張少華， 張彥芳， 曹 萌， 李 燕， 廖立夏， 王貝貝

1河南省南陽市第一人民醫(yī)院兒一科，南陽 4730002新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院內(nèi)分泌二病區(qū)，新鄉(xiāng) 453100

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是2型糖尿病的并發(fā)癥之一，是終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)的主要病因，具有較高的致死率，且缺乏有效診斷指標(biāo)[1]。姜黃素(curcumin，Cur)是提取自姜黃根狀莖的主要活性成分。Cur具有抗腫瘤[2]、抗氧化[3]、抗炎[3]、降脂和降血糖的作用[4]。相關(guān)研究表明Cur對神經(jīng)根疼痛[5]、腎病[3]、視網(wǎng)膜病變[6]、血管疾病[7]和胰腺疾病[8]均具有一定的治療作用。TGF-β1/p38MAPK信號減弱被認(rèn)為是抑制DN的途徑之一[9]，且研究表明TGF-β1/p38MAPK信號激活可誘導(dǎo)急性腎損傷和腎纖維化，由此推測，抑制該通路可能是治療DN的有效策略。Cur對DN的改善作用已有報道[10]，但Cur是否通過負(fù)調(diào)控TGF-β1/p38MAPK信號從而減輕DN腎損傷還未見報道。本文旨在進(jìn)一步研究Cur改善DN的分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

Cur購自美國Selleck公司，分子量368.38，純度99.83%。蘇木精-伊紅(HE)染色液、RIPA裂解液及BCA試劑盒購自北京索萊寶生物科技公司。尿蛋白、血尿酸(uric acid)、血肌酐(serum creatinine，Scr)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。TUNEL試劑盒購自瑞士羅氏生物公司。Collagen Ⅳ、fibronectin、TGF-β1、cleaved Caspase-3、p38MAPK一抗均購自英國Abcam公司，免疫組化用TGF-β一抗購自美國賽默飛世爾公司。

1.2 實驗動物分組及處理

30只6～8周齡健康清潔級雄性C57BLKS/J小鼠(db/m)，體質(zhì)量20～30 g，另外30只相同周齡糖尿病(db/db)小鼠，體質(zhì)量35～45 g，購自北京維通利華實驗動物公司。實驗小鼠飼養(yǎng)在醫(yī)院實驗中心動物房。所有小鼠均自由進(jìn)食，光暗循環(huán)12/12 h，室溫25～27 ℃，濕度60%。將正常小鼠作為對照組(db/m組)；將糖尿病(db/db)小鼠分為模型組(db/db組)和姜黃素組(db/db+Cur組)。姜黃素組小鼠灌胃給予200 mg/kg·d的Cur，對照組和模型組小鼠灌胃給予等量生理鹽水。連續(xù)給藥12周后進(jìn)行相應(yīng)檢測。

1.3 樣品準(zhǔn)備

給藥12周后，用代謝籠收集實驗小鼠的24 h尿液，麻醉小鼠，取血，收集血清，嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定Scr、尿酸和尿蛋白濃度。隨后打開腹腔，摘取一側(cè)腎臟，以4%中性多聚甲醛固定，石蠟包埋，制作4 μm厚度的切片；取另一側(cè)腎臟稱重，剪成小塊并加入液氮研磨成粉末，立即用RIPA溶液提取蛋白，待用。

1.4 組織切片蘇木精-伊紅(HE)染色

腎臟石蠟切片以二甲苯脫蠟，每次5 min；梯度乙醇水化，每次3 min；二甲苯進(jìn)行脫蠟、水化，根據(jù)HE染色液說明書對切片進(jìn)行染色，在顯微鏡下觀察腎臟組織并拍照。

1.5 TUNEL檢測細(xì)胞凋亡情況

取腎臟石蠟切片進(jìn)行脫蠟、水化，以Proteinase K工作液在25℃消化組織15 min，PBS漂洗，按照說明書對切片進(jìn)行TUNEL染色，顯微鏡下觀察并計算細(xì)胞凋亡率。200倍光鏡下計數(shù)凋亡細(xì)胞(棕黃色)，每組選取互不連接的10個視野計算細(xì)胞凋亡率，細(xì)胞凋亡率(%)=(TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.6 免疫組化檢測腎臟組織TGF-β的表達(dá)

