陳英華，王浩宇，孫 瑋，李俊峰，蘇曉慶，秦瑞琦，孫忠人△

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

血管性癡呆(Vascular dementia，VD)是老年人常見的神經(jīng)精神障礙性疾病，指由缺血性卒中、出血性卒中以及影響記憶、認(rèn)知和行為等腦區(qū)低灌注的腦血管疾病所致的一種嚴(yán)重認(rèn)知功能障礙綜合征，是僅次于Alzheimer病(Alzheimer disease，AD)的第二常見癡呆癥[1]。VD具有病程長、疾病負(fù)擔(dān)重和致殘率高等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響了患者及其家庭的生活質(zhì)量，目前 FDA仍無批準(zhǔn)用于治療 VD 的藥物[2-3]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要從前期預(yù)防、后期改善為主進(jìn)行治療[4]，但并不能有效地阻止神經(jīng)細(xì)胞的繼發(fā)性凋亡和遲發(fā)性壞死，故多數(shù)患者存在偏癱和認(rèn)知功能障礙等后遺癥[5]。針刺在腦血管疾病防治臨床應(yīng)用上具有獨(dú)特的優(yōu)勢，已受到醫(yī)學(xué)界的公認(rèn)和肯定[6-8]。本研究團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，針刺四神聰穴、風(fēng)池穴能夠抑制VD模型大鼠核因子κB(NF-κB)信號通路產(chǎn)生腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白細(xì)胞介素1β(IL-1β)，進(jìn)而抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[9]。但針刺如何調(diào)控PTEN/PI3K/Akt信號通路對血管性癡呆產(chǎn)生影響，迄今未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過針刺VD模型大鼠的四神聰穴、風(fēng)池穴，在光鏡下觀察針刺對VD模型大鼠海馬組織病理形態(tài)學(xué)的影響，同時(shí)運(yùn)用RT-PCR技術(shù)，探討針刺對大鼠海馬區(qū)PTEN、Akt表達(dá)的影響，為針刺防治VD提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

利用Morris水迷宮測試對168只健康的SD大鼠(體質(zhì)量220±30 g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)進(jìn)行行為學(xué)檢測，并記錄大鼠對水迷宮的學(xué)習(xí)與記憶的獲取能力，篩選出符合條件的大鼠。

1.2 主要儀器與試劑

1.2.1 儀器 臺式離心機(jī)(型號：1-14型；德國SIGMA公司)；高速冷凍離心機(jī)(型號：AVANTI J-15R；Beckman貝克曼)；-20℃冰箱(型號：HYCD-282；中國青島海爾電器有限公司)；-80℃冰箱(型號：MDF-U53V；日本SANYO公司)；電熱恒溫水浴鍋(型號：HWS-24；上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；電子天平(型號：PL203；瑞士梅特勒-托利多)、臺式PH計(jì)(型號：FE28；瑞士梅特勒-托利多)；梯度PCR儀(型號：5331；德國Eppendorf公司)；凝膠成像系統(tǒng)(型號：Gel Doc XR+；美國Bio-Rad公司)；全自動圖像分析系統(tǒng)(型號：Kontron IBAS 2.5；德國Kontron公司)；電熱恒溫干燥箱(型號：DGH-9241A；寧波萊福科技有限公司)；可見紫外分光光度計(jì)(型號：6010；上海安捷倫科技有限公司)。

1.2.2 試劑 TaKaRa PrimeScript RT-PCR Kit(貨號：RR014B)、TaKaRa DL2 000 DNA Marker(批號：3427B)，均購自中國大連寶生物工程有限公司；瓊脂糖(電泳級)(批號：111860)，購自西班牙BIOSCIENCE公司；DNA Green(10 000×)(批號：G7410),購自中國天澤基因工程有限公司；引物合成(批號：A035)，由中國上海捷瑞生物工程有限公司提供。

1.3 動物分組

從實(shí)驗(yàn)樣本中隨機(jī)篩選30只實(shí)驗(yàn)大鼠，將其平均分為正常組與假手術(shù)組。同時(shí)將45只VD造模成功實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為模型組、手針組和電針組各15只。

