劉郴郴， 宋正帥， 章小平

華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院 1泌尿外科 2泌尿外科研究所，武漢 4300223 華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬武漢中心醫(yī)院泌尿外科，武漢 430014

腎癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，其中又以腎透明細胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)占大多數(shù)(75%)[1-2]。約30%的腎癌患者在初診時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶以及30%的患者在行根治性腎切除術(shù)后發(fā)現(xiàn)復(fù)發(fā)是造成患者不良預(yù)后的主要原因[3-4]。目前針對進展期腎癌，隨機臨床試驗證實靶向血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)等通路的抗血管生成藥物，包括舒尼替尼、帕唑帕尼等，能夠有效緩解疾病進展，并已得到廣泛應(yīng)用[5]。然而，目前仍缺乏能有效預(yù)測ccRCC靶向藥物耐藥性的分子標記物，因此，尋找和確認相應(yīng)的分子標記物以預(yù)測療效，探索耐藥機制，是精準治療的關(guān)鍵[1]。近年來，隨著高通量芯片和生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，我們可以獲取和分析腫瘤、腫瘤毗鄰組織和正常組織在多種基因表達水平上的差異，從而發(fā)現(xiàn)腫瘤發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)以及靶向藥物耐藥等表型中的潛在分子機制。本研究基于TCGA、GEO等公共數(shù)據(jù)庫，利用在線生物信息學(xué)工具和軟件對數(shù)據(jù)進行篩選、分析、整理，得到ccRCC對舒尼替尼獲得性耐藥的分子標志物，為患者預(yù)后判斷及治療選擇提供依據(jù)，并對其中潛在的信號通路及分子機制進行了探討，為后續(xù)通過實驗及臨床數(shù)據(jù)進行進一步驗證奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 微陣列數(shù)據(jù)

從GEO數(shù)據(jù)庫中下載基因表達譜GSE76068。根據(jù)安捷倫GPL 10558平臺(Illumina Humanht-12 v4.0表達芯片)提供的信息，GSE76068中共有24個樣本，包括8個未處理的ccRCC樣本，8個舒尼替尼敏感樣本及8個舒尼替尼耐藥樣本。GSE76068中包含這24個樣本的全基因組mRNA表達數(shù)據(jù)。

1.2 篩選差異表達基因(DEGs)

利用基于R語言的GEO數(shù)據(jù)便捷在線分析工具GEO2R(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/GEO2r/)，通過將“adj.P<0.05”和“|logFC|>1”作為分界標準，得到舒尼替尼敏感樣本和舒尼替尼耐藥樣本之間的DEGs。

1.3 蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)及模塊分析

基于相應(yīng)DEGs蛋白之間物理和功能聯(lián)系，利用相互作用基因檢索工具(STRING，https：//string-db.org/cgi/network.pl)構(gòu)建了PPI。同時根據(jù)最大交互數(shù)量≤5個，置信度≥0.4分的標準，用STRING繪制并篩選出了10個樞紐基因。此外，利用分子復(fù)合體檢測(MCODE)插件，按照節(jié)點得分值=0.2，K值≥2，最大深度=100，在Cytoscape軟件中構(gòu)建了各模塊的PPI網(wǎng)絡(luò)。

1.4 DEGs和樞紐基因的GO和KEGG通路分析

利用DAVID(https：//david.ncifcrf.gov/summary.jsp)數(shù)據(jù)庫對DEGs和樞紐基因的基因本體(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號途徑進行分析。DAVID是一個免費開放的在線工具，為大規(guī)模的基因或蛋白質(zhì)列表提供了系統(tǒng)全面的生物注釋信息[6]。統(tǒng)計偏差的截止標準為P<0.05。

1.5 基因集富集分析(GSEA)

為尋找ccRCC舒尼替尼耐藥的潛在生物學(xué)功能和途徑，進行了GSEA分析。16個ccRCC樣本基因表達信息從GSE76068下載后，按舒尼替尼敏感和舒尼替尼耐藥分為2組。選擇Annotated gene sets c2.cp.v6.2.symbols.gmt作為參考基因集，Illumina HumanHT-12V4.0表達芯片作為芯片平臺，并以P<0.05、FDR<0.25、基因大小≥100為分界標準。

