陳 華， 劉 寧， 沙 娜， 單愛軍， 劉海華

深圳市人民醫(yī)院(暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院)急診科，深圳 518020

深Ⅱ度燒傷最常用的治療措施之一是給創(chuàng)面予以燒傷敷料，其理想性能包括：保護(hù)創(chuàng)面、保濕、吸收滲液、不易粘連、防治感染、組織相容性好、促進(jìn)愈合等，但迄今為止，尚無一種敷料能夠具備以上所有性能[1]。靜電紡絲技術(shù)簡稱電紡(electrospinning)技術(shù)，是一種特殊的纖維制造工藝，其利用聚合物溶液或熔體在強(qiáng)電場中進(jìn)行噴射紡絲，可以生產(chǎn)出納米級大分子或者復(fù)合分子的纖維。已有研究表明靜電紡絲技術(shù)制備的納米纖維膜具有：高孔隙率和高比表面積，與細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)結(jié)構(gòu)相似，可以更好地模擬皮膚作用，并刺激細(xì)胞合成多種細(xì)胞因子和生長因子，促進(jìn)細(xì)胞生長和創(chuàng)面愈合等作用[2]。本研究運(yùn)用靜電紡絲技術(shù)制作絲素納米纖維敷料，將這種敷料用于深Ⅱ度燒傷大鼠模型，通過觀察并檢測其創(chuàng)面愈合情況、創(chuàng)面組織中的新生血管標(biāo)記物血小板-內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子(platelet and endothelial cell adhesion molecules 1，PECAM-1/CD31) 和細(xì)胞增殖標(biāo)記物Ki-67的表達(dá)變化，探討這種新型敷料在燒傷創(chuàng)面愈合中的作用和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 靜電紡絲素納米纖維薄膜燒傷敷料

本研究所用靜電紡絲素納米纖維敷料，由西安交通大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院張曉慧教授提供。其具體制備方法如下：將桑蠶繭在碳酸鈉溶液中煮沸，以蒸餾水徹底沖洗提取絲素蛋白。將提取的絲素蛋白在60℃ 9.3 mol/L的LiBr溶液中溶解4 h，得到20%(W/V)的溶液；室溫下使用Slide-a-Lyzer透析盒(MWCO 3500，Pierce)將該溶液用蒸餾水透析48 h以去除鹽，將透析液在5℃下離心20 min×2次，以去除透析過程中形成的雜質(zhì)和聚集體，得到絲素蛋白水溶液的最終濃度約為8%(W/V)；將5.0%(W/V)聚環(huán)氧乙烷(PEO)(9×106g/mol)加入體積比為1∶4的8.0%(W/V)絲素蛋白水溶液中，制得7.5%(W/V)的絲素/PEO混合物紡絲液；運(yùn)用靜電紡絲技術(shù)將處理后的混合液注入連接靜電紡絲機(jī)噴射頭的注射器中，調(diào)節(jié)電位、溶液流速和毛細(xì)管尖端與收集板之間的距離，將電紡纖維收集在覆蓋有鋁箔的收集板上；用100%甲醇處理10 min，誘導(dǎo)β-折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)化，使其不溶于水；室溫下在蒸餾水中瀝濾72 h，去除PEO。

1.2 主要試劑與設(shè)備

蘇木精-伊紅(HE)染色、IHC試劑盒、DAB顯色試劑盒、CD31、Ki-67抗體等相關(guān)試劑，分別購自武漢谷歌生物科技公司、上海碧云天生物技術(shù)有限公司、國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司、Abcam、DAKO公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物和動物燒燙傷模型建立

