梅繼林，田秀燕，孫忠人

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040; 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001)

脊髓損傷(ASCI)是臨床常見的突發(fā)機(jī)械性損傷導(dǎo)致不可逆的運(yùn)動(dòng)、感覺和自主神經(jīng)功能損傷，給患者和家庭以及社會(huì)帶來巨大的壓力和負(fù)擔(dān)。脊髓損傷目前是無法治愈的，最大限度的減少脊髓損傷后繼發(fā)性并發(fā)癥和增加殘余功能是臨床治療重點(diǎn)[1-3]?，F(xiàn)有的臨床研究數(shù)據(jù)表明，電針夾脊穴對(duì)脊髓損傷有顯著療效[4-7]。P2X7R是一種ATP門控型離子通道，參與了細(xì)胞的多種病理生理過程[8-9]；NLRP3是當(dāng)前研究中分析最透徹的Nod樣受體家族成員，也是NLRP3炎癥小體的受體蛋白[10]。細(xì)胞外ATP和P2X7R相結(jié)合產(chǎn)生寡聚化反應(yīng)，使離子通道開放，進(jìn)而激活NLRP3炎癥復(fù)合體[11-12]。發(fā)生急性脊髓損傷后，大量的ATP通過損傷細(xì)胞作為趨化信號(hào)，致使P2X7R表達(dá)增加，NLRP3各組分表達(dá)測(cè)量結(jié)果升高，從而加重脊髓組織神經(jīng)損傷[13]。綜上，在治療脊髓損傷過程中，核心思想是抑制NLRP3炎癥小體活化和降低P2X7R表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)選擇夾脊電針治療急性脊髓損傷大鼠，通過觀察治療后P2X7R、NLRP3等蛋白和基因表達(dá)的演化，以期獲得相關(guān)治療機(jī)制，為急性脊髓損傷的康復(fù)治療提供合理的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和理論支持。

1 材料

1.1 儀器與試劑

1.1.1 儀器 熒光定量PCR儀(Exicycler 96，韓國(guó))；離心機(jī)(H-2050R，長(zhǎng)沙，中國(guó))；電泳儀(DYY-7C，北京)；電針治療儀(KWD-808-Ⅱ型，英迪，中國(guó))；針灸針(0.35 mm×13 mm華佗，中國(guó))；鏡拍照系統(tǒng)(OLUMPUS，DP73，日本)。

1.1.2 試劑 P2X7R(A10511，ABclonal，中國(guó));NLRP3(WLH3383，wanleibio，中國(guó));BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(WLA004，wanleibio，中國(guó));PVDF膜(IPVH00010，Millipore，美國(guó));ECL發(fā)光液(WLA003，wanleibio，中國(guó))。

1.2 動(dòng)物

本實(shí)驗(yàn)中動(dòng)物選用SPF級(jí)雌性SD大鼠共72只，體質(zhì)量(220±10)g，大鼠供應(yīng)商：遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)前大鼠于實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行為期1周的適應(yīng)性飼養(yǎng)，大鼠分籠飼養(yǎng)，給予正常食水喂養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境采用12 h/d照明，室溫控制(23±2)℃。按照國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物指南標(biāo)準(zhǔn)，給予充分關(guān)懷。所有實(shí)驗(yàn)過程均獲得動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組

大鼠隨機(jī)分為模型組(Model)、假手術(shù)組(Sham)和夾脊電針組(EA)，每組大鼠再根據(jù)1 d、3 d、7 d和21 d4個(gè)時(shí)間點(diǎn)分為4個(gè)亞組，每個(gè)亞組6只，大鼠采用苦味酸染色法在其尾部制作標(biāo)記以作區(qū)分。