1.4 造模方法

采用4-VO制備VD大鼠模型[10]。術(shù)前大鼠禁食水。麻醉，固定，消毒，行背側(cè)頸正中切口，分離，用電凝針于每側(cè)翼小孔內(nèi)燒灼雙側(cè)的椎動脈成永久性閉塞，手術(shù)部位予適量青霉素防感染并縫合。24 h后，麻醉，固定，消毒，行腹側(cè)頸正中切口，分離雙側(cè)頸總動脈，以“4”號絲線穿線牽拉雙側(cè)頸總動脈用微動脈夾夾閉5 min后松開，反復(fù)夾閉3次，每隔1 h夾閉1次，造成全腦缺血。再通后，手術(shù)部位予適量青霉素抗感染后縫合。飼養(yǎng)觀察，連續(xù)7 d注射青霉素8萬U以抗感染。

1.5 干預(yù)方法

1.5.1 正常組、假手術(shù)組、模型組 不予任何治療，只予同等條件抓取。

1.5.2 手針組 以2007年李忠仁主編《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[11]為參考，對樣本實(shí)驗(yàn)大鼠左右神聰穴、風(fēng)池穴進(jìn)行針刺。操作方法：造模后第7天，針刺大鼠左、右神聰穴，選取0.30 mm×13 mm毫針,左、右神聰穴平刺2.5 mm，雙側(cè)風(fēng)池穴斜刺5 mm，捻轉(zhuǎn)1 min，中間休息1 min，進(jìn)行3次，留針，治療頻率為30 min/d。以7 d為周期對實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)觀察，并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)，最后進(jìn)行行為學(xué)測試，觀察小鼠狀態(tài)。

1.5.3 電針組 7 d后對造模組實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行針刺操作，按照手針組操作且對應(yīng)穴位一致，使用長城牌KWD-808Ⅰ型脈沖電療儀對實(shí)驗(yàn)大鼠同側(cè)穴位進(jìn)行操作，選擇連續(xù)波形，調(diào)節(jié)波幅大小以見到大鼠肢體微顫為宜，留針30 min，每日針刺1次。

1.6 取材

各組大鼠分別于治療第7天、治療第14天和治療第21天的3個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行灌注固定、大鼠斷頭處死，在放冰塊的搪瓷盤中剪開大鼠顱骨，迅速取出腦組織，分離出海馬稱重，標(biāo)記標(biāo)本的組別和時(shí)間點(diǎn)，分別置于4%多聚甲醛中固定待用，進(jìn)行HE染色病理形態(tài)學(xué)檢測和將海馬放入液氮中待測，進(jìn)行RT-PCR檢測。

1.7 海馬區(qū)PTEN mRNA、Akt mRNA表達(dá)水平的RT-PCR檢測

采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測，測定VD大鼠海馬內(nèi)PTEN、Akt 的mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。選取大鼠海馬區(qū)組織100 mg并使用RNA提取試劑盒提取海馬組中總RNA。對RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，生成cDNA，應(yīng)用Premier 5.0軟件完成引物設(shè)計(jì)，同時(shí)對其擴(kuò)增。以β-actin為內(nèi)參進(jìn)行RT-PCR，見圖1。引物的序列分別為：PTEN mRNA擴(kuò)增引物：上游5′gCgAgCTgTTTTTCCACCTCT 3′，下游5′TgATgTCgCggTACACCACAT3′；Akt mRNA擴(kuò)增引物：上游5′CCTG GACTACTTGCACTCCg3′，下游5′CTgAgTAggAgAACTgggggA3′；β-actin擴(kuò)增引物：上游5′CAACCgTgAAAAgATgACCCA3′，下游5′AATgCCAgTggTACgAC CAgA3′。

注：M：DNA Marker DL2000;1、正常組；2、假手術(shù)7 d組；3、假手術(shù)14 d組；4、假手術(shù)21 d組；5、模型7 d組；6、模型14 d組；7、模型21 d組；8、手針7 d組；9、手針14 d組；10、手針21 d組；11、電針7 d組；12、電針14 d組；13、電針21 d組。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠海馬組織病理學(xué)改變

2.1.1 正常組 大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列緊密，神經(jīng)元形態(tài)規(guī)整，核仁清晰，有少量膠質(zhì)細(xì)胞，無炎細(xì)胞浸潤。

