◆作者：亓秀曄 劉乃芝 郭楊麗 徐海燕 程福亮 谷 巍

◆單位：山東寶來利來生物工程股份有限公司山東省動物微生態(tài)制劑省級重點實驗室

飼用抗生素作為促生長劑在飼料中被長期添加，造成了畜禽產(chǎn)品的藥物殘留、耐藥菌株的出現(xiàn)和環(huán)境污染等問題。我國農(nóng)業(yè)部2292 號文件的頒布，明確提出2020 年7 月1 號將全面禁止飼用抗生素的添加，讓畜牧養(yǎng)殖業(yè)如何有效提高畜禽抵抗力，促進畜禽的生產(chǎn)性能成為最緊迫的問題。益生菌發(fā)酵飼料是改變當前養(yǎng)殖狀況極具潛力的解決方案之一。益生菌發(fā)酵飼料能減少原料中抗營養(yǎng)因子，產(chǎn)生有益代謝產(chǎn)物和可溶性多肽等小分子物質(zhì)，從而提高飼料營養(yǎng)水平，起到促生長和提高免疫功能的作用?！讹暳咸砑觿┢贩N目錄（2013）》（農(nóng)業(yè)部公告第 2045號）中允許添加的微生物菌種共33種，其中芽孢桿菌有6 種，包括：地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌和側(cè)孢短芽孢桿菌。

芽孢桿菌可以在不利的條件下形成芽孢，適應(yīng)高溫、酸堿性較強的環(huán)境，培養(yǎng)周期短、代謝產(chǎn)物豐厚，在發(fā)酵工業(yè)具有重大的應(yīng)用前景。目前，許多學(xué)者嘗試從自然界中的土壤、水體、腐殖質(zhì)、動物糞便、腸道內(nèi)容物等環(huán)境中分離篩選芽孢菌，在飼料發(fā)酵業(yè)均具有顯著效果。本文從健康的雞、鴨、鵝、馬、牛、羊糞便及周邊土壤中分離出12 株芽孢桿菌，并通過產(chǎn)酶活性篩選出6 株產(chǎn)α- 淀粉酶的芽孢桿菌，通過形態(tài)學(xué)分析、生理生化分析及分子鑒定，確定產(chǎn)酶性能最優(yōu)的1 株芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），這為后續(xù)飼料添加劑的應(yīng)用提供重要的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集6 種動物糞便及周邊土壤，包括健康的雞、鴨、鵝、馬、牛和羊。多點采集，樣品釆集于滅菌的試管中冷藏備用，并迅速分離。

LB 液體培養(yǎng)基：葡萄糖0.2%、蛋白胨1.0%、氯化鈉0.5%、酵母膏0.5%，均為質(zhì)量百分數(shù)，pH 值 7.0，121 ℃滅菌 20 min。LB 固體培養(yǎng)基需加1.5%的營養(yǎng)瓊脂。

淀粉瓊脂平板：可溶性淀粉0.1%、蛋白胨0.5%、葡萄糖0.5%、NaCl 0.5%、牛肉膏0.5%、瓊脂 0.8%，pH7.0±0.2，121℃滅菌20min。

1.2 方法

1.2.1 芽孢桿菌的分離和增殖培養(yǎng)

稱取1.00 g 樣品加入裝有100 mL 帶有玻璃珠的0.9%的生理鹽水的三角瓶中，37℃下，180 rpm/min 充分振蕩20 min，使樣品充分打散，靜置10 min。采用10 倍梯度稀釋法將上清液制成10-4、10-5、10-6、10-7稀釋液，分別取 0.20 mL 涂布于裝有 15～20 mL 的LB 固體培養(yǎng)基平板中。37℃培養(yǎng)24h。

挑取LB 固體培養(yǎng)基平板上長出的單菌落進行鏡檢，對符合芽孢桿菌特征的單菌落劃線、接種到新鮮的LB 固體培養(yǎng)基平板上，繼續(xù)培養(yǎng)并挑取單菌落劃線，直到獲取形態(tài)基本一致的單菌落。將單菌落進行斜面保存。