2.2 各組大鼠處理方法

2.2.1 假手術(shù)組(Sham) 本組實(shí)驗(yàn)大鼠用10%水合氯醛溶液腹腔注射麻醉(所用濃度為3.5 mL/kg)，在實(shí)驗(yàn)大鼠被完全麻醉后，將大鼠以俯臥位固定在實(shí)驗(yàn)用手術(shù)臺(tái)上，以T10脊髓節(jié)段為中心，去除脊柱附近的皮毛，皮膚常規(guī)消毒后，用手術(shù)刀沿脊柱正中線于T10上下作約3 cm長(zhǎng)的切口，然后鈍性分離皮下筋膜及肌肉組織，直至T9-11棘突清晰暴露于視野中，用小號(hào)手術(shù)剪剪掉棘突，手術(shù)鉗橫向咬除椎板，逐漸暴露出椎板下的脊髓，明膠海綿壓迫止血，隨后不做其他處理，先后縫合肌肉組織和皮膚。術(shù)后立刻給予大鼠生理鹽水5 mL腹腔注射以補(bǔ)充體液，同時(shí)每日給予青霉素肌肉注射，1日2次，持續(xù)3天。每日同其它各組大鼠一同捆綁，常規(guī)飼養(yǎng)，不予其他處置。

2.2.2 模型組(Model) 脊髓損傷大鼠的動(dòng)物模型制作方法為改良Allen’s打擊法。方法：待脊髓組織完全暴露后，將5 g的消毒后砝碼置于玻璃管中，垂直固定于脊髓正上方10 cm，然后垂直落下造成脊髓撞擊傷，此時(shí)可觀察到脊髓被撞擊的部分迅速充血顏色變深至深紅或紅紫色，同時(shí)大鼠尾部出現(xiàn)一過性的不自主抽搐，表明脊髓撞擊成功，然后按照與假手術(shù)組相同的方法縫合并作進(jìn)一步處置。術(shù)后大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能出現(xiàn)異常，且下腹部觸診膀胱脹大確認(rèn)造模成功。對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠使用青霉素肌肉注射，注射頻率為每日早晚各1次，持續(xù)3 d。當(dāng)麻醉后的大鼠蘇醒后，對(duì)其進(jìn)行BBB功能評(píng)分，選取評(píng)分結(jié)果在1～3范圍內(nèi)的大鼠納入實(shí)驗(yàn)。模型制備成功后，僅進(jìn)行正常捆綁操作，無任何其他處理。

2.2.3 夾脊電針組(EA) 當(dāng)造模大鼠蘇醒后，對(duì)大鼠的BBB功能評(píng)分進(jìn)行測(cè)定，將符合得分要求的實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，并進(jìn)行下一步夾脊電針治療操作。夾脊電針操作：首先，將實(shí)驗(yàn)大鼠按照俯臥位姿勢(shì)固定在操作臺(tái)上(固定操作是防止大鼠逃跑或撕咬，以造成不良后果)。夾脊電針的穴位選取大鼠T9和T11兩對(duì)夾脊穴，實(shí)驗(yàn)用針灸針規(guī)格為0.35 mm×13 mm，直刺腧穴下，深度4～5 mm，感覺針尖觸碰到椎板，然后同側(cè)夾脊穴接在同一組電針儀上，正極在上，負(fù)極在下，調(diào)節(jié)電針頻率定為100 Hz，打開電針儀開關(guān)，緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)電流調(diào)節(jié)旋鈕至大鼠背部肌肉微弱抽動(dòng)且沒有劇烈掙扎為度，每天治療1次，每次30 min。

2.3 標(biāo)本采集

各組大鼠分別于4個(gè)時(shí)間點(diǎn)處置結(jié)束后，以10%水合氯醛注射進(jìn)行腹腔注射麻醉，待大鼠完全麻醉后，進(jìn)行多聚甲醛灌注固定，隨后在實(shí)驗(yàn)所用冰盒上提取損傷局部的脊髓組織，長(zhǎng)度約4 cm，于4 ℃冰箱存放備用。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)

