李松海， 曾狀林， 冮洪生 △， 魏宇淼 △

1武漢市第四醫(yī)院，華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬普愛(ài)醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢 4300332華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院心血管內(nèi)科，武漢 430022

動(dòng)脈粥樣硬化性心腦血管病死亡占我國(guó)城鄉(xiāng)人口死亡的40%以上，雖然現(xiàn)有的診治措施取得了較好的臨床效果，但這一疾病所造成的人群死亡數(shù)目仍在上升[1]。動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，主流觀點(diǎn)是血管壁在高脂狀態(tài)下過(guò)度的脂質(zhì)沉積以及血管壁對(duì)脂質(zhì)成分的慢性進(jìn)展性炎癥反應(yīng)，動(dòng)脈粥樣硬化的形成與脂質(zhì)代謝異常關(guān)系密切[2]。

血管壁膽固醇沉積及血管壁相關(guān)細(xì)胞功能損害是動(dòng)脈粥樣硬化血管損害的核心發(fā)病機(jī)制[3-4]，低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)受體廣泛存在于肝、動(dòng)脈壁細(xì)胞等全身各組織的細(xì)胞膜表面，當(dāng)血漿中LDL與其受體結(jié)合后，受體聚集成簇，內(nèi)吞入細(xì)胞與溶酶體融合。但隨著細(xì)胞內(nèi)膽固醇水平的上升，細(xì)胞通過(guò)下調(diào)LDL受體功能，以避免膽固醇的過(guò)量沉積。組成LDL的載脂蛋白B(ApoB)分子巨大(包含4536個(gè)氨基酸殘基)，1分子ApoB可與大約700個(gè)磷脂分子、600個(gè)游離膽固醇分子、1600個(gè)膽固醇酯分子、185個(gè)三酰甘油形成一個(gè)復(fù)雜的蛋白-脂質(zhì)組合體，在機(jī)體復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境狀態(tài)下極易氧化，在一氧化氮合成酶(NOS)及還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NADPH oxidase，Nox)及髓過(guò)氧化物酶(MPO)的作用下，形成氧化型LDL(Ox-LDL)，產(chǎn)生大量抗原決定簇的改變[5]。因LDL的氧化及其抗原決定簇的改變而產(chǎn)生氧化反應(yīng)特異性表位(oxidation-specific epitope，OSE)，使得機(jī)體炎癥相關(guān)吞噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞可以通過(guò)其固有的模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor，PRR)對(duì)Ox-LDL進(jìn)行吞噬，這類(lèi)受體在巨噬細(xì)胞突出表現(xiàn)為類(lèi)型眾多的清道夫受體(scavenger receptor，SR)和Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)[6]。清道夫受體現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)10余種，包括A類(lèi)清道夫受體SRA1及SRA2(SRA，識(shí)別富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域)、B類(lèi)清道夫受體如SR-BI及CD36，以及主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞的E類(lèi)清道夫受體(清道夫受體血凝素結(jié)構(gòu)域)即血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(lectin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1，LOX-1)。內(nèi)皮細(xì)胞主要通過(guò)LOX-1進(jìn)行Ox-LDL的結(jié)合、吞噬、降解并引起內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和相關(guān)損害。因此如何減輕Ox-LDL通過(guò)LOX-1誘導(dǎo)的內(nèi)皮屏障受損，維持良好的內(nèi)皮細(xì)胞生存狀態(tài)對(duì)防治動(dòng)脈粥樣硬化具有重要意義。

大量研究表明以O(shè)x-LDL及其載脂蛋白片段進(jìn)行主動(dòng)免疫可以有效減少動(dòng)脈粥樣硬化病變，其中特異性片段P210在ApoE基因敲除小鼠模型中的保護(hù)效果尤為突出，但具體機(jī)制尚未闡明[7]?；诖宋覀兺ㄟ^(guò)構(gòu)建體外模型探究特異性P210抗體保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞減輕動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要材料與試劑

原代人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)由教育部分子靶向治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(心血管免疫實(shí)驗(yàn)室)提供。ECM培養(yǎng)液及血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，胰蛋白酶購(gòu)自Amresco公司，Hoechest 33258購(gòu)自碧云天公司，Bax、Bcl-2、ZO-1抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司，內(nèi)參GAPDH、β-actin抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。牛血清白蛋白、油紅染液、DAPI染液、Calcein Am染液購(gòu)自武漢谷歌生物科技有限公司，Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡試劑盒(BD，美國(guó))購(gòu)自上海優(yōu)寧維公司，BCA蛋白檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于Pierce公司，Cocktail混合蛋白酶抑制劑、全蛋白裂解液購(gòu)自武漢安特捷公司，Western配膠試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司，Ox-ApoB特異性多肽片段P210合成及其特異性抗體的制備、提純由武漢安特捷生物有限公司輔助完成，5%脫脂牛奶、甲醇、異丙醇、氯仿、無(wú)水乙醇、10 ×麗春紅溶液等輔助試劑均購(gòu)自武漢谷歌、大風(fēng)或安特捷生物有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