SPF級健康雄性SD大鼠60只，體重220～260 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號：SCXK(粵)2018-0002]。本研究經(jīng)深圳市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)，符合動物實(shí)驗(yàn)的倫理學(xué)要求。所有大鼠分籠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，予以3%戊巴比妥鈉1.0～1.5 mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉；麻醉成功后，依次用剃毛刀、脫毛膏處理大鼠背部局部皮膚，75%乙醇消毒；將直徑3 cm的金屬砝碼置入恒溫水浴箱加熱至95℃，隨即將砝碼垂直置于大鼠背部備皮處皮膚20 s，建立直徑3 cm的燙傷創(chuàng)面(1 d后取燙傷局部組織，經(jīng)病理切片證實(shí)為深Ⅱ度燒傷)，隨后立即予以腹腔內(nèi)注射林格氏液(20 mL/kg)抗休克；大鼠麻醉蘇醒后能夠自由活動和正常飲食，表明建模成功。

1.4 創(chuàng)面處理

燙傷后，創(chuàng)面局部予以碘伏消毒，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面予以靜電紡絲素納米纖維敷料覆蓋，表面再覆蓋清潔紗布，膠帶固定。對照組創(chuàng)面碘伏消毒后，予以無菌紗布覆蓋創(chuàng)面，膠帶固定。創(chuàng)面每2天消毒1次，并更換敷料，共治療21 d。

1.5 標(biāo)本采集

分別于燙傷后第4、8、14、21天，采用簡單隨機(jī)抽樣法，每組選取6只大鼠，3%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射麻醉后，切取燙傷創(chuàng)面全層皮膚組織至淺筋膜層，將剪取組織用10%甲醛固定24 h，石蠟包埋后切片。大鼠取材后隨即以脊椎脫臼法處死。

1.6 創(chuàng)面愈合情況和創(chuàng)面愈合率計(jì)算

由2名觀察員分別于燙傷后當(dāng)天(第0天)，燙傷后第1、4、8、14、21天觀察拍照記錄實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠創(chuàng)面顏色、分泌物、愈合等情況，并通過Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率=(治療前創(chuàng)面面積-治療后創(chuàng)面面積)/治療前創(chuàng)面面積×100%。

1.7 HE染色和Masson染色

取創(chuàng)面組織切片進(jìn)行脫蠟、水化，隨后進(jìn)行HE染色和Masson染色，脫水封片，鏡下觀察拍照創(chuàng)面組織中炎性細(xì)胞、膠原纖維、新生血管等生長情況。

1.8 免疫組織化學(xué)法檢測CD31、Ki-67表達(dá)情況

取創(chuàng)面組織切片，依次進(jìn)行脫蠟、水化、抗原修復(fù)、血清封閉、孵育一抗及相應(yīng)二抗、清洗、DAB顯色、蘇木精復(fù)染、封片等過程。由2名病理科醫(yī)師獨(dú)立閱片，每張切片于顯微鏡下隨機(jī)選取3個高倍視野對CD31、Ki-67表達(dá)陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 靜電紡絲素納米纖維鏡下形態(tài)

如圖1所示，靜電紡絲素納米纖維大體觀為白色薄布狀紡織物，被甲醇處理后不溶于水。掃描電子顯微鏡下，納米纖維具有固體表面，在纖維之間具有相互連接的空隙，呈現(xiàn)出多孔網(wǎng)格狀。

2.2 兩組大鼠燙傷創(chuàng)面愈合情況

燙傷后第4天，兩組創(chuàng)面大小均無明顯變化，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面焦痂濕潤，少許水腫但無明顯滲出；對照組創(chuàng)面焦痂較干燥，出現(xiàn)破潰并有液體滲出。燙傷后第8天，兩組創(chuàng)面面積均有所縮小，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面濕潤，可見周圍少許壞死組織溶解；對照組創(chuàng)面堅(jiān)硬干燥，破潰、滲出較前明顯。燙傷后第14天，兩組創(chuàng)面面積明顯縮小，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面縮小更顯著，焦痂脫落完全，創(chuàng)面周圍可見新生上皮組織；對照組焦痂部分脫落，創(chuàng)面縮小，創(chuàng)面周圍部分上皮化生長。燙傷后第21天，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面基本愈合，顏色較周圍正常皮膚組織深，新生皮膚、毛發(fā)生長接近正常；對照組創(chuàng)面部分愈合，焦痂脫落，創(chuàng)面明顯縮小。創(chuàng)面愈合過程見圖2。

