農向群，閆多子，蔡 霓，王廣君，涂雄兵，張澤華

（中國農業(yè)科學院植物保護研究所/植物病蟲害生物學國家重點實驗室，北京 100193）

蝗災是世界經常性的自然災害。據聯(lián)合國糧農組織FAO統(tǒng)計，全球常年發(fā)生蝗蟲的面積達4680萬km2，威脅到100多個國家或地區(qū)，時常在非洲和亞洲造成嚴重災害。幾百年來，在我國以及澳洲、非洲都曾暴發(fā)多次大規(guī)?；葹?，造成作物絕產、草地荒蕪。2002—2013年我國天然草地年均危害面積2099萬hm2，農區(qū)飛蝗年均成災面積約320萬hm2，對我國的農牧業(yè)生產造成嚴重破壞[1]。2004—2014年沙漠蝗Schistocerca gregaria在非洲西北部接連5次暴發(fā)，生態(tài)系統(tǒng)破壞加劇。2019年再次在肯尼亞、埃塞俄比亞等國暴發(fā)，短短數月內蝗蟲數量激增6400萬倍，并擴散遷移。2020年初，已擴張到其西南各國，并在當地又形成新生代種群，同時向東北一路越過了紅海、沙特阿拉伯、伊朗，進入了巴基斯坦和印度西北地區(qū)，正發(fā)育成熟進入產卵繁殖季節(jié)[2]，如果遭遇強勁的印度洋西南季風，蝗蟲將有機會飛躍橫斷山脈，對我國構成潛在威脅，形勢十分嚴峻。

全世界的蝗蟲已知有1萬種以上，其中對農、林、牧業(yè)可造成為害的蝗蟲約300種，全球除南極洲、歐亞大陸北緯 55°以北地區(qū)外均可發(fā)生蝗害[3]。沙漠蝗被認為是世界上最具破壞力的遷徙性害蟲之一，主要分布在北非、中東和西南亞的干旱和半干旱地區(qū)，其飛行能力強、繁殖快、食量大，可聚集形成巨大蝗群。每天可以隨風飛行150 km，存活時間為3個月左右[4,5]，一只雌蝗可產卵大約300粒[6]，1平方公里規(guī)模的蝗群1 d的進食量相當于3.5萬人1 d的進食[7]，是非洲、亞洲熱帶荒漠地區(qū)的河谷、綠洲上的重大農業(yè)害蟲。

非洲中部、中南部、薩赫勒地區(qū)是蝗災頻發(fā)地，常見蝗蟲有非洲飛蝗Locusta migratoria migratorioides、紅蝗Nommadacris septemfaciata、樹蝗Anacridium melanorhodonI；在亞洲中部、東南部地區(qū)，如中國、越南、哈薩克斯坦的蝗蟲優(yōu)勢種有15～20種，包括東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis、亞洲飛蝗Locusta migratoria migratoria、亞洲小車蝗Oedaleus asiaticus、意大利蝗Calliptamus italicus等；在澳大利亞昆士蘭、南澳大利亞、新南威爾士、維多利亞等5個州，常見蝗蟲有幾十種，有澳洲疫蝗Chortoicetes terminifera、飛蝗 Locusta migratoria、紅蝗等；在北美洲和墨西哥北部有美洲沙漠蝗 Schistocerca americana、血黑蝗Melanoplus sanguinipes、edaleonotus enigma等；在歐洲有摩洛哥蝗 Dociostaurus maroccanus、白邊雛蝗Chorthippus albomarginatus、意大利蝗等[8,9]。

在自然條件下，如果不加以人工防控，暴發(fā)的蝗害可迅速擴張，直至因食物絕盡或蝗蟲病原在適宜條件下造成流行病才能最終控制。在20世紀40～70年代，化學農藥興起并應用到蝗蟲防治中，在蝗蟲大發(fā)生時能夠快速殺滅種群。然而，蝗蟲產卵滋生地通常較為偏遠，發(fā)生面積巨大，成蟲可遠程遷移，施藥措施難以全面跟進。大量施用化學農藥帶來了殺傷天敵、破壞生態(tài)等問題，加上氣候異常變化，致使蝗災頻發(fā)甚至加劇。在尋求環(huán)境友好的可持續(xù)防蝗新策略、新技術研究中，利用昆蟲病原真菌的生物防治受到重視并顯現出明顯優(yōu)勢。近30多年來，利用真菌防蝗的研究進展較快，并在蝗蟲災害防控中發(fā)揮了重要作用。

