特定酶是糖苷酶和糖基轉移酶。它們可以通過選擇性沉淀、反復純化或重組技術從哺乳動物、昆蟲或微生物這些宿主中獲得。糖苷酶除了可以定量形成糖苷鍵外,對糖基供體底物和糖基化寡糖還具有水解作用,它的活性高,且更容易獲得。但酶體系的穩(wěn)定較差,生成的產(chǎn)物和底物由于水解作用而難以分離,阻礙了糖苷酶在工業(yè)上的應用。

糖基轉移酶具有完全的立體控制和區(qū)域控制,底物特異性好,幾乎可以定量形成糖苷鍵,通過將糖基從活化的供體底物轉移到受體底物上來催化二糖、寡糖或多糖的合成。來自幽門螺旋桿菌(Helicobacterpylori)的巖藻糖基轉移酶使用核苷酸糖鳥嘌呤5′-二磷酸-β-L-巖藻糖(5′-diphospho-β-L-fucose,GDP-L-巖藻糖)作為供體,但是對受體乳糖的親和力較低,特別是來自H.pylori的α-1,3巖藻糖基轉移酶(如FutA),這使得2′-FL或3-FL的生產(chǎn)效率降低。但通過截斷FutA的C端部分堿基和優(yōu)化密碼子,產(chǎn)率得到了提升[34]。另外的α-2,3和α-2,6唾液酸轉移酶通過將唾液酸從活化的核苷酸糖供體(如CMPNeu5Ac)轉移至受體低聚糖來修飾HMO。受體通常以半乳糖苷、N-乙酰半乳糖胺或其他唾液酸為終止信號[35]。

酶法合成雖然有較好的產(chǎn)物收率,但是必需酶的獲得并不容易,且糖基轉移酶催化需要糖核苷酸作為受體,受體的價格昂貴且不易獲得,再加上酶促反應過程中,酶的穩(wěn)定性、催化效率、底物和受體的耐受程度等固有屬性都會對此法造成影響,使其難以大規(guī)模生產(chǎn)。

3.2.2 微生物發(fā)酵

隨著代謝工程和合成生物學的發(fā)展,微生物合成途徑過程中酶的克隆表達變得越來越廣泛,使得全細胞生產(chǎn)的快速發(fā)展成為可能。微生物合成發(fā)酵就是直接在微生物細胞內利用其自身或基因工程過表達或異源表達不同酶進行寡糖合成的一種方法。由于HMOs種類和結構不同,所以其合成發(fā)酵的方式也有不同之處。

3.2.2.1 巖藻糖基化HMOs

巖藻糖基化HMOs是由巖藻糖和乳糖以不同的糖苷鍵連接而成,以α-1,2糖苷鍵連接形成2′-FL,以α-1,3糖苷鍵連接形成3-FL。2′-FL和3-FL作為HMOs中結構相對簡單的低聚糖,在母乳中含量豐富,其中2′-FL作為HMOs的主要成分而存在,它是由核苷酸糖GDP-L-巖藻糖作為中間供體,在α-1,2巖藻糖基轉移酶的作用下,與乳糖進行基團置換而形成的產(chǎn)物。3-FL與2′-FL形成的原理一致,只是由α-1,3巖藻糖基轉移酶連接形成。

關于GDP-L-巖藻糖,它是巖藻糖基化寡糖生物合成途徑的關鍵中間體,主要在巖藻糖基化反應中提供巖藻糖基,其在細菌、哺乳動物和植物中有2種合成途徑,即從頭合成途徑與補救合成途徑[36]。其合成圖如圖2所示。