1.2.2 初篩- 產(chǎn)α- 淀粉酶活力測定

取一環(huán)斜面菌株，接種于LB 液體培養(yǎng)基中，取各菌株相同時間點的相同OD 量的種子液滴加到淀粉平板，37℃培養(yǎng)24h，在其表面覆蓋一層碘液（5 mMI2 和 5 mMKI），再觀察并測定產(chǎn)生透明圈的直徑。

1.2.3 復(fù)篩 -α- 淀粉酶活力的測定

將初篩菌株接種于裝有LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24h 即得到種子液，將種子液以3%的接種量接種于新鮮的LB 液體培養(yǎng)基中中，37 ℃培養(yǎng)24h，將發(fā)酵液 4 000 r/min 離心 20 min，收集上清液，即為粗酶液，分別測定總酶活和α- 淀粉酶酶活。

測定方法：3，5- 二硝基水楊酸比色法。

本研究條件下的酶活力單位定義為 40℃、pH5.6 時，1 min從2%的可溶性淀粉中釋放出1 μmol 麥芽糖所需的酶量為一個酶活力單位（U）。

計算公式：

式中：U 為 α- 淀粉酶活力，U/mL；W 為產(chǎn)生的麥芽糖量，mg；S 為樣品測試量，本試驗采用1mL；5 為反應(yīng)時間；360.31為麥芽糖分子量，g/mol。

1.2.4 菌種鑒定

1.2.4.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將LB 固體培養(yǎng)基上的純培養(yǎng)物革蘭氏染色鏡檢，觀察菌落形態(tài)。初步確定為地衣芽孢桿菌。

1.2.4.2 屬及群的初步鑒定

對符合群特征的菌株進行進一步的生理生化鑒定，方法參考按《伯杰氏細菌鑒定手冊》和《細菌屬的鑒定指導(dǎo)》。并用“API 50 CHB（地衣芽孢桿菌鑒定方法）”進行菌種檢測。

1.2.4.3 分子生物學(xué)鑒定

將目的菌株接種于LB 固體培養(yǎng)基平板中培養(yǎng)24 h，采用天根生化科技有限公司的試劑盒提取菌體DNA，并對其進行16 S rDNA 序列擴增。所用引物為通用引物：

1492r：5，-ggttaccttgttacgactt-3，；

27f：5，-agagttgatcctggctcag-3，。

PCR 反應(yīng)體系（50 μL）為：Mixture 25μL（含 Taq DNA 聚合酶及dNTP 等，天根生化科技有限公司），上下游引物各1 μL，模板 DNA 2 μL，超純水 21 μL。PCR 擴增程序為 94 ℃預(yù)變性 5 min，94 ℃變性 1 min，52 ℃退火 1 min，72 ℃延伸 2 min，25個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物送北京博尚生物技術(shù)有限公司進行序列測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel 軟件進行初步處理后，采用SPSS 13.0 進行統(tǒng)計分析，采用 One-way ANOVA 進行方差分析，LSD 法進行組間多重比較，結(jié)果以“平均值±標準差”表示，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌的篩選

在6 份樣品中經(jīng)革蘭氏染色鏡檢后，從中分離出Bacillus4、Bacillus6、Bacillus13、Bacillus14、Bacillus17、Bacillus19、Baci llus20、Bacillus23、Bacillus26、Bac illus27、Bacillus28、Bacillus28 共12 株芽孢桿菌。

2.2 初篩- 產(chǎn)淀粉酶活力測定

由產(chǎn)淀粉酶透明圈的大小初步判定6 株芽孢菌菌株產(chǎn)淀粉酶能力的大小順序為 Bacillus6>Bacillus23>Bacillus28>Baci llus14 ＞Bacillus20 ＞Bacillus17。后續(xù)對這6 株菌進行α- 淀粉酶活力測定。