1 真菌殺蟲機理

昆蟲和真菌在漫長的進化過程中，形成了多樣化的相互關系，包括致病、寄生、腐生、共生、攜播、噬菌、競爭、捕食等[10]。昆蟲病原真菌（Entomopathogenic fungi）是指能夠侵入健康昆蟲（或其他節(jié)肢動物）寄主，在其體內增殖并引起早期生理病變，影響發(fā)育、生殖和導致死亡的一類真菌。這是功能性的類別而非系統(tǒng)發(fā)生學的分類，這類真菌主要體現了上述的致病和寄生關系。

真菌對昆蟲的致病性是二者長期共同進化的結果。真菌對昆蟲感染致病過程即是與寄主相互作用，包括突破昆蟲寄主體表屏障和克服寄主免疫系統(tǒng)的過程，其進程大致分為三個階段，①侵入階段：分生孢子在黏液和粘附蛋白的幫助下附著于昆蟲體表，并萌發(fā)和形成侵染結構，穿透表皮；②與寄主互作早期階段：侵入昆蟲血腔的芽管通過斷裂增殖形成蟲菌體定居下來，同時影響昆蟲的正常生理代謝，激活寄主先天免疫應答，包括體液和細胞防御；③病害形成階段：入侵的真菌逐步戰(zhàn)勝昆蟲的免疫系統(tǒng)，在寄主體內增殖、產生毒素并致死昆蟲（圖1）。

圖1 昆蟲病原真菌與昆蟲免疫反應之間相互作用的示意圖[11]Fig. 1 Schematic of interactions between entomopathogenic fungi and the insect immune responses[11]

1.1 突破寄主體壁屏障

昆蟲病原真菌通常直接穿透外表皮來感染寄主昆蟲。體壁是昆蟲抵抗感染的第一道屏障。真菌分生孢子首先特異性或非特異性地吸附于昆蟲體壁，萌發(fā)后可分泌孢外蛋白酶及粘附因子使之牢固地附著在昆蟲體壁上[12,13]。研究發(fā)現了一些負責疏水性、粘附性和毒力的基因，例如，金龜子綠僵菌Metahizium anisopliae疏水基因 ssgA編碼的疏水蛋白可以幫助孢子附著于昆蟲體表[14]。金龜子綠僵菌在侵染寄主表皮時表達粘附蛋白 Mad1，促進真菌孢子穩(wěn)定地吸附于寄主體表，如果缺失 Mad1基因，分生孢子的粘附能力與毒力都顯著降低[15]。另外，其他細胞壁蛋白如CWP10和CP15，它們參與了耐熱和抗氧化脅迫反應，在粘附和應激反應中發(fā)揮關鍵作用[16]。

真菌孢子在昆蟲表皮上萌發(fā)后，形成附著胞。附著胞經過一段時間的膨大并形成侵入釘，借助機械壓力及蛋白酶、幾丁質酶、脂酶等水解酶的多重作用來降解昆蟲表皮，穿透寄主體壁[17]。蛋白酶主要有兩大類，一是對底物短肽 Sue-Ala-Ala-Pro-Phe-Nz具有活性的類枯草桿菌蛋白酶 Prl，另一類是對短肽Ben-Phe-Val-Arg-NA有活性的胰蛋白酶Pr2[18]，它們的同工酶氨基酸序列中具有相同的活性區(qū)域，但其他部分序列變化較大[19,20]。類枯草桿菌蛋白酶Pr1能溶解昆蟲表皮中的蛋白質成分，有助于菌絲的入侵，同時為菌絲的生長提供營養(yǎng)[21]。Pr1類蛋白酶在昆蟲病原真菌侵入寄主和致病過程中是重要毒力因子，pr1a基因被破壞的金龜子綠僵菌菌株毒力顯著下降，而pr1a高水平表達的菌株殺蟲毒力明顯提高，殺蟲時間縮短25%[22]；昆蟲血淋巴中高濃度的Prla蛋白酶可引起昆蟲酚氧化酶的過度表達，導致昆蟲中毒死亡[23]。

幾丁質是昆蟲體壁屏障的主要成分，真菌幾丁質酶是真菌突破寄主體壁的另一個重要的因子。用昆蟲生長調節(jié)劑Dimilin處理煙草夜蛾Manduca sexta幼蟲，阻止其幾丁質合成，結果試蟲體壁很容易被金龜子綠僵菌降解。幾丁質酶有多種類型，包括外切幾丁質酶和內切幾丁質酶，根據等電點分為酸性和堿性幾丁質酶等。對多種幾丁質同工酶作用研究表明，DGIDVDWEYP對真菌幾丁質酶具有高度保守性，推定是底物結合酶（Processing enzymes）的作用位點[24]。幾丁質酶是誘導酶，侵染寄主體壁過程中在稍后期才產生，需要蛋白酶作用使幾丁質露出后再誘導產生[20]。