取石蠟切片進(jìn)行脫蠟、水化后高壓抗原熱修復(fù)。切片經(jīng)過封閉后進(jìn)行以TGF-β抗體(1∶100)在4 ℃孵育過夜，洗滌后以二抗在37℃孵育1 h，洗滌后DAB顯色。TGF-β陽性表達(dá)為細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)中出現(xiàn)深棕色的顆粒，顯微鏡下每張切片隨機選取5個視野并攝像保存，采用Image Pro Plus軟件設(shè)置陽性表達(dá)的宏程序，在同一條件下，分析不同組別的TGF-β表達(dá)量。

1.7 氧化應(yīng)激標(biāo)志物檢測

取新鮮腎臟組織根據(jù)試劑盒說明書測定腎組織MDA、SOD和LDH的濃度。

1.8 免疫印跡法檢測蛋白表達(dá)

提取的腎臟組織蛋白定量后以12% SDS-PAGE電泳，PVDF膜轉(zhuǎn)移，TBST漂洗2次，室溫條件下于5%脫脂奶粉中封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜。次日，TBST漂洗膜3次，加入二抗，室溫下孵育2 h，滴加ECL化學(xué)發(fā)光液，顯像分析。以GAPDH作為內(nèi)參。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 5軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Cur改善db/db小鼠腎臟功能及腎臟病理損傷

如圖1所示，與對照組比較，模型組小鼠尿蛋白含量、血尿酸和血肌酐濃度顯著升高(均P<0.01)；與模型組比較，姜黃素組小鼠尿蛋白含量、血尿酸和血肌酐濃度顯著降低(均P<0.01)。此外，如圖2A所示，與對照組比較，模型組腎小球體積增大，腎小管上皮細(xì)胞水腫、脫落，系膜區(qū)增寬，系膜細(xì)胞增生；與模型組比較，姜黃素組腎小管上皮細(xì)胞趨于正常，腎小球和系膜細(xì)胞相對減少。HE染色表明Cur能改善db/db小鼠腎臟病理損傷。

1：對照組；2：模型組；3：姜黃素組；與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

2.2 Cur減少db/db小鼠腎臟細(xì)胞凋亡

TUNEL染色(圖2B)顯示，與對照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率(棕色陽性細(xì)胞比率)明顯上升(P<0.01)，而Cur治療后，姜黃素組細(xì)胞凋亡率明顯下降(P<0.01)。Western blot結(jié)果如圖2C，模型組cleaved Caspase-3表達(dá)明顯上調(diào)，而姜黃素組cleaved Caspase-3表達(dá)顯著下降。

A：HE染色檢測腎組織病理損傷；B：TUNEL染色檢測細(xì)胞凋亡；C：Western blot檢測cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平；1：對照組；2：模型組；3：姜黃素組；與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

2.3 Cur減弱db/db小鼠腎纖維化

TGF-β免疫組化結(jié)果(圖3A)顯示，與對照組相比，模型組TGF-β表達(dá)陽性細(xì)胞明顯增多(P<0.01)，Cur顯著下調(diào)姜黃素組小鼠腎臟組織TGF-β表達(dá)(P<0.01)。Collagen Ⅳ和fibronectin在模型組小鼠腎臟中表達(dá)升高，而Cur可顯著抑制姜黃素組此兩種蛋白的表達(dá)(圖3B)。

A：免疫組化檢測腎臟組織TGF-β表達(dá)；B：Western blot檢測Collagen Ⅳ和fibronectin蛋白表達(dá)水平；1：對照組；2：模型組；3：姜黃素組；與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

2.4 Cur減弱db/db小鼠氧化應(yīng)激損傷

如圖4所示，與對照組比較，模型組腎臟組織中LDH和MDA水平明顯升高，SOD水平顯著下降(均P<0.01)；Cur顯著降低姜黃素組小鼠腎臟組織中LDH和MDA水平，增加SOD水平(均P<0.01)。