圖2 GDP-L-巖藻糖的2種生物合成途徑Fig.2 Biosynthetic ways of GDP-L-fucose

目前研究較多的是以大腸桿菌(Escherichiacoli)作為模式微生物,E.coli具有代謝產(chǎn)出GDP-L-巖藻糖的2條完整通路(從頭合成途徑和補救合成途徑),通過構建代謝途徑中的酶,以重組質粒轉化模式生物進行過量表達,從而代謝產(chǎn)出GDP-L-巖藻糖。魏萬濤等[37]通過克隆表達脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)來源的L-巖藻糖激酶/GDP-L-巖藻糖焦磷酸化酶(fucose pyrophosphorylase, Fkp)基因,以L-巖藻糖為底物,通過酶法最終產(chǎn)生GDP-L-巖藻糖的濃度為2.1 mmol/L。KOIZUMI等[38]以谷氨酸棒桿菌(Corynebacteriumglutamicum)產(chǎn)鳥嘌呤-5′-三磷酸(guanine-5′-triphosphate，GTP)作為能量,混合E.coli發(fā)酵產(chǎn)GDP-L-巖藻糖,其產(chǎn)量達到18.4 g/L。LEE等[39]在重組E.coli中過表達內源性NADPH再生酶,以期提高GDP-L-巖藻糖的產(chǎn)量,研究表明恒pH值的補料分批發(fā)酵中,NADPH再生酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase,G6PDH)的過表達使GDP-L-巖藻糖產(chǎn)量增加了21%。

合成GDP-L-巖藻糖的起始碳源物質有葡萄糖、甘油、L-巖藻糖、甘露糖和乳糖,不同的起始碳源物質對其產(chǎn)量的影響和結果都不同。LEE等[40]通過添加甘露糖與以葡萄糖為唯一碳源的情況相比,在過表達gmd和wcaG基因的重組E.coliBL21 star(DE3)的補料分批發(fā)酵中,甘露糖和葡萄糖的供應導致GDP-L-巖藻糖濃度增加了1.3倍,同時,在葡萄糖限制性補料分批發(fā)酵中,一株表達manB、manC、gmd和wcaG基因的重組E.coliBL21 star(DE3)菌株中,最大GDP-L-巖藻糖濃度比僅表達gmd和wcaG基因的對照菌株高4.4倍。BAUMGARTNER等[41]以β-半乳糖苷酶缺陷型(lacZ-)的E.coliJM109 為宿主菌,通過構建GDP-L-巖藻糖的從頭合成和補救合成通路,以0.2%巖藻糖和甘油為底物,GDP-L-巖藻糖的產(chǎn)量達到0.025 g/L。

乳糖的巖藻糖基化由巖藻糖基轉移酶在胞內或胞外催化完成。在E.coliJM109(DE3)中表達來源于H.pylori的α-1,2巖藻糖基轉移酶基因FutC,通過全細胞催化,其2′-FL產(chǎn)量只有1.23 g/L[42]。通過在N端增加3個天冬氨酸標簽,使其FutC的酶活力增加,2′-FL的產(chǎn)量可達6.3 g/L[43]。在E.coliJM107ΔLacZ中表達H.pylori的α-1,2巖藻糖基轉移酶基因FutC和可拉酸操縱子的調控因子rcsA,并敲除可拉酸代謝基因wcaJ,從而構建成產(chǎn)生2′-FL的菌株,以乳糖為底物,其發(fā)酵罐產(chǎn)量可達到14 g/L[44]。為了增強2′-FL的產(chǎn)量,通過構建共表達質粒含有2個α-1,2巖藻糖基轉移酶基因FutC基因拷貝的菌株以增加酶活,其產(chǎn)量可達20 g/L[45]。李晨晨等[46]以E.coliBL21 star(DE3)為原始菌株,通過敲除β-半乳糖苷酶和UDP-葡萄糖脂質載體轉移酶基因lacZ和wcaJ,通過補救途徑搖瓶發(fā)酵,其2′-FL產(chǎn)量可達1.44 g/L。針對3-FL的文獻報道中,HUANG等[47]對比不同來源的α-1,3巖藻糖基轉移酶,結果表明來源H.pylori的FutA酶獲得3-FL產(chǎn)量最高,為12.43 g/L。TAN等[48]對3-FL合成酶FutA進行了定向進化研究,通過突變使得突變體的3-FL合成能力提升了14倍。