1.6 樞紐基因的診斷、預(yù)后和臨床病理價值分析

從TCGA數(shù)據(jù)庫中獲取534例ccRCC患者總生存期(OS)和無病生存期(DFS)信息，以及患者年齡、性別、腫瘤TNM分期和G分級等臨床信息(無特殊篩選標準)，通過GraphPad Prism 6.0軟件獲得Kaplan-Meier曲線，評估樞紐基因的預(yù)后價值。并通過受試者工作特征(ROC)曲線分析，確定這些樞紐基因?qū)cRCC的診斷價值。綜合上述結(jié)果，重點評估靶基因ISG15的臨床病理價值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究采用GraphPad Prism 6.0(GraphPad Software，Inc，USA)和SPSS 22.0(IBM SPSS，Chicago，IL)為統(tǒng)計分析軟件，各組數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。采用非配對t檢驗分析ccRCC與正常腎組織之間樞紐基因表達的差異；通過Mann-Whitney檢驗統(tǒng)計目標基因和腎癌患者臨床病理參數(shù)之間的聯(lián)系；通過Kaplan-Meier曲線和對數(shù)秩檢驗計算基因表達水平與患者OS、DFS的相關(guān)性，再結(jié)合OS和患者性別、年齡、TNM分期等變量做單因素Cox分析，并將篩選到的顯著相關(guān)變量進行多因素Cox比例風(fēng)險回歸分析。

2 結(jié)果

2.1 篩選DEGs

在GSE76068中，共有8個舒尼替尼敏感和8個舒尼替尼耐藥的ccRCC樣本。以P<0.05、|logFC|≥1為閾值，通過GEO2R分析出DEGs，其中包括表達上調(diào)基因38個，表達下調(diào)基因57個。

2.2 樞紐基因篩選與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

根據(jù)連接度由高到低確定了10個樞紐基因，包括IL6、MX1、ISG15、IFIT1、OAS1、OAS2、IFIT3、IFI27、RSAD2、OASL，其連接度依次為22、17、16、15、15、15、15、15、14、14。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)一半的樞紐基因?qū)儆诟蓴_素相關(guān)的DNA損傷抗性標志基因(IRDS)[7]。根據(jù)STRING查詢的蛋白信息，我們分別構(gòu)建了所有DEGs和前10位樞紐基因的PPI網(wǎng)絡(luò)(圖1A、1B)；此外，Cytoscape中的MCODE插件識別出PPI網(wǎng)絡(luò)中的前3個重要模塊(圖1C～1E)。

A：DEGs互作網(wǎng)絡(luò)；B：樞紐基因互作網(wǎng)絡(luò)；C：模塊1；D：模塊2；E：模塊3

2.3 功能富集分析

本研究通過DAVID在線平臺完成了GO功能和KEGG通路富集的分析。表1、2顯示了DEGs的前5位基因本體類別。在生物過程(BP)方面，上調(diào)的DEGs主要富集在 Ⅰ 型干擾素信號通路、對病毒的防御反應(yīng)；在分子功能(MF)方面，上調(diào)的DEGs主要涉及2′-5′-oligoadenylate合成酶活性、雙鏈RNA結(jié)合、轉(zhuǎn)移酶活性。此外，細胞成分(CC)分析顯示，它們與胞質(zhì)、線粒體有關(guān)。而KEGG途徑主要富集在甲型流感、麻疹、單純皰疹病毒感染和腸道免疫網(wǎng)絡(luò)中產(chǎn)生IgA(表3)。其中圖2A、2B給出了這些DEGs的GO和KEGG通路富集圖。為了更全面地了解這些DEGs，我們對前10位樞紐基因進行了GO功能和KEGG通路富集。有趣的是如表4、5、6所示，這些樞紐基因的BP和KEGG通路富集在Ⅰ型干擾素信號通路、對病毒的防御反應(yīng)、對病毒的反應(yīng)、甲型流感、麻疹、單純皰疹病毒感染等方面，與上調(diào)的DEGs和第1位模塊基因的結(jié)果基本一致。

表1 與ccRCC舒尼替尼耐藥相關(guān)上調(diào)表達基因GO分析Table 1 Gene ontology analysis of upregulated differentially expressed genes associated with sunitinib resistance

表2 與ccRCC舒尼替尼耐藥相關(guān)下調(diào)表達基因GO分析Table 2 Gene ontology analysis of downregulated differentially expressed genes associated with sunitinib resistance

表3 與ccRCC舒尼替尼耐藥相關(guān)差異表達基因KEGG分析Table 3 KEGG pathway analysis of differentially expressed genes associated with sunitinib resistance