圖2 SD大鼠深Ⅱ度燒傷后創(chuàng)面愈合過程Fig.2 The wound healing process of deep second-degree burns in the two groups

2.3 兩組大鼠燙傷創(chuàng)面愈合率對比

燙傷后第4、8、14、21天，實(shí)驗(yàn)組和對照組創(chuàng)面愈合率見表1，兩組燙傷后第8、14、21天創(chuàng)面愈合率比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面愈合情況明顯優(yōu)于對照組。

表1 兩組大鼠燙傷創(chuàng)面愈合率Table 1 Healing rate of scald wound in the two

2.4 兩組大鼠燙傷創(chuàng)面組織HE和Masson染色結(jié)果

燙傷后第4天，鏡下觀察可見兩組創(chuàng)面組織中均有炎性細(xì)胞浸潤，但實(shí)驗(yàn)組炎性細(xì)胞滲出較少，膠原纖維腫脹；對照組可見大量炎性細(xì)胞滲出，膠原纖維降解壞死，角質(zhì)層、毛囊、皮脂腺等組織結(jié)構(gòu)破壞明顯。燙傷后第8天，鏡下觀察可見兩組創(chuàng)面組織中炎性細(xì)胞浸潤較前明顯增加，實(shí)驗(yàn)組可見表皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞明顯增加，并可見毛細(xì)血管新生；對照組可見少量表皮細(xì)胞增生和新生血管。燙傷后第14天，實(shí)驗(yàn)組鏡下顯示表皮細(xì)胞排列整齊，上皮化完整，皮膚層次清晰，毛囊、皮脂腺、新生血管等附屬結(jié)構(gòu)完整；對照組仍可見炎性細(xì)胞浸潤，皮膚表層可見變性壞死組織，上皮化不完整，皮膚層次不清晰，毛囊、皮脂腺、血管等附屬結(jié)構(gòu)不完整。燙傷后第21天，實(shí)驗(yàn)組可見表皮結(jié)構(gòu)完整，表皮細(xì)胞基本覆蓋創(chuàng)面，基底細(xì)胞排列整齊結(jié)合緊密，層次清晰，膠原纖維量多且排列有序，可見較多新生血管，和正常完整皮膚相似；對照組顯示表皮結(jié)構(gòu)不完整，創(chuàng)面無完整表皮細(xì)胞覆蓋，可見上皮細(xì)胞向中央爬行，較多成纖維細(xì)胞和排列紊亂的大量膠原纖維，及新生血管形成(圖3、圖4)。

圖3 SD大鼠深Ⅱ度燒傷后創(chuàng)面HE染色(×100)Fig.3 HE staining of tissues after deep second-degree burns in the two groups (×100)

圖4 SD大鼠深Ⅱ度燒傷后創(chuàng)面Masson染色(×200)Fig.4 Masson staining after tissues after deep second-degree burns in the two groups (×200)

2.5 兩組大鼠燙傷創(chuàng)面組織CD31免疫組化染色結(jié)果

燙傷后第4、8、14天，兩組大鼠創(chuàng)面組織鏡下顯示新生血管逐漸增多，血管內(nèi)皮細(xì)胞圍繞血管壁排列，血管腔清晰，細(xì)胞胞核藍(lán)染，細(xì)胞質(zhì)部分被深染成棕黃色，主要呈胞質(zhì)陽性，陽性染色細(xì)胞數(shù)量依次增加，可見實(shí)驗(yàn)組新生血管數(shù)量及陽性染色血管內(nèi)皮細(xì)胞比對照組多。燙傷后第21天，兩組大鼠創(chuàng)面組織鏡下顯示新生血管數(shù)量和陽性染色細(xì)胞數(shù)量較前有所減少，對照組較實(shí)驗(yàn)組減少更加明顯(圖5)。