2.4.1 BBB評(píng)分 觀察各組大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況，各組大鼠治療后，將大鼠置于空地上進(jìn)行自由活動(dòng)，由專業(yè)人員進(jìn)行評(píng)估。

2.4.2 Western blot測(cè)定脊髓組織中NLRP3、P2X7R蛋白表達(dá) 按照將蛋白質(zhì)抽提、定量、SDS-PAGE、轉(zhuǎn)印、封閉、孵育一抗、孵育二抗和ECL底物發(fā)光、抗體剝脫、封閉、孵育內(nèi)參抗體、孵育二抗、ECL底物發(fā)光的步驟，最后進(jìn)行結(jié)果分析。

2.4.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定脊髓組織中NLRP3 mRNA、P2X7R mRNA表達(dá) 提取大鼠樣本總RNA并測(cè)定各個(gè)樣本中RNA濃度，將上述所得到的RNA樣本由PCR儀進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以得到對(duì)應(yīng)的cDNA，由ExicyclerTM 96熒光定量?jī)x進(jìn)行熒光定量分析。

2.5 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有計(jì)量資料均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，差異比較采用單因素方差分析(One-ANOVA)，檢驗(yàn)方差齊性，方差齊時(shí)組間比較采用LSD法，方差不齊采用Dunnett’s T3法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 夾脊電針對(duì)各組大鼠肢體運(yùn)動(dòng)功能的影響

Sham組BBB評(píng)分為21分，與Sham組相比，Model組和EA組在各時(shí)間點(diǎn)BBB評(píng)分顯著降低(P<0.05)，表明脊髓損傷后大鼠出現(xiàn)肢體運(yùn)動(dòng)障礙；與Model組比較，EA組在治療后BBB評(píng)分顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠脊髓組織BBB評(píng)分變化

3.2 Western blot檢測(cè)各組大鼠NLRP3、P2X7R蛋白表達(dá)

Model組、Sham組和EA組大鼠脊髓組織中NLRP3蛋白表達(dá)情況：Sham組大鼠脊髓組織的NLRP3蛋白表達(dá)水平較低，并穩(wěn)定保持。與Sham組NLRP3蛋白表達(dá)比較，Model組在3 d、7 d和21 d的NLRP3蛋白表達(dá)顯著升高，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；EA組脊髓組織NLRP3蛋白在3 d、7 d和21 d表達(dá)均低于Model組的NLRP3蛋白表達(dá)，兩組NLRP3蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。相關(guān)結(jié)果見圖1、表2。

圖1 各組大鼠脊髓組織NLRP3蛋白表達(dá)(n=6)

表2 各組大鼠脊髓組織NLRP3蛋白表達(dá)

Model組、Sham組和EA組大鼠脊髓組織中P2X7R蛋白表達(dá)結(jié)果：在1 d、3 d、7 d和21 d等各時(shí)間點(diǎn)上，Sham組大鼠脊髓組織中P2X7R的表達(dá)量始終保持在較低的水平，Model組大鼠的組織P2X7R蛋白表達(dá)于術(shù)后1 d、3 d和7 d開始升高，于21 d表達(dá)下降。在術(shù)后1 d、3 d、7 d和21 d時(shí)間點(diǎn)，Model組與Sham組比較，P2X7R蛋白表達(dá)升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。在夾脊電針后的3 d、7 d和21 d時(shí)間點(diǎn)，EA組大鼠脊髓組織的P2X7R的蛋白表達(dá)呈現(xiàn)明顯下降趨勢(shì)，與同時(shí)間內(nèi)Model組P2X7R的蛋白表達(dá)結(jié)果相比，兩組P2X7R的蛋白表達(dá)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見圖2、表3。

圖2 各組大鼠脊髓組織P2X7R蛋白表達(dá)(n=6)

表3 各組大鼠脊髓組織P2X7R蛋白表達(dá)

3.3 各組大鼠NLRP3 mRNA、P2X7R mRNA表達(dá)

