逄琳，陳新，王艷，呂秀娟

(沈陽市第四人民醫(yī)院干診科，遼寧 沈陽 110000)

0 引言

中國是胃癌大國，每年新發(fā)病例以及胃癌相關(guān)死亡事件分別占到世界總數(shù)的47%和48%。我國胃癌成為第二大常見癌癥及第三大死因[1,2]。目前胃癌的治療效果較差，晚期胃癌中位生存時(shí)間仍未突破16個(gè)月，仍需進(jìn)一步探索新的治療手段。目前進(jìn)行新型癌癥藥物的開發(fā)非常昂貴且耗時(shí)，隨著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，包括基因組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)等研究給胃癌的病因探索和診療策略的研究帶來了突飛猛進(jìn)的變化[3,4]。新技術(shù)的發(fā)展為胃癌藥物臨床帶來了新的機(jī)遇，分子靶向藥物的研究如火如荼，新靶點(diǎn)藥物層出不窮。進(jìn)入靶向時(shí)代二十年來，胃癌患者生存期的延長、生活質(zhì)量的提高，進(jìn)步很大，但仍然很有限，有效的靶向藥物還很少。如何加快抗胃癌藥物的研發(fā)速度，迎接挑戰(zhàn)，克服新藥研發(fā)的困境是近期的努力方向。用于治療其它疾病的藥物進(jìn)行重新定位或許有望用于治療胃癌。雙硫侖就是一種便宜、安全且具有悠久歷史的戒酒藥物，國內(nèi)外已有多篇論文證實(shí)了雙硫侖藥物在乳腺癌、肺癌、淋巴瘤等惡性腫瘤中的抗癌作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)雙硫侖的細(xì)胞毒性依賴于銅(Cu)[5,6]。由于它是一種二價(jià)金屬螯合劑，所以研究認(rèn)為雙硫侖與Cu形成一種更容易被細(xì)胞吸收的復(fù)合物。雙硫侖及其代謝產(chǎn)物均可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激已被證實(shí)可以調(diào)節(jié)自噬和凋亡[7,8]。自噬和凋亡之間有著親密的相互作用，他們擁有相似的效應(yīng)器和調(diào)節(jié)因子。有望通過本項(xiàng)研究將進(jìn)一步探討其在胃癌腫瘤細(xì)胞中的抗癌活性及其機(jī)制。

雙硫侖在臨床中一直被用作一線戒酒藥物，沒有嚴(yán)重的副作用，近期有研究發(fā)現(xiàn)，患有腫瘤的患者中同時(shí)服用雙硫侖藥物戒酒的患者生存期明顯優(yōu)于未服用者。本研究主要探索其抗腫瘤的機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

研究選取沈陽市第四人民醫(yī)院2018年～2019年就診的確診胃癌患者，并留取胃癌細(xì)胞，體外培養(yǎng)胃癌細(xì)胞，用分別不同濃度的雙硫侖與Cu對(duì)胃癌細(xì)胞進(jìn)行作用，采用MTT法檢查胃癌細(xì)胞的細(xì)胞活力與細(xì)胞增殖率，確定各自最佳劑量與效應(yīng)的關(guān)系。

1.2 研究方法及觀察指標(biāo)

觀察雙硫侖聯(lián)合Cu對(duì)胃癌細(xì)胞增殖與移行的作用；觀察雙硫侖聯(lián)合Cu對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡與自噬的作用；探討自噬與凋亡在胃癌細(xì)胞增殖過程中的相互影響與作用。研究中采用免疫熒光結(jié)合單克隆抗體方法對(duì)胃癌細(xì)胞進(jìn)行鑒定。使用相應(yīng)最佳濃度作用于胃癌細(xì)胞后，進(jìn)行凋亡與自噬相關(guān)指標(biāo)檢測：流式細(xì)胞儀通過Annexin-V和PI雙染色檢測Casepas-3、Casepas-8的變化，同時(shí)用Western-blot和Realtime-PCR檢測凋亡與自噬相關(guān)蛋白等(Caspase -3、Caspase-8、LC3B)的表達(dá)。用免疫熒光法對(duì)胃癌相關(guān)自噬小體進(jìn)行定位于半定量分析(LC3B)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

研究使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析研究數(shù)據(jù)，多組數(shù)據(jù)之間差別比較使用F檢驗(yàn)(計(jì)量資料)以及卡方檢驗(yàn)(計(jì)數(shù)資料以及等級(jí)資料)；研究的檢驗(yàn)水準(zhǔn)均使用P＜0.05為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙硫侖聯(lián)合Cu作用后胃癌細(xì)胞細(xì)胞活性與增殖率