病原真菌如果突破體壁失敗，原因可能是體壁的某些成分抑制了真菌孢子的萌發(fā)，或是體壁的分子篩功能阻擋了真菌分泌物的滲透，還有昆蟲表皮自身的推陳出新，排除了病原真菌及其分泌物。另外，昆蟲已選擇進化了抵抗病原的特異蛋白酶的抑制劑，如IMPI（Insect metalloprotease inhibitor）[25]，而真菌分泌的酶種類雖多但分泌量有限，從而影響了其對表皮的降解程度[26]。最新的轉錄組分析表明，在病原真菌附著寄主體表和侵入的早期（12～24 h）階段，寄主因識別到病原相關分子模式（Pathogen-associated molecular patterns）激活了天然免疫系統(tǒng)，出現了信號轉導基因（Myd88、Relish家族、Pelle等）以及下游一些氧化酶（PPO）、溶菌酶和防御素等基因的顯著差異表達，產生對入侵病原的防御，這可能也是限制病原真菌突破寄主體壁的重要因素之一[27]。

群居昆蟲還可以通過群體行為回避達到對真菌感染的有效防御。如白蟻和螞蟻，可利用嗅覺線索從遠處探測到被污染個體上的有毒真菌。大型白蟻可通過真菌釋放的揮發(fā)性有機化合物區(qū)分真菌的毒性高低，并采取相應的防御行為[28]。對病原真菌的行為防御還包括自我修飾以及攝入或產生具有抗病性的化合物，如一些群居昆蟲通過傳播唾液腺或表皮后胸腺產生的抗真菌分泌物（如甲酸、抗菌肽和蛋白樣液體），以保護自身及巢內同伴[29]。還有研究表明沙漠蝗可通過曬太陽來提高體溫，以對抗綠僵菌感染[30]。當種群密度高時，昆蟲宿主通過預防性免疫的增強對抗真菌，如群居性蝗蟲通過預防性免疫的增強來降低對真菌的易感性[31]。

1.2 抑制寄主體液免疫

昆蟲免疫系統(tǒng)由體液免疫（humoral immunity）和細胞免疫（cellular immunity）組成。體液免疫是指昆蟲體內本身存在或受誘導由脂肪體和血細胞分泌的免疫因子，包括抗菌肽、抗菌蛋白、凝集素、溶菌酶、酚氧化酶等物質，對病原微生物產生免疫作用。昆蟲體液免疫主要有4條信號通路，Toll、IMD通路是昆蟲抵御病原真菌的核心通路，而JAK/STAT信號通路則主要對病毒的侵染作出免疫應答，JNK信號通路則是昆蟲通過介導細胞凋亡抵御病毒侵擾[32]。病原真菌的侵入，激發(fā)了昆蟲體液免疫功能。Toll、IMD通路包含多種蛋白因子介導的黑化反應、抗菌肽、溶菌酶、活性氧（ROS）、凝集素等產生的復雜免疫應答反應[33]。Toll的激活與反應如圖1（左側）所示，革蘭氏陰性結合蛋白3（GNBP3）是β-1,3-葡聚糖識別蛋白家族（βGRP3）的成員，能識別并結合真菌細胞成分，級聯(lián)反應啟動Toll信號通路。Persephone和Sp?etzle加工酶（SPE）引起半胱氨酸結細胞因子（Cysteine knot cytokine）Sp?etzle（Spz）的裂解。當蛋白水解切割的配體Spz與受體結合時，Toll受體被激活。然后將信號傳遞到由MyD88、Tube和Pelle組成的細胞內信號轉導級聯(lián)中，最終通過有效的NF-κB轉錄因子Dorsal和Dif引起AMPs的表達。