表1 12 株芽孢菌產(chǎn)淀粉酶活力抑菌圈大?。╩m）比較

表2 6 株芽孢菌產(chǎn)淀粉酶活力（（U/mL））測定

表3 Bacillus6 生理生化特征

2.3 復(fù)篩α- 淀粉酶活力的測定結(jié)果

由酶活力測定結(jié)果可知，6株芽孢菌菌株產(chǎn)總淀粉酶能力的大小順序為：Bacillus6>Bacillus17>Bacillus20>Bacillus28 ＞Bacillus14 ＞Bacillus23，產(chǎn) α-淀粉酶能力的大小順序為：Bacillus6>Bacillus23>Bacillus14>Bacillus28 ＞Bacillus17 ＞Bacillus20。由此可知，Bacillus6 是產(chǎn)總淀粉酶和α- 淀粉酶活性最高的菌株，后續(xù)對Bacillus6 進行菌種鑒定。

2.4 Bacillus6 菌種形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定結(jié)果

形態(tài)特征：Bacillus6 為革蘭氏陽性桿狀，無莢膜、不成鏈，芽孢橢圓形，中生或次端生，LB 固體平板上菌落粗糙、不透明，粘著、擴展。隨后進行生理生化試驗，發(fā)現(xiàn)Bacillus6 能分解乳糖、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖（厭氧）、果糖、淀粉、木糖、阿拉伯糖、酪素，產(chǎn)生VP 反應(yīng)，不能分解松三糖，使明膠液化，還原石蕊，牛乳早期凝固、反應(yīng)劇烈；后期凝塊碎裂、不消化，不能利用檸檬酸鹽和丙酸鹽（見表3）。符合地衣芽孢桿菌的生理生化特性。

2.5 Bacillus6 分子學(xué)鑒定結(jié)果

菌株 Bacillus6 的 16S rDNA PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，在分子量大小為1500 bp 左右得到一條特異性好的條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，并進行測序。將測序序列與NCBI 網(wǎng)站上已登錄的部分菌株的16S rDNA 基因序列進行比對，結(jié)果表明，菌株Bacillus6 與已報道的Bacillus licheniformis（MT279447.1、Y16671.1、MB431 049.1、MB431047.1、MB431045.1、MB013996.1 和 GQ899144.1 的等）的序列同源性為99%以上。鑒定Bacillus6 菌株屬于地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。

3 結(jié)論與討論

禁抗時代的到來，微生物發(fā)酵飼料已是大勢所趨，因此不斷豐富菌種庫對畜牧業(yè)的發(fā)展至關(guān)重要。由于微生物有很多的變異特性，在生產(chǎn)和保藏過程中，菌種會發(fā)生變異，使原來的菌種性能發(fā)生變化，引起衰退甚至染菌，因此，不斷分離純化高產(chǎn)淀粉酶菌株對于生產(chǎn)是非常必要的。地衣芽孢桿菌是常用工業(yè)微生物生產(chǎn)菌種，在紙漿發(fā)酵、高溫淀粉酶生產(chǎn)、蛋白酶生產(chǎn)和氨基酸生產(chǎn)等領(lǐng)域發(fā)揮重要的作用。地衣芽孢桿菌相關(guān)的功能基因如纖維素酶、蛋白酶、α- 淀粉酶、谷氨酸脫氫酶等都得到了克隆表達。由于地衣芽孢桿菌安全性高、生長快速以及抗逆能力強等特點，所以被廣泛用于動物飼料添加劑和酶制劑行業(yè)。

本文從健康的雞、鴨、鵝、馬、牛、羊糞便及周邊土壤中分離出12 株芽孢桿菌，并通過產(chǎn)酶活性篩選出6 株產(chǎn)α- 淀粉酶的芽孢桿菌，通過形態(tài)學(xué)分析、生理生化分析及分子鑒定，確定產(chǎn)酶性能最優(yōu)的1 株芽孢桿菌Bacillus6 為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），這為后續(xù)飼料添加劑的應(yīng)用提供重要的理論基礎(chǔ)。

參考文獻:（略）