（遼寧省食品檢驗檢測院（遼寧省鹽品質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心），遼寧 沈陽 110015）

糖是人體所需能量最主要的來源，也是嬰幼兒生長發(fā)育的必需品之一。嬰幼兒配方奶粉是參照母乳的組成成分，以乳類和乳蛋白制品為原料配制而成的，含有豐富的營養(yǎng)成分，單糖和功能性低聚糖也是其重要組成成分。目前糖類物質(zhì)的分析主要有3類方法：化學(xué)法、色譜法和酶學(xué)法[1-9]。離子色譜法結(jié)合金電極脈沖安培檢測是目前糖類物質(zhì)分離和定量分析的理想方法，該方法靈敏度高，穩(wěn)定性好，樣品無需復(fù)雜的樣品前處理，操作簡便迅速，能同時測定多種離子。為此，本研究建立對葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖4種單糖和棉子糖、水蘇糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、蔗果八糖、蔗果九糖9種功能性低聚糖的同時檢測離子色譜法，并對市售樣品進(jìn)行測定。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ICS-5000離子色譜儀（美國戴安），配備脈沖安培檢測器，金工作電極和銀/氯化銀參比電極；CarboPacTMPA20型分析柱（3 mm×150 mm，美國戴安）；CarboPacTMPA20保護(hù)柱（3 mm×50 mm，美國戴安）； X1R高速冷凍離心機（美國熱電公司）；Milli-Q A10純水機（美國Millipore公司）.

1.2 材料

葡萄糖對照品（中國計量研究院，含量99.6 %）；果糖對照品（中國計量研究院，含量99.7 %）；蔗糖對照品（中國計量研究院，含量99.7 %）；棉子糖對照品（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH，99.5%）；水蘇糖對照品（Sigma，含量98.0 %）；麥芽糖對照品（德國Dr.Ehrenstorfer GmbH，含量99.5 %）；蔗果三糖，蔗果四糖，蔗果五糖，蔗果六糖，蔗果七糖，蔗果八糖，蔗果九糖對照品（成都瑞芬斯生物科技有限公司，純度＞98 %）；NaOH（美國賽默飛，色譜級）；乙酸鈉（美國賽默飛，色譜級)；試驗用水為一級水；嬰幼兒配方奶粉（市售）。

2 方法

2.1 對照品溶液的配制

分別精密稱取葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、棉子糖、水蘇糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖、蔗果七糖、蔗果八糖和蔗果九糖對照品適量, 用超純水稀釋至刻度，搖勻，制成濃度均為1.0 mg/ml的混合對照品儲備液，4 ℃保存。將上述儲備液用超純水稀釋為10 mg/L的混合對照品中間液。用時臨用現(xiàn)配。

2.2 淋洗液的配制

流動相B：取50 %氫氧化鈉溶液6.5 ml，用水稀釋定容至500 ml，在氮氣保護(hù)下?lián)u勻，配制成250 mmol/L氫氧化鈉淋洗溶液。

流動相C：稱取20.5 g無水乙酸鈉，用水溶解并定容至500 ml，在氮氣保護(hù)下?lián)u勻，配制成500 mmol/L乙酸鈉淋洗溶液。

2.3 樣品處理

取試樣0.5 g，精密稱定，置入20 ml量瓶，加入16 ml 60 ℃溫水溶解，渦旋2 min，超聲20 min，加入3 %乙酸溶液0.4 ml，取出，放置至室溫，加水定容至刻度，搖勻，于4 ℃、8000 r/min離心3 min。取上清0.2 ml，加水稀釋至10 ml，搖勻，過0.22 μm濾膜和RP柱，續(xù)濾液供色譜分析備用。

2.4 色譜條件

色譜柱：CarboPacTMPA20（3 mm×150 mm）分析柱，CarboPacTMPA20（3 mm×50 mm）保護(hù)柱；柱溫：30 ℃；梯度洗脫，程序見表1。檢測方式：脈沖安培法檢測，金電極，銀/氯化銀參比電極；糖標(biāo)準(zhǔn)四電位波形見表2。進(jìn)樣量：25 μl。