Model組、Sham組和EA組大鼠脊髓組織中NLRP3 mRNA表達(dá)：與Sham組NLRP3 mRNA表達(dá)比較，Model組大鼠脊髓組織NLRP3 mRNA在1 d、3 d、7 d和21 d各個(gè)時(shí)間點(diǎn)明顯升高，兩者NLRP3 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與Model組NLRP3 mRNA表達(dá)水平比較，EA組大鼠脊髓組織NLRP3 mRNA表達(dá)水平在術(shù)后3 d、7 d和21 d均下降，兩者NLRP3 mRNA表達(dá)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表4、圖3。

表4 各組大鼠脊髓組織NLRP3 mRNA表達(dá)水平變化

圖3 各組大鼠脊髓組織NLRP3 mRNA表達(dá)水平變化(n=6)

各組大鼠脊髓組織P2X7R mRNA表達(dá)情況：Sham組大鼠的脊髓組織中P2X7R mRNA表達(dá)在1 d、3 d、7 d和21 d共4個(gè)時(shí)間點(diǎn)均維持在少量而穩(wěn)定的低水平。Model組大鼠組織P2X7R mRNA表達(dá)在術(shù)后1 d、3 d、7 d和21 d時(shí)間點(diǎn)升高。與Sham組比較，Model組P2X7RmRNA表達(dá)在術(shù)后1 d、3 d、7 d和21 d時(shí)間點(diǎn)升高，兩者P2X7R mRNA表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與Model組比較，EA組大鼠脊髓組織P2X7R mRNA表達(dá)在術(shù)后3 d、7 d和21 d時(shí)間點(diǎn)下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果見表5、圖4。

表5 各大鼠脊髓組織P2X7R mRNA表達(dá)水平變化

圖4 各組大鼠脊髓組織P2X7R mRNA表達(dá)水平變化(n=6)

4 討論

實(shí)驗(yàn)大鼠脊髓損傷主要以炎癥和免疫反應(yīng)為主，此類繼發(fā)性損傷會(huì)引起大鼠相關(guān)細(xì)胞的功能改變，引起更多的神經(jīng)細(xì)胞死亡，加重?fù)p傷程度。NLRP3包絡(luò)銜接蛋白ASC及被激活可以裂解IL-1β和IL-18前體的效應(yīng)蛋白Caspase-1，而產(chǎn)生活化形式的IL-1β和IL-18[14]。現(xiàn)有研究結(jié)果表明，急性脊髓損傷會(huì)激發(fā)NLRP3、Caspase-1和ASC等蛋白復(fù)合體。并且，脊髓損傷后，IL-18、IL-1β蛋白表達(dá)會(huì)升高，這種趨勢(shì)會(huì)進(jìn)一步加重脊髓損傷，上述研究結(jié)論說明NLRP3炎癥復(fù)合體是導(dǎo)致急性脊髓損傷后各類炎癥反應(yīng)的核心因素[15]。

在脊髓損傷的中醫(yī)學(xué)理論研究方面，通常認(rèn)為脊髓損傷是由于督脈受損而導(dǎo)致經(jīng)脈痹阻，氣血運(yùn)行不暢，陰陽失調(diào)，臟腑筋脈缺乏氣血的濡養(yǎng)而痿廢不用。夾脊穴內(nèi)夾督脈，外鄰膀胱經(jīng)，處于正中線旁開0.5寸，針刺夾脊穴可以一針連通兩經(jīng)，振奮助陽，疏通督脈和膀胱經(jīng)，以達(dá)到陰陽調(diào)和、氣血通暢、臟腑筋脈得以濡養(yǎng)而功能復(fù)用，電針夾脊穴是治療脊髓損傷的一種有效中醫(yī)手段。在夾脊電針治療過程中，外加電壓會(huì)在夾脊穴附近產(chǎn)生強(qiáng)大的電場(chǎng)，這種電場(chǎng)能產(chǎn)生拮抗內(nèi)生性損傷電流，此類電流的存在能阻止Ca2+內(nèi)流，增加線粒體酶活性，穩(wěn)定膜結(jié)構(gòu)，從而阻斷脊髓繼發(fā)性病變促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[15]。炎癥反應(yīng)是脊髓損傷后繼發(fā)性損傷的重要組成部分，在脊髓損傷的早期階段，減輕炎癥反應(yīng)是抑制繼發(fā)性損傷、促進(jìn)脊髓神經(jīng)功能恢復(fù)的有效手段。鄒氏等[16]研究表明，電針夾脊穴治療大鼠脊髓損傷可有效抑制脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)，改善脊髓損傷后大鼠的運(yùn)動(dòng)功能，其主要機(jī)制是通過降低IL-6、IL-1β的表達(dá)，并增加IL-10的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)炎癥反應(yīng)的抑制。