2.1.2 假手術(shù)組 各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列較緊密，神經(jīng)元形態(tài)尚規(guī)整，核仁清晰，膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目有所增多，散見少量凋亡小體和炎細(xì)胞。

2.1.3 模型組 各時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，神經(jīng)元形態(tài)欠規(guī)整，核仁不清晰，膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯增多，可見大量神經(jīng)元凋亡小體和炎細(xì)胞。其中尤以第21天表現(xiàn)最為明顯。

2.1.4 手針組和電針組 經(jīng)過手針和電針治療后，大鼠海馬區(qū)病理改變較模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)有明顯改善。主要表現(xiàn)為神經(jīng)細(xì)胞排列較規(guī)整，核仁較清晰，膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目有所減少，凋亡小體和炎細(xì)胞數(shù)量有所減輕。這種改變隨治療時(shí)間的延長而表現(xiàn)更為明顯,表明針刺可以減少炎性浸潤，抑制神經(jīng)元凋亡，減輕神經(jīng)細(xì)胞病理變化，從而起到改善學(xué)習(xí)記憶的作用。見圖2。

圖2 各組治療第7 d、14 d、21 d大鼠海馬組織HE染色

2.2 各組大鼠海馬區(qū)PTEN mRNA比較

與正常組、假手術(shù)組相比較，模型組大鼠在治療第7天、治療第14天和治療第21天各時(shí)點(diǎn)PTEN mRNA均明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，手針組、電針組大鼠在治療第7天、治療第14天、治療第21天各時(shí)點(diǎn)PTEN mRNA明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與手針組比較，電針組大鼠在治療第14天、治療第21天時(shí)點(diǎn)PTEN mRNA降低更為顯著(P<0.05)。見表1、圖3。

表1 各組大鼠海馬組織中不同時(shí)間PTEN mRNA相對表達(dá)量比較

注：M:DNA Marker DL2000;1、正常組；2、假手術(shù)7 d組；3、假手術(shù)14 d組；4、假手術(shù)21 d組；5、模型7 d組；6、模型14 d組；7、模型21 d組；8、手針7 d組；9、手針14 d組；10、手針21 d組；11、電針7 d組；12、電針14 d組；13、電針21 d組。

2.3 各組大鼠海馬區(qū)Akt mRNA比較

與正常組、假手術(shù)組相比較，模型組大鼠在治療第7天、治療第14天和治療第21天各時(shí)點(diǎn)Akt mRNA均明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，手針組、電針組大鼠在治療第7天、治療第14天、治療第21天各時(shí)點(diǎn)Akt mRNA明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與手針組比較，電針組大鼠在治療第7天、治療第14天、治療第21天各時(shí)點(diǎn)Akt mRNA升高更為顯著(P<0.05或P<0.01)。見表2、圖4。

表2 各組大鼠海馬組織中不同時(shí)間Akt mRNA相對表達(dá)量比較

注：M:DNA Marker DL2000;1、正常組；2、假手術(shù)7 d組；3、假手術(shù)14 d組；4、假手術(shù)21 d組；5、模型7 d組；6、模型14 d組；7、模型21 d組；8、手針7 d組；9、手針14 d組；10、手針21 d組；11、電針7 d組；12、電針14 d組；13、電針21 d組。