表1 淋洗液洗脫程序

表2 糖標(biāo)準(zhǔn)四電位波形

3 結(jié)果與分析

3.1 離子色譜淋洗液選擇

采用離子色譜分析糖類物質(zhì)，單糖測定通過調(diào)節(jié)不同濃度氫氧化鈉淋洗液達(dá)到較好分離效果。功能性低聚糖測定采用氫氧化鈉和乙酸鈉溶液進(jìn)行梯度洗脫，乙酸鈉可增強洗脫效果，改善功能性低聚糖的分離度，縮短分析時間，提高靈敏度。綜合考慮單糖和功能性低聚糖靈敏度、峰形及分析時間，通過實驗確定梯度洗脫條件見表1。

3.2 色譜柱選擇

本試驗采用CarboPacTMPA20色譜柱對4種單糖和9種功能性低聚糖進(jìn)行分離，效果較好。采用PA10、PA1色譜柱對單糖和功能性低聚糖進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，單糖分離效果沒有太大變化，但各低聚糖的保留時間明顯延長，蔗果三糖～蔗果九糖色譜峰均出現(xiàn)拖尾。與PA20色譜柱相比，PA1、PA10色譜柱粒徑稍大，柱效明顯低于PA20，故選擇PA20色譜柱作為分析柱。單糖和功能性低聚糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖見圖1。

圖1 單糖和功能性低聚糖對照品溶液的離子色譜圖

由圖1可見，在優(yōu)化的梯度洗脫條件下，采用CarboPacTMPA20色譜柱實現(xiàn)了4個單糖和9個功能性低聚糖的基線分離。

3.3 樣品前處理沉淀試劑選擇

糖極易溶于水，故采用水作為提取溶劑，為了沉淀奶粉中的蛋白質(zhì)，需在提取溶劑中加入一定比例沉淀試劑。依據(jù)參考文獻(xiàn)，本實驗先后選用亞鐵氰化鉀和乙酸鋅蛋白、乙腈、3 %乙酸作為沉淀試劑。采用乙腈、亞鐵氰化鉀和乙酸鋅蛋白沉淀試劑，提取效果不好，樣品回收率低，因此選用3 %乙酸作為沉淀試劑，考察加入不同體積的3 %乙酸，結(jié)果顯示水-3 %乙酸體積比為5:1時樣品提取完全，提取效果滿意。

3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限結(jié)果

按2.1項方法配制5個水平的混合對照品溶液，并在優(yōu)化的色譜條件下進(jìn)行檢測。以目標(biāo)化合物的峰面積電信號（y）作為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（x，mg/L）為橫坐標(biāo)繪制曲線，見表3。4個單糖線性范圍為0.1～5 mg/L，9個功能性低聚糖的線性范圍為0.2～10 mg/L，相關(guān)系數(shù)r均大于0.996，線性關(guān)系良好，檢出限為2 mg/100 g。

表3 標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限結(jié)果

3.5 回收率和精密度

向空白樣品中添加4種單糖和9中功能性低聚糖對照品儲備液，制備含量分別為10，25，50 mg/100 g的加標(biāo)樣品，按2.3項處理方法及2.4項測定條件進(jìn)行回收率試驗，每個添加水平平行測定，結(jié)果見表4。各化合物的平均回收率為82.0 %～106.1 %，RSD為2.7 %～8.9 %。

表4 回收率試驗結(jié)果

3.6 實際樣品檢測

采用本試驗建立的離子色譜方法，對市場上銷售的不同品牌的嬰幼兒奶粉中的糖含量進(jìn)行了檢測。10批次嬰幼兒配方奶粉樣品中功能性低聚糖含量約在400～600 mg/100 g范圍內(nèi)。

試驗結(jié)果顯示，目前市場上銷售的嬰幼兒配方奶粉中檢出棉子糖、水蘇糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖、蔗果六糖等功能性低聚糖，蔗果七糖及以上低聚糖在少數(shù)奶粉品牌中有檢出，這可能跟原料的工藝有關(guān)，進(jìn)而導(dǎo)致加到奶粉中的蔗果七糖及以上的低聚糖含量較低。

4 討論

本試驗通過采用離子色譜-金電極脈沖安培法，選用靈敏度高的CarboPacTMPA20色譜柱，建立快速定量檢測樣品中單糖、棉子糖、水蘇糖和功能性低聚果糖含量的方法。通過對樣品前處理條件和離子色譜參數(shù)優(yōu)化，實現(xiàn)了4種單糖和9種功能性低聚糖的同時分離檢測。該方法適用于嬰幼兒配方奶粉中單糖及低聚糖的檢測，具有較高的應(yīng)用價值。