A：上調(diào)DEGs的GO分析；B：下調(diào)DEGs的GO分析；C：DEGs的KEGG通路分析

表4 與ccRCC舒尼替尼耐藥相關(guān)樞紐基因GO分析Table 4 Gene ontology analysis of hub genes associated with ccRCC sunitinib resistance

表5 與ccRCC舒尼替尼耐藥相關(guān)的樞紐基因KEGG分析Table 5 KEGG pathway analysis of hub genes associated with ccRCC sunitinib resistance

表6 模塊1 KEGG通路分析Table 6 KEGG pathway analysis of top1 module

2.4 基因集富集分析

為深入了解GSE76068樣本中導(dǎo)致舒尼替尼耐藥的潛在生物學(xué)途徑和機制，我們進行了GSEA分析。根據(jù)截止標準FDR<0.25，P<0.05，顯示了12個功能基因組(圖3)。該結(jié)果表明，舒尼替尼耐藥組富集在胞質(zhì)DNA感知通路、Toll樣受體信號通路、RIG-I受體信號通路、干擾素信號通路、激活A(yù)TR應(yīng)對復(fù)制應(yīng)激、G2/M檢查點等。

Parental：舒尼替尼敏感組；Sunitinib-R：舒尼替尼耐藥組；以P<0.05且FDR<0.25為顯著富集

2.5 Kaplan-Meier生存分析

在Kaplan-Meier分析的基礎(chǔ)上，分析了樞紐基因的表達與ccRCC患者OS、DFS之間的關(guān)系。結(jié)果顯示，IL6(HR=2.360，log-rankP<0.01)、ISG15(HR=1.902，log-rankP<0.01)、OASL(HR=1.842，log-rankP<0.01)的高表達預(yù)示ccRCC患者更差的OS；IL6(HR=1.387，log-rankP=0.0463)、ISG15(HR=1.74，log-rankP=0.0052)、OASL(HR=2.195，log-rankP=0.0001)的高表達預(yù)示ccRCC患者更差的DFS(圖4、圖5)。而IFIT1的表達和更好的OS(HR=0.5598，log-rankP=0.0001)和DFS(HR=0.6368，log-rankP=0.0112)相關(guān)。

患者總生存期信息來自TCGA數(shù)據(jù)庫；A：IFIT1；B：IL6；C：ISG15；D：OASL

患者無病生存期信息來自TCGA數(shù)據(jù)庫；A：IFIT1；B：IL6；C：ISG15；D：OASL

2.6 樞紐基因的受試者工作特征(ROC)曲線分析

我們通過ROC曲線來評估樞紐基因是否具有潛在診斷價值。如圖6，所示基因可以完全區(qū)分ccRCC和配對的正常組織，曲線下面積(AUC)為0.7362～0.8914。此結(jié)果表明，這些樞紐基因可能是ccRCC患者的有效診斷生物標志物。

2.7 樞紐基因在ccRCC組織和正常腎組織中的表達

利用TCGA數(shù)據(jù)庫對ccRCC和正常組織中樞紐基因的表達水平進行評估。如圖6，與正常組織相比，其中部分基因如ISG15、IFIT3、OASL在ccRCC組織中的表達明顯上調(diào)?；贗SG15較好的診斷和預(yù)后價值，我們進一步研究了它和ccRCC患者臨床病理參數(shù)之間的相關(guān)性。

A～C：基因表達水平分析；D～F：基因表達ROC曲線分析；患者基因表達水平信息均來自TCGA數(shù)據(jù)庫；**P<0.01

2.8 ISG15的表達與ccRCC的各種臨床病理參數(shù)相關(guān)

對TCGA數(shù)據(jù)庫中534例包含較完整信息的ccRCC樣本數(shù)據(jù)(其中2例缺少T、N分期，4例缺少M分期，10例缺少G分級信息)分析顯示，ISG15 mRNA表達上調(diào)與較高的病理分期分級、遠處轉(zhuǎn)移有顯著的相關(guān)性(圖7)，ISG15的表達水平隨著腫瘤病理分期分級升高有增高的趨勢。患者臨床病理資料見表7，依據(jù)ISG15表達水平降序排列，取中位均分為ISG15高表達和低表達兩組。ISG15的高表達與這些臨床病理參數(shù)之間有顯著的相關(guān)性，與上述結(jié)果一致。

表7 ccRCC患者ISG15 mRNA表達水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 7 Association between ISG15 mRNA expression and clinicopathological parameters of patients with ccRCC

A：T分期；B：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移；C：遠處轉(zhuǎn)移；D：G分級；**P<0.01