IC50擬合曲線結(jié)果胃癌細(xì)胞24h的IC50為0.340μmol/L。采用CCK-8法檢測聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞增殖抑制的劑量依賴性。藥物濃度為1，2，3和5μmol/L的抑制率分別為(80.45±0.88)%， (82.98±0.97)%，(81.35±0.95)%和(86.12±0.74)%；可見觀察組抑制作用較對(duì)照組明顯增強(qiáng)。詳見表1所示。

表1 觀察組與對(duì)照組抑制率分布情況(%)

2.2 雙硫侖聯(lián)合Cu作用后胃癌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率變化

觀察組可見流式細(xì)胞儀檢測在胃癌細(xì)胞中，藥物濃度為0，1，3和5μmol/L的凋亡率分別為(7.04±0.50)%，(9.03±0.48)%，(13.18±0.65)%和(14.42±0.19)%。藥物誘導(dǎo)24 h后細(xì)胞出現(xiàn)胞體變圓、縮小和脫落。

2.3 觀察組及對(duì)照組Casepas-3Casepas-8蛋白表達(dá)分布情況

本次研究結(jié)果還提示，觀察組Casepas-3 Casepas-8蛋白表達(dá)分別為(8.98±1.09)mL/mg和(3.09±1.31)mL/mg；對(duì)照組Casepas-3 Casepas-8蛋白表達(dá)分別為(13.22±1.43)mL/mg和(16.05±1.55)mL/mg；Casepas-3蛋白表達(dá)在觀察組顯著更低，而Casepas-8蛋白表達(dá)則可見在觀察組顯著更高。詳見表3所示。

表2 觀察組劑對(duì)照組凋亡率分布情況(%)

表3 兩組Casepas-3 Casepas-8蛋白表達(dá)分布情況(mL/mg)

2.4 觀察組及對(duì)照組自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ表達(dá)分布情況

本次研究結(jié)果還提示，Western blot檢測觀察組胃癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ表達(dá)，可見在藥物0.5、1、2、和4umol/L濃度下，相對(duì)表達(dá)量分別為(74.90±0.64)、(82.09±0.52)、(90.37±0.62)和(110.64±0.59)；此外對(duì)照組胃癌細(xì)胞該蛋白表達(dá)相對(duì)表達(dá)量為(30.24±0.59)，如表4所示。

表4 觀察組及對(duì)照組自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ表達(dá)分布情況

3 討論

雙硫侖(disulfiram，DSF)為常見的戒酒藥，1948年Jacobsen等發(fā)現(xiàn)人體吸收少量雙硫侖可引起面部潮紅、頭痛、腹痛、出汗、呼吸困難等癥狀，飲酒后這些癥狀會(huì)更加明顯，攝入DSF后的飲酒癥狀稱也因此被稱為雙硫侖樣反應(yīng)[9]。雙硫侖作為二價(jià)過渡金屬離子螯合劑，近年來研究發(fā)現(xiàn)，其在多種腫瘤中發(fā)揮抑制腫瘤功效；當(dāng)DSF 聯(lián)合二價(jià)銅離子、鋅離子、鉻離子等金屬離子時(shí)，抑制腫瘤效果更為顯著，但其抑制腫瘤生長機(jī)制具有種屬及細(xì)胞特異性[5,10]。DSF價(jià)格低廉、同時(shí)細(xì)胞毒性低及良好的抗腫瘤效果等優(yōu)勢，有望作為抗腫瘤藥物應(yīng)用于臨床。但其也有不足之處，比如DSF水溶性差，在體內(nèi)存在穩(wěn)定性欠佳，等等。