細(xì)胞培養(yǎng)于專(zhuān)用的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液ECM中，均置于21%O2、5%CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。用含1%～2% FBS的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h(饑餓處理)后，將細(xì)胞分為3組，對(duì)照組：未加Ox-LDL和Ab(P210抗體)；Ox-LDL組：分別加入25、50及100 μg/mL Ox-LDL(3個(gè)亞組)；Ox-LDL+Ab組：在50 μg/mL Ox-LDL存在下，分別加入100和200 ng/mL Ab(2個(gè)亞組)。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

Annexin Ⅴ-FITC/PI雙染試劑盒檢測(cè)HUVEC細(xì)胞的凋亡：①10× Binding Buffer用ddH2O稀釋成1× Binding Buffer；②用不含EDTA的0.25%的胰酶消化HUVEC(EDTA會(huì)與Ca離子螯合，影響Annexin Ⅴ的結(jié)合)，顯微鏡下密切監(jiān)測(cè)消化程度，避免過(guò)度消化。室溫下離心(1000 r/min，5 min)，收集細(xì)胞；③用4℃預(yù)冷的1×PBS緩沖液重懸細(xì)胞，離心(1000 r/min，5 min)，重復(fù)上述操作1次；④用1× Binding Buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL，取200 μL細(xì)胞懸液至流式管中；⑤每管加入5 μL Annexin Ⅴ，混勻，室溫避光孵育15 min；⑥流式上機(jī)前5 min加入5 μL PI避光染色，上機(jī)前酌情補(bǔ)加適量1× Binding Buffer。

1.4 Western blot檢測(cè)細(xì)胞Bax、Bcl-2、ZO-1蛋白的表達(dá)

將培養(yǎng)液從細(xì)胞培養(yǎng)板中吸出，每孔加入100 μL混有蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，轉(zhuǎn)入4℃預(yù)冷EP管中振蕩裂解，離心，測(cè)濃度，分裝。跑膠，濕轉(zhuǎn)到PVDF膜。將PVDF膜浸沒(méi)于TBST配制的5%脫脂牛奶溶液中，室溫下?lián)u床封閉2 h左右。加入一抗稀釋液(稀釋度1∶1000，根據(jù)抗體說(shuō)明書(shū)調(diào)整)，冰上搖勻1～2 h，4℃冰箱過(guò)夜。TBST洗滌10 min × 3次。加入HRP標(biāo)記的稀釋二抗，室溫孵育2 h。棄掉二抗溶液，TBST洗滌10 min × 3次。準(zhǔn)備ECL溶液，溶液A與溶液B等體積混勻，現(xiàn)配即用。將ECL溶液均勻加于膜上，室溫1 min。去除ECL溶液，Bio-Rad化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)，Image Lab軟件計(jì)算蛋白條帶灰度值。

1.5 細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)ZO-1的表達(dá)

不同處理組的細(xì)胞爬片用PBS清洗，4%多聚甲醛固定10 min，PBS清洗后10%山羊血清封閉30 min。加入適量PBS稀釋的相應(yīng)一抗，放入濕盒內(nèi)4℃過(guò)夜。常溫復(fù)溫1 h，PBS清洗5 min × 3次。加入PBS稀釋的熒光標(biāo)記二抗，常溫孵育1 h。PBS清洗5 min × 3次。DAPI復(fù)染核5 min，滴加防熒光淬滅封片劑封片。避光4℃放置，24 h內(nèi)拍照儲(chǔ)存。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 P210抗體可以減少Ox-LDL所致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡壞死

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示(圖1A)：與對(duì)照組(a)比較，Ox-LDL可引起原代HUVEC凋亡壞死，并隨Ox-LDL濃度增加(25，50，100μg/mL)呈梯度變化，P210抗體可以減少該變化。Western blot檢測(cè)顯示(圖1B)：促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2比值隨著Ox-LDL濃度增加而表達(dá)增加，且這一作用可被P210抗體所改善。說(shuō)明Ox-LDL可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡壞死，P210抗體可抑制這一作用。

2.2 P210抗體可以減少內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積

激光共聚焦示：紅色熒光探針Dil標(biāo)記的Ox-LDL可被內(nèi)皮細(xì)胞(鈣黃綠素Calcein Am活體染色)吞噬，沉積于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，P210抗體可以減少內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積(圖2)。