3.2.2.2 唾液酸化HMOs

在唾液酸化的HMOs中,唾液酸乳糖的含量最高,包含3′-SL和6′-SL,其濃度可達980 nmol/mL。唾液酸乳糖主要是以α-2,3或α-2,6糖苷鍵連接,以唾液酸和乳糖作為前體物質而構成的3′-SL和6′-SL。首先,胞苷單磷酸-Neu5Ac(CMP-Neu5Ac)合成酶將Neu5Ac催化為CMP-Neu5Ac,其次是α-2,3唾液酸轉移酶(α-2,3-PST)和α-2,6唾液酸轉移酶(α-2,6-PST)分別催化CMP-Neu5Ac和乳糖生成3′-SL和6′-SL。除了體外化學合成外,微生物中也存在CMP-Neu5Ac的從頭合成和補救合成途徑,其代謝合成途徑詳見圖3。FIERFORT等[49]通過共表達來自空腸彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)的N-乙酰葡萄糖胺異構酶基因(neuC)、乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因(neuB)、CM-乙酰神經(jīng)氨酸合成酶基因(neuA)和來源于腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitidis)的α-2,3唾液酸轉移酶,以E.coli為宿主菌,同時敲除Neu5Ac醛縮酶、ManNAc激酶以及半乳β-糖苷酶的基因,確保代謝通路的通暢,以乳糖為底物生成3′-SL的產(chǎn)量為25 g/L。DROUILLARD等[50]采用與生產(chǎn)3′-SL相似的策略,使6′-SL的質量濃度達到30 g/L。此外,GUO等[51]發(fā)現(xiàn)多殺巴斯德桿菌(Pasteurellamultocida)唾液酸轉移酶(PmST)具有雙重反唾液酸酶活性,以糖巨肽(cGMP)和乳糖為底物,能夠同時催化不同比例的3′-SL和6′-SL的形成。目前,已經(jīng)成功開發(fā)了以低成本的底物,如甘油和乳糖,有效地合成3′-SL和6′-SL的方法。但是,YANG等[52]使用低成本的底物葡萄糖進行Neu5Ac的生物合成效率不高,導致最大產(chǎn)量僅為8.31 g/L。因此,必須從頭進行Neu5Ac的生物合成。

微生物代謝發(fā)酵合成HMOs存在代謝產(chǎn)物種類多、難以分離的困難,也存在基因工程改造方面的缺陷,如構建重組質粒時采用抗生素標記基因,限制了其在食品生產(chǎn)中的應用,但隨著科學研究的發(fā)展,難點被逐漸克服,其已成為目前最有發(fā)展?jié)摿Φ囊环N技術。

圖3 CMP-Neu5Ac的兩種生物合成途徑Fig.3 Biosynthetic ways of CMP-Neu5Ac

4 展望

隨著食品健康問題的頻發(fā),人們對嬰幼兒配方奶粉的成分越來越關注,HMOs對促進嬰幼兒生長發(fā)育具有重要的作用,有關HMOs的科學研究也成為熱點。目前合成HMOs的方法有化學法,化學-酶法、酶法和微生物發(fā)酵法。生物合成相對于化學合成來說,由于其條件溫和、生產(chǎn)成本低、環(huán)境友好等,越來越受到人們的偏好,但其也存在自身不利的缺陷,目前生物法只能合成結構簡單的寡糖,對于復雜的HMOs合成困難,產(chǎn)量極低,同時也存在分離困難的問題。隨著科學技術的發(fā)展,生物合成的應用前景越來最廣泛,越來越多的模式微生物會被發(fā)掘利用,從而克服目前技術障礙,用來生產(chǎn)更加安全的產(chǎn)品。HMOs作為益生元對嬰幼兒成長可發(fā)揮有益的生理作用,結合目前市場上嬰幼兒配方奶粉的現(xiàn)狀,亟待開發(fā)具有不同種類的、對嬰幼兒健康狀況有參考價值的產(chǎn)品。