圖5 SD大鼠深Ⅱ度燒傷后創(chuàng)面免疫組織化學(xué)法CD31染色結(jié)果(×400)Fig.5 CD31 staining results of immunohistochemical method on wounds of two groups(×400)

2.6 兩組大鼠燙傷創(chuàng)面組織Ki-67免疫組化染色結(jié)果

燙傷后第4、8、14天，兩組大鼠創(chuàng)面組織鏡下顯示細(xì)胞胞核藍(lán)染，部分細(xì)胞核內(nèi)可見棕色顆粒，染色結(jié)果為陽性，并且數(shù)量逐漸增多，實(shí)驗(yàn)組較對照組陽性染色細(xì)胞數(shù)量更多。燙傷后第21天，兩組大鼠創(chuàng)面組織鏡下顯示陽性染色細(xì)胞數(shù)量較前有所減少，對照組較實(shí)驗(yàn)組減少更加明顯(圖6)。

圖6 SD大鼠深Ⅱ度燒傷后創(chuàng)面免疫組織化學(xué)法Ki-67染色結(jié)果(×400)Fig.6 Ki-67 staining results of deep second-degree burns wound in the two groups(×400)

3 討論

本研究建立SD大鼠深Ⅱ度燙傷模型，觀察靜電紡絲素納米纖維敷料的治療效果，結(jié)果顯示其能夠縮短燙傷創(chuàng)面愈合時間，提高創(chuàng)面愈合率。同時發(fā)現(xiàn)，靜電紡絲素納米纖維敷料促進(jìn)創(chuàng)面組織中CD31和Ki-67的表達(dá)，增加了創(chuàng)面血管新生數(shù)量及細(xì)胞增殖能力，這可能是其促進(jìn)創(chuàng)面愈合的機(jī)制。

CD31屬于免疫球蛋白超家族成員，通常位于血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和某些類型的T細(xì)胞表面，以及內(nèi)皮細(xì)胞間緊密連接處，與血管生成和內(nèi)皮細(xì)胞運(yùn)動相關(guān)。在免疫組化檢測中，CD31主要用于證明內(nèi)皮細(xì)胞的存在，常用于評估組織中新生血管生成和數(shù)量[3-5]。Ki-67是一種核蛋白，和細(xì)胞增殖密切相關(guān)。主要表達(dá)于細(xì)胞周期中的有絲分裂間期以及分裂期(G1、S、G2、M期)，但有絲分裂靜止期(G0期)該蛋白不表達(dá)。Ki-67半衰期短，G1期及S期早期，表達(dá)水平較低，S期及G2期表達(dá)急劇上升，在M期達(dá)到峰值，隨后在細(xì)胞分裂后期和末期表達(dá)迅速下降，脫離增殖周期后迅速降解，這些特點(diǎn)使其成為反映細(xì)胞增殖能力的常用分子標(biāo)記物[6-8]。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，靜電紡絲素納米纖維敷料能夠增加創(chuàng)面組織中CD31和Ki-67的表達(dá)，促進(jìn)血管新生和細(xì)胞增殖，改善局部創(chuàng)面血供，加速創(chuàng)面愈合。HE染色也顯示，經(jīng)治療后大鼠創(chuàng)面皮膚結(jié)構(gòu)恢復(fù)完整，層次清晰，上皮化完成較好。之前有研究報道，絲素蛋白納米纖維能夠良好地模仿細(xì)胞外基質(zhì)，促進(jìn)組織細(xì)胞增殖和血管新生[9]，負(fù)載納米氧化鋅顆粒的絲素膠原蛋白支架能夠促進(jìn)皮膚創(chuàng)面修復(fù)，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其一致[10]。

綜上所述，靜電紡絲素納米纖維敷料有望成為一種新的創(chuàng)面敷料用于深Ⅱ度燒傷創(chuàng)面治療，但其具體分子機(jī)制還需要進(jìn)一步深入研究。