與Ox-LDL組比較，**P<0.01

2.3 P210抗體能減輕Ox-LDL對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白表達(dá)的抑制作用

激光共聚焦及Western blot檢測(cè)示：Ox-LDL可以抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)，P210抗體處理能顯著減輕該抑制效應(yīng)。說(shuō)明抗體對(duì)Ox-LDL所引起的內(nèi)皮細(xì)胞緊密連接破壞亦有保護(hù)效應(yīng)(圖3)。

與對(duì)照組比較，**P<0.01；與Ox-LDL(50 μg/mL)組比較，##P<0.01

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化性疾病給人類(lèi)的健康帶來(lái)極大的危害，對(duì)其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入研究有助于對(duì)其更好地進(jìn)行干預(yù)。在動(dòng)脈粥樣硬化研究中，越來(lái)越多的研究表明脂質(zhì)沉積及氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的持續(xù)炎癥反應(yīng)在粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[8]，研究者常常更關(guān)注動(dòng)脈粥樣硬化的主要病理改變，即泡沫細(xì)胞、膽固醇核心的形成以及纖維帽的厚薄，這些與巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的病理反應(yīng)關(guān)系密切，而血管內(nèi)皮細(xì)胞作為保護(hù)血管的第一道屏障在動(dòng)脈粥樣硬化的形成中更是具有核心地位[9]。

生理狀況下，血管內(nèi)皮通過(guò)縫隙連接、緊密連接及粘附連接形成單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)。正常情況下內(nèi)皮細(xì)胞通過(guò)穿胞機(jī)制及細(xì)胞間隙允許一些小分子和液體等穿過(guò)，循環(huán)中清蛋白、LDL等不易透過(guò)內(nèi)皮屏障。在高血脂、高血壓、吸煙等誘因下，循環(huán)中LDL不斷地通過(guò)脂氧合酶及髓過(guò)氧化物酶等途徑形成Ox-LDL[10]。資料表明，相較于LDL，Ox-LDL在動(dòng)脈粥樣硬化病變的發(fā)生發(fā)展中起著更為關(guān)鍵的作用[11]。Ox-LDL顆粒的受體不具有下調(diào)功能，從而造成脂質(zhì)的過(guò)度沉積，同時(shí)吞噬的脂質(zhì)不能在細(xì)胞內(nèi)完全降解，可促使炎癥反應(yīng)激活和內(nèi)皮細(xì)胞等血管壁細(xì)胞的應(yīng)激及損害。Ox-LDL經(jīng)LOX-1途徑損害內(nèi)皮屏障功能，導(dǎo)致脂質(zhì)向內(nèi)皮下浸潤(rùn)并增加脂質(zhì)穿胞作用，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞生存狀態(tài)惡化是動(dòng)脈粥樣硬化及相關(guān)損害的關(guān)鍵因素[12-13]。循環(huán)中的Ox-LDL約占循環(huán)中LDL的10%左右。Ox-LDL可以通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞表面LOX-1受體在血管內(nèi)皮細(xì)胞中沉積并引起一系列不良后果[14]。

本研究結(jié)果顯示P210抗體干預(yù)可以減輕內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，使促凋亡蛋白Bax表達(dá)相對(duì)減少、抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)相對(duì)增多，抑制內(nèi)皮細(xì)胞死亡，從而保護(hù)內(nèi)皮屏障功能。本研究還發(fā)現(xiàn)P210抗體可以增加內(nèi)皮緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)，減少內(nèi)皮連接屏障的破壞，從而減少Ox-LDL在內(nèi)皮細(xì)胞下沉積，減輕內(nèi)皮細(xì)胞生理功能的損傷。因此，我們認(rèn)為，P210抗體可以減少氧化脂質(zhì)在內(nèi)皮細(xì)胞下沉積，減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，保護(hù)內(nèi)皮屏障，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

我們的研究尚存在許多不足之處，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)需要利用ApoE基因和LOX-1基因敲除小鼠進(jìn)行更細(xì)致完善的探索和驗(yàn)證。我們認(rèn)為，以免疫干預(yù)的方式對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化病變的初始環(huán)節(jié)進(jìn)行干預(yù)是一個(gè)很有前景的研究方向。

綜上所述，針對(duì)氧化脂質(zhì)特異性抗原表位的P210抗體可以減輕氧化脂質(zhì)在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)的沉積，減少內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，保護(hù)內(nèi)皮連接蛋白的正常表達(dá)從而維持內(nèi)皮屏障完整性，從初始環(huán)節(jié)減輕動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展，但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步的深入研究。