本實(shí)驗(yàn)以急性脊髓損傷模型大鼠為研究對(duì)象，以夾脊電針為治療手段，通過BBB評(píng)分觀察各組大鼠脊髓損傷后肢體運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況，以蛋白印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法測(cè)定P2X7R、NLRP3蛋白和基因表達(dá)變化為觀察指標(biāo)，探討夾脊電針治療急性脊髓損傷的可能作用機(jī)制。本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明，夾脊電針可以明顯提高脊髓損傷大鼠BBB評(píng)分，改善肢體運(yùn)動(dòng)功能；在不同時(shí)間點(diǎn)，與假手術(shù)組相比，模型組大鼠脊髓組織中NLRP3、P2X7R蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，表明脊髓損傷后，NLRP3、P2X7R蛋白呈高表達(dá)狀態(tài)，經(jīng)過夾脊電針治療后，二者表達(dá)出現(xiàn)不同程度下降(P<0.05)；實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明，假手術(shù)組中大鼠脊髓組織中NLRP3 mRNA、P2X7R mRNA表達(dá)量少且穩(wěn)定，模型組中NLRP3 mRNA、P2X7R mRNA在3、7和21 d時(shí)間點(diǎn)表達(dá)升高(P<0.05)，而在同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，夾脊電針組NLRP3 mRNA、P2X7R mRNA的表達(dá)水平低于模型組(P<0.05)，這說明NLRP3、P2X7R參與了脊髓損傷過程，而通過夾脊電針的治療，NLRP3、P2X7R表達(dá)能夠得到降低，從而促進(jìn)脊髓損傷恢復(fù)。也有研究證明脊髓損傷等神經(jīng)系統(tǒng)疾病與NLRP3、P2X7R關(guān)系密切，NLRP3、P2X7R可在膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元中表達(dá)[17]。本課題組前期研究表明[18]，夾脊電針能有效抑制ASC接頭蛋白表達(dá)和NLRP3受體蛋白，降低促炎因子IL-18的釋放，從而實(shí)現(xiàn)脊髓損傷后炎癥反應(yīng)的減輕，促進(jìn)脊髓損傷后大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)。綜上，筆者認(rèn)為夾脊電針可能是通過下調(diào)NLRP3、P2X7R的表達(dá)來發(fā)揮對(duì)脊髓損傷的治療作用。

隨著科技的進(jìn)步和先進(jìn)檢測(cè)技術(shù)的更新，出現(xiàn)了越來越多關(guān)于脊髓損傷治療的研究，從功能改變和基因表達(dá)等不同層面探討脊髓損傷神經(jīng)損傷再生修復(fù)，學(xué)科交叉綜合治療以最大限度地減輕脊髓損傷患者功能障礙，提高生活質(zhì)量并使之重返社會(huì)始終是臨床關(guān)注的重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)基于P2X7R/NLRP3信號(hào)通路，通過夾脊電針抑制P2X7R、NLRP3表達(dá)的作用機(jī)制探討，為臨床上夾脊電針治療急性脊髓損傷提供一定理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。