為了進一步探討ISG15的預(yù)后價值，我們評估了其表達水平和患者各種臨床病理因素與OS相關(guān)性。單因素和多因素Cox比例風(fēng)險回歸分析表明，ISG15高表達是ccRCC患者OS的獨立風(fēng)險因素，可作為獨立預(yù)后指標(表8)。

表8 ISG15 mRNA表達水平與患者總生存期的單因素和多因素回歸分析Table 8 Univariate and multivariate analyses of ISG15 mRNA expression and patient overall survival

3 討論

ccRCC是最常見的腎癌亞型，酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)類靶向藥物，如舒尼替尼仍是進展期ccRCC治療的基石[2，8]。事實證明，由于個體差異及腫瘤異質(zhì)性等因素，不管放化療、靶向治療還是免疫治療，總存在著一部分患者先天不敏感或?qū)Τ掷m(xù)治療耐受。所以，研究ccRCC舒尼替尼耐藥的分子標志物和功能途徑對ccRCC患者的治療方式選擇及生存預(yù)后評估具有重要意義。本研究利用多種生物信息學(xué)工具發(fā)現(xiàn)了一組具有代表意義的分子標志物，有望成為診斷甚至治療靶點應(yīng)用于臨床，此外我們還分析了其中樞紐基因的診斷和預(yù)后價值，并探討了導(dǎo)致ccRCC舒尼替尼耐藥的潛在信號通路。

3.1 DNA感知器-Ⅰ型干擾素通路-IRDS軸可能導(dǎo)致ccRCC獲得性耐藥

到目前為止，已有大量文獻報道腎癌舒尼替尼耐藥相關(guān)機制，包括TKIs被溶酶體螯合、缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)等關(guān)鍵基因的突變和修飾、血管生成替代途徑(AKT/mTOR)的激活、腫瘤異質(zhì)性和微環(huán)境等，但仍缺乏共識[9]。

在本研究中，GSEA分析表明DNA損傷反應(yīng)相關(guān)基因集(激活A(yù)TR應(yīng)對復(fù)制應(yīng)激和G2/M檢查點)得到顯著富集。同時，根據(jù)GO/KEGG分析，我們發(fā)現(xiàn)生物過程(Ⅰ型干擾素信號通路、對病毒的防御反應(yīng))、信號通路(甲型流感、麻疹和單純皰疹病毒感染)和基因集(干擾素信號傳導(dǎo))均得到富集(圖2A、2B、3D)，最重要的是，GSEA結(jié)果表明胞質(zhì)DNA感知通路、Toll樣受體信號通路、RIG-I受體信號通路等經(jīng)典DNA感應(yīng)通路均被顯著富集。據(jù)此，我們認為腫瘤細胞通過靶向藥物治療，在復(fù)制應(yīng)激等因素下導(dǎo)致DNA損傷，DNA損傷產(chǎn)物被DNA感應(yīng)蛋白感知并激活了干擾素信號通路(如cGAS-STING信號通路)。

在過去的幾十年中，研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型干擾素(IFN-Ⅰ)來源于各種免疫細胞或腫瘤細胞，作為調(diào)節(jié)數(shù)百種下游細胞因子轉(zhuǎn)錄的強大免疫調(diào)節(jié)因子，參與腫瘤免疫、感染調(diào)控和組織損傷等過程。一般來說，IFN-Ⅰ和Ⅰ型干擾素途徑對抑制感染和殺傷腫瘤細胞尤為重要，因此在20多年前，大劑量干擾素被用于治療轉(zhuǎn)移性腎癌，但療效不甚理想，而且由于它的副作用使其并沒有被廣泛應(yīng)用。目前，一些臨床前試驗已經(jīng)證明了IFN-Ⅰ定向治療腫瘤的可取性，但更多的是需要與其他療法，如靶向治療、放化療和新型免疫療法聯(lián)合使用，才能取得更好的效果。然而，近期研究結(jié)果表明，Ⅰ型干擾素通路在腫瘤進展和獲得性耐藥中起著至關(guān)重要的作用，尤其是在長期和持續(xù)暴露于IFN-Ⅰ的情況下，干擾素相關(guān)DNA損傷抗性標志基因(IRDS)明顯上調(diào)并發(fā)揮促癌促耐藥作用[10-14]。例如JAK抑制劑Ruxolitinib可以克服非小細胞肺癌對順鉑的耐藥性[15]。此外，cGAS/RIG-I/TLR4等DNA感應(yīng)蛋白作為明星分子，在免疫調(diào)節(jié)途徑中對癌癥的進展和治療具有決定性的影響，但與Ⅰ型干擾素信號通路一樣，DNA感應(yīng)蛋白也具有兩面性。有研究表明，DNA感應(yīng)蛋白DDX41是腫瘤啟動因子同時也是放療的不良預(yù)后因子[16]；另一項研究調(diào)查了在基因毒藥物作用下，TLR4通路的激活和下游產(chǎn)物的上調(diào)保護了殘余腫瘤細胞，并促進了腫瘤的轉(zhuǎn)移[17]。