3 討論

VD屬于中醫(yī)學(xué)“健忘”“善忘”“呆病”與“文癡”等范疇[12]，清代醫(yī)家林佩琴在其著作《類證治裁·卷之四》中指出：“腦為元神之府，精髓之海……老人健忘者，腦漸空也?！碑?dāng)代國醫(yī)大師張琪教授認(rèn)為，VD其本在于心腎兩虛，氣血運(yùn)行受阻，虛而致瘀，本虛標(biāo)實(shí)，痰瘀阻滯腦絡(luò)，腦髓海失養(yǎng)，神明失用[13]。故本病病因病機(jī)為腎虛髓虧，痰瘀閉阻腦絡(luò)，神志靈機(jī)失用，治療上采用補(bǔ)腎益髓、活血化痰和醒腦益智為治則大法。我課題組在長期臨床實(shí)踐中應(yīng)用“四神聰”“風(fēng)池”穴治療VD效果較為理想[14]。四神聰穴具有健腦調(diào)神、調(diào)和氣血的作用[15]。風(fēng)池穴位于頭項(xiàng)交界處，正好是進(jìn)入頭部的通道，既可以祛外風(fēng)，又可息內(nèi)風(fēng)，治療和頭有關(guān)的疾病，具有醒腦開竅、明目益聰和疏通經(jīng)絡(luò)的功效[16]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為腦血流供應(yīng)來自前循環(huán)和后循環(huán)，前循環(huán)即頸內(nèi)動脈系統(tǒng)供應(yīng)額葉、顳葉、頂葉以及基底節(jié)等大腦半球前3/5部分血流，后循環(huán)即椎基底動脈系統(tǒng)供應(yīng)腦后部的2/5部分血流。而四神聰穴位于額、顳、頂三葉的投射區(qū)，與人的思維、記憶和精神緊密相關(guān)[17]。風(fēng)池位于枕骨之下，頭項(xiàng)交界處，正好是椎動脈的投射區(qū)，通過針刺兩穴可以有效地改善大腦前、后循環(huán)的血液供應(yīng)，使腦部血流量增加，調(diào)節(jié)大腦功能，改善智能作用。

由于缺血造成腦細(xì)胞凋亡作為VD中重要的病理生理機(jī)制[18]，細(xì)胞凋亡與癡呆程度呈正相關(guān)，其也參與了腦缺血損傷機(jī)制形成的過程。PTEN/PI3K/Akt 信號通路對調(diào)控腦缺血損傷的發(fā)生與發(fā)展十分重要[19]。作為新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因PTEN在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、凋亡和遷移等方面起到了重要作用[20]，其主要底物三磷酸磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol triphosphate，PIP3)是PI3K的產(chǎn)物。由于PTEN具有磷酸酯酶活性，能調(diào)控PI3K/Akt信號通路，該通路廣泛存在于各類神經(jīng)細(xì)胞中，PTEN不僅能逆轉(zhuǎn)二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)向PIP3 的轉(zhuǎn)化，而且對PI3K/Akt信號通路起到負(fù)向調(diào)節(jié)作用[21-22]。在PI3K/Akt信號通路中，有多種效應(yīng)分子分布在PI3K下游，Akt通路激活可作用于下游多個(gè)靶點(diǎn)，促進(jìn)抗凋亡基因轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，使抗凋亡作用充分發(fā)揮，促進(jìn)細(xì)胞存活[23]。在細(xì)胞存活和凋亡中，PI3K/Akt信號通路起著重要的作用，可介導(dǎo)抗凋亡信號及促生長信號，對腦缺血損傷起著重要保護(hù)作用[24]。而PTEN可以通過有效拮抗PI3K/Akt信號通路阻止細(xì)胞生長、代謝、增殖和存活，因此具有抑制效應(yīng)。因此，PTEN/PI3K/Akt 信號通路是調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、存活和凋亡的十分重要的信號通路。研究表明，與正常組、假手術(shù)組相比較，模型組大鼠在治療第7天、治療第14天和治療第21天各時(shí)點(diǎn)PTEN mRNA均明顯升高(P<0.01)，Akt mRNA均明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，手針組、電針組大鼠在治療第7天、治療第14天、治療第21天各時(shí)點(diǎn)PTEN mRNA明顯降低(P<0.05或P<0.01)，Akt mRNA明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與手針組比較，電針組大鼠在治療第14 d、治療第21天時(shí)點(diǎn)PTEN mRNA降低更為顯著(P<0.05)，在治療第7天、治療第14天和治療第21天各時(shí)點(diǎn)Akt mRNA升高更為顯著(P<0.05)。

綜上所述，針刺四神聰、風(fēng)池穴可能抑制PTEN /PI3K/Akt信號通路上游負(fù)性調(diào)節(jié)因子PTEN mRNA表達(dá)水平，促進(jìn)Akt mRNA轉(zhuǎn)錄表達(dá)，激活PI3K/Akt信號通路，調(diào)控腦區(qū)低灌注的腦血管疾病所引起一系列損傷級聯(lián)反應(yīng)，改善腦缺血所致腦組織神經(jīng)元損傷，減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，改善VD大鼠的學(xué)習(xí)、記憶能力，起到防治VD的作用。