1：對照組；2：模型組；3：姜黃素組；與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

2.5 Cur抑制db/db小鼠TGF-β1/p38MAPK信號

如圖5所示，在模型組小鼠腎臟組織中，p38MAPK磷酸化水平和TGF-β1表達(dá)水平明顯升高，Cur可減少p38MAPK磷酸化水平和TGF-β1表達(dá)水平，說明Cur抑制db/db小鼠腎臟組織中TGF-β1/p38MAPK信號。

1：對照組；2：模型組；3：姜黃素組；與對照組比較，**P<0.01；與模型組比較，##P<0.01

3 討論

DN是糖尿病的一種慢性并發(fā)癥，其特點是腎小球系膜的擴張和細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)蛋白的過度積累，以及血流動力學(xué)的改變[11]。已有研究表明Cur具有腎保護和改善DN的功效。例如，Lu等[12-13]報告了Cur可以抑制炎性小體NLRP3從而減輕DN；Kim等[10]的研究表明Cur能抑制2型糖尿病大鼠氧化應(yīng)激并調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。本研究中db/db小鼠腎小管出現(xiàn)蛋白積累，并出現(xiàn)明顯的病理損傷，結(jié)合腎功標(biāo)志物檢測說明db/db小鼠產(chǎn)生了腎損傷，腎功能減弱,db/db小鼠可以作為DN疾病模型。研究表明，抑制細(xì)胞外基質(zhì)的堆積可減緩腎纖維化進(jìn)程[11]。本研究中Cur治療后db/db小鼠腎組織Collagen Ⅳ和fibronectin表達(dá)水平顯著降低，說明Cur可改善DN腎纖維化。且腎功標(biāo)志物和細(xì)胞凋亡率明顯降低，與上述文獻(xiàn)一致，說明Cur可改善DN腎損傷。

在糖尿病條件下，高血糖可引起ROS的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化，從而引發(fā)DN[14]。本研究發(fā)現(xiàn)Cur增加了組織SOD，同時降低了脂質(zhì)過氧化物指標(biāo)MDA含量。我們推測Cur可能通過抗氧化和凋亡減輕DN小鼠腎損傷。

p38MAPK通路在DN發(fā)生發(fā)展過程中可被多種應(yīng)激因子激活，如高血糖[14]、血流動力學(xué)異常、氧化應(yīng)激和促炎細(xì)胞因子[9]。p-p38作為p38MAPK通路中的關(guān)鍵信號分子，其表達(dá)增強是該信號通路激活的標(biāo)志之一[15-16]。TGF-β1是成纖維細(xì)胞的趨化誘導(dǎo)因子，在DN中可促ECM(如fibronectin)產(chǎn)生[17]。p38MAPK的激活促進(jìn)人類DN的惡化，并促進(jìn)TGF-β1表達(dá)[18]。既往對DN患者及DN動物實驗?zāi)Ｐ偷难芯勘砻?，糖尿病和高糖環(huán)境可引起p38MAPK信號通路的激活[19]。陳亞利等[20]研究發(fā)現(xiàn)Cur可通過下調(diào)高尿酸血癥大鼠腎臟組織中TGF-β1的表達(dá)而發(fā)揮腎臟保護作用。董墨妍等[21]研究發(fā)現(xiàn)Cur通過抑制p38MAPK信號通路的磷酸化對DN具有治療作用。與上述文獻(xiàn)一致，本文研究表明db/db小鼠中p-p38和TGF-β1表達(dá)增加，同時Cur可抑制p-p38和TGF-β1表達(dá)，提示Cur可抑制TGF-β1/p38MAPK信號激活，進(jìn)而減輕db/db小鼠DN腎損傷。

綜上所述，Cur可減弱DN db/db小鼠腎損傷和腎纖維化，其機制可能是減少氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡；且其分子機制可能與TGF-β1/p38MAPK信號通路的抑制有關(guān)。