有趣的是本研究中我們篩選的大部分樞紐基因如ISG15、OASL、IFIT3在舒尼替尼耐藥樣本中上調(diào)，均屬于IRDS基因，且這個獨特的基因子集正是DNA感應(yīng)和Ⅰ型干擾素信號通路的下游基因。綜上所述，我們認為在舒尼替尼的作用下，ccRCC中細胞核酸的積累被DNA感應(yīng)蛋白所感知，并引發(fā)了Ⅰ型干擾素通路的激活，繼而導(dǎo)致IRDS的上調(diào)，促進了腫瘤獲得性耐藥。

3.2 IRDS是ccRCC獲得性耐藥的潛在分子標志

Ⅰ型干擾素啟動了數(shù)百個干擾素下游基因的表達，涉及抗病毒、抗腫瘤和抗炎功能[18]。越來越多的研究表明，在抗病毒反應(yīng)的第二階段，在持續(xù)低劑量IFNβ刺激下，未磷酸化的轉(zhuǎn)錄因子ISGF3(U-ISGF3)高表達，該轉(zhuǎn)錄因子進一步介導(dǎo)一個特殊的干擾素刺激基因子集(ISGs)上調(diào)，發(fā)揮抵抗DNA損傷和延長抗病毒效果的作用[7，12，19-22]。耐人尋味的是，正是該基因子集中的一部分驅(qū)動了放化療的獲得性耐受，并被統(tǒng)稱為干擾素相關(guān)DNA損傷耐藥基因(IRDS)，且已經(jīng)作為預(yù)測乳腺癌、頭頸部腫瘤等惡性腫瘤的放化療預(yù)后因子應(yīng)用于臨床[7，10，12，23]。

到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了49個以上的基因?qū)儆贗RDS基因。從我們富集的生物信息學(xué)結(jié)果來看，IRDS基因在舒尼替尼耐藥組中顯著上調(diào)。如前所述，越來越多的證據(jù)表明，細胞DNA損傷產(chǎn)物被cGAS/RIG-I/TLR4等感應(yīng)蛋白感知，然后激活干擾素通路，促進IRDS的表達[14，24-26]。隨后，該軸的激活所引發(fā)的IRDS上調(diào)通過DNA損傷修復(fù)和其他分子機制促進了腫瘤的生存[13，27]。因此我們有理由相信該過程同時促進了ccRCC的獲得性耐藥，但還需要更多的實驗證據(jù)。我們的研究為IRDS基因ISG15、OASL、IFIT3可作為腎癌獲得性耐藥的有效分子標志物及預(yù)后指標提供了線索。

3.3 ISG15是ccRCC潛在的診斷和預(yù)后標志物

ISG15，即干擾素刺激基因15，1987年作為泛素樣蛋白(Ubls)被發(fā)現(xiàn)，在各種細胞活動如穩(wěn)定蛋白、調(diào)節(jié)細胞周期、應(yīng)激反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮了重要作用，類似于泛素化，其與蛋白結(jié)合的方式被稱為ISGylation，是未被充分開發(fā)的翻譯后蛋白修飾途徑(PTMs)之一。幾十年來，對ISG15的研究一直集中在抗病毒復(fù)制方面。直到最近，研究人員發(fā)現(xiàn)ISG15在乳腺癌、前列腺癌和胰腺癌等腫瘤發(fā)病、進展和耐藥中發(fā)揮了重要作用[7，13，28-30]。本研究首次探討了ISG15在ccRCC中的表達和臨床病理參數(shù)之間的聯(lián)系。我們發(fā)現(xiàn)，與正常腎組織相比，ISG15在ccRCC組織中表達上調(diào)，并與ccRCC患者的不良預(yù)后相關(guān)；多變量回歸分析表明，ISG15表達水平是ccRCC的獨立預(yù)后因素?；诖?，我們認為ISG15能作為一個潛在的分子標志物用于ccRCC患者的診斷和預(yù)后判斷。