流行病學(xué)數(shù)據(jù)提示，胃癌高發(fā)與發(fā)展中國家及經(jīng)濟(jì)發(fā)展水平較差的地區(qū)[11]；雙硫侖作為一種經(jīng)典藥物，價(jià)格相對(duì)低廉，如果能證實(shí)其可以在體外殺傷胃癌細(xì)胞則為今后其應(yīng)用于臨床提供了理論基礎(chǔ)，從而減輕政府及患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[9,10]。本次研究即圍繞雙硫侖與Cu的各自最佳劑量與協(xié)同劑量，同時(shí)確定藥物作用時(shí)間與給藥時(shí)間點(diǎn)等展開分析討論，力爭完成藥物配伍，同時(shí)對(duì)藥物作用后的胃癌細(xì)胞進(jìn)行增殖、遷移相關(guān)實(shí)驗(yàn)，對(duì)細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行光鏡與電鏡觀察，對(duì)自噬與凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)與基因表達(dá)指標(biāo)進(jìn)行檢測，就機(jī)理進(jìn)行深入分析。本次研究結(jié)果提示，IC50擬合曲線結(jié)果胃癌細(xì)胞24h的IC50為0.340μmol/L。采用CCK-8法檢測聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞增殖抑制的劑量依賴性。藥物濃度為1，2，3 和5μmol/L的抑制率分別為(80.45±0.88)%，(82.98±0.97)%，(81.35±0.95)% 和(86.12±0.74)%；可見觀察組抑制作用較對(duì)照組明顯增強(qiáng)。觀察組可見流式細(xì)胞儀檢測在胃癌細(xì)胞中，藥物濃度為0，1，3和5μmol/L的凋亡率分別為(7.04±0.50)%，(9.03±0.48)%，(13.18±0.65)%和(14.42±0.19)%。藥物誘導(dǎo)24h后細(xì)胞出現(xiàn)胞體變圓、縮小和脫落。充分提示Cu雙硫侖聯(lián)合作用可以充分抑制胃癌細(xì)胞并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡。

本次研究結(jié)果還提示，觀察組Casepas-3 Casepas-8蛋白表達(dá)分別為(8.98±1.09)mL/mg和(3.09±1.31)mL/mg；對(duì)照組 Casepas-3 Casepas-8蛋白表達(dá)分別為(13.22±1.43)mL/mg和 (16.05±1.55)mL/mg；Casepas-3蛋白表達(dá)在觀察組顯著更低，而Casepas-8蛋白表達(dá)則可見在觀察組顯著更高。Western blot檢測觀察組胃癌細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B-Ⅱ表達(dá)，可見在藥物0.5、1、2、和4umol/L濃度下，相 對(duì)表達(dá)量分 別為 (74.90±0.64)、(82.09±0.52)、(90.37±0.62)和(110.64±0.59)；此 外對(duì)照組胃癌細(xì)胞該蛋白表達(dá)相對(duì)表達(dá)量為(30.24±0.59)?？梢奀u雙硫侖的促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡達(dá)到抑制腫瘤目的的潛在機(jī)理與下調(diào)Casepas-3蛋白表達(dá)以及上調(diào)Casepas-8蛋白表達(dá)，并進(jìn)而上調(diào)自噬相關(guān)蛋白(比如LC3B-Ⅱ)存在關(guān)聯(lián)，是可能的作用機(jī)制。

本研究的主要內(nèi)容為探索藥物的抗腫瘤機(jī)制，故以社會(huì)效益為主，旨在探索新的治療方式，為胃癌患者帶來福音。研究結(jié)果充分提示Cu雙硫侖聯(lián)合作用可以充分抑制胃癌細(xì)胞并誘導(dǎo)其發(fā)生凋亡；主要機(jī)理與Cu雙硫侖的促進(jìn)胃癌細(xì)胞凋亡達(dá)到抑制腫瘤目的的潛在機(jī)理與下調(diào)Casepas-3蛋白表達(dá)以及上調(diào)Casepas-8蛋白表達(dá)，并進(jìn)而上調(diào)自噬相關(guān)蛋白(比如LC3B-Ⅱ)存在關(guān)聯(lián)。另外，本次研究創(chuàng)新點(diǎn)與特色還表現(xiàn)在胃癌現(xiàn)有的治療手段以手術(shù)為主，由于胃鏡檢查在我國體檢中并不作為常規(guī)檢查項(xiàng)目，因此很多患者首次發(fā)現(xiàn)時(shí)已失去手術(shù)機(jī)會(huì)。對(duì)于中晚期胃癌以化療及靶向治療為主。已經(jīng)批準(zhǔn)用于胃癌治療的靶向藥物僅有曲妥珠單抗、阿帕替尼及Ramuciremab.在全球范圍內(nèi)胃癌的藥物臨床研究很多但成功的寥寥無幾，多種因素限制了胃癌新藥的臨床研發(fā)。本項(xiàng)目的創(chuàng)新點(diǎn)在于老藥新用，可以大大節(jié)省研發(fā)新藥的費(fèi)用。