酚氧化酶（Pheonloxidase，PO）及其相關酶類是重要的免疫激活機制。該酶平時以無活性的酚氧化酶原（Porpheonloxidase，PPO）形式存在，當外來生物入侵時，可通過特異性絲氨酸蛋白酶的級聯(lián)反應（PPO級聯(lián)）而活化，產生黑化反應，清除病原體[34,35]?？咕模ˋMPs）在脂肪體、表皮細胞和血細胞中產生。目前共發(fā)現了1500多種抗菌肽，近700種抗真菌肽。昆蟲受到微生物感染或損傷后，脂肪體和血細胞會迅速合成一些抗菌肽，分泌到血淋巴中消滅入侵的病原物。例如，在大蠟螟Galleria mellonella幼蟲體內發(fā)現一種識別綠僵菌的抗真菌肽gallerimycin[36]。溶菌酶是由昆蟲的脂肪體分泌并釋放到血淋巴中的一種免疫因子，其通過攻擊肽聚糖或水解微生物細胞壁上的 N-乙酰胞壁酸的糖苷位點，進入細胞內并破壞其結構，最終殺死病原物[26]。從經免疫誘導過的大蠟螟、家蠶Bombyx mori L.和甘薯天蛾Agrius convolvuli中純化得到溶菌酶，對真菌和革蘭氏陽性細菌均具有顯著的抑制效果[37]。凝集素（Lectin）也是一種糖結合蛋白，通過改變真菌膜結構或滲透性直接抑制真菌生長，也可以通過連接到真菌細胞壁的糖蛋白上間接地影響菌絲的生長。

真菌通過多種方式躲避或抑制寄主免疫。在穿過體壁后初期，真菌在寄主血腔內以原生質體、類似原生質體和囊胞子等酵母狀形式存在，以短菌絲出芽方式繁殖。這種生長形式一方面有助于在體血腔中的分散與群集，通過增加表面積獲取更多的營養(yǎng)物質，快速繁殖，以數量優(yōu)勢“逃避”宿主有限細胞的免疫反應[38]；另一方面，這類細胞表面的細胞壁多糖很少，可最大限度不激發(fā)或躲避寄主的免疫反應[39]。病原真菌通過分泌各種毒力因子對抗寄主體液免疫和導致寄主病變，如將金龜子綠僵菌破壞素Destruxin A注射到果蠅體內，可導致各類抗菌肽的表達量都下調[40]。金龜子綠僵菌在蝗蟲血淋巴中分泌含鋅的羧肽酶MeCPA和酸性磷酸酯酶，前者可消化寄主體內蛋白作為自己的營養(yǎng)來源，后者則改變其寄主血淋巴中與信號轉導相關蛋白的磷酸化狀態(tài)，進而干涉寄主體內免疫活動[41]。綠僵菌分泌的海藻糖酶能夠有效降解昆蟲血淋巴中的海藻糖為葡萄糖，獲取能量吸收，破壞昆蟲的血液生理，從而對昆蟲起著致命的作用[42]。真菌分泌的氨，作為一種毒力因子，改變血淋巴 pH，破壞昆蟲組織和干擾昆蟲的免疫系統(tǒng)，間接減弱寄主免疫反應[43]，同時真菌通過酶的代謝產物改變環(huán)境pH，使各種酶在最適宜的pH條件下產生并發(fā)揮有效功能[44]。

1.3 躲避寄主細胞免疫

昆蟲細胞免疫是由血細胞介導，完成對病原物或異物的吞噬、包囊和結節(jié)等一系列免疫應答反應。免疫細胞主要有血淋巴中的漿細胞和粒細胞，漿細胞具有吞噬功能，而粒細胞可包囊大分子物質并去核化形成結節(jié)[45]。

當把綠僵菌孢子注射到金龜子幼蟲體內，血淋巴中會形成典型的包囊體，孢子在包囊體內被黑化，喪失萌發(fā)能力[46]。當昆蟲受傷時，血細胞會在傷口處迅速凝結，阻止血淋巴流失，防止病原微生物侵入[38]。細胞免疫通常與體液免疫協(xié)同作用，圖1中（右側）AMPs由脂肪、表皮細胞和血細胞產生，血淋巴中血細胞識別真菌，并產生吞噬作用和包囊反應。

病原菌主要通過3個方面逃避昆蟲的細胞免疫：（1）殺死血細胞及抑制細胞吞噬和結節(jié)形成；（2）利用體表的脂類成分來逃避昆蟲血細胞的免疫識別和包裹；（3）分泌毒力因子，金龜子綠僵菌侵入煙草天蛾血腔后，大量表達MCL1蛋白覆蓋于菌體表面，以此來逃避煙草天蛾幼蟲血細胞的免疫識別[47]。萊氏野村菌Nomuraea rileyi感染棉鈴蟲Helicoverpa armigera后，在寄主血淋巴中分泌毒蛋白或次生代謝物等毒力因子，通過破壞血細胞的細胞骨架，抑制其延展能力，阻遏了血細胞的免疫反應，從而能夠成功地在棉鈴蟲血腔中生長和繁殖[48]。

病原真菌分泌的毒素可抑制寄主細胞免疫反應。已知的毒素主要有白僵菌素（beauverolides）、環(huán)孢素（cyclosporin）和破壞素（destruxin）等。已知破壞素由 6個氨基酸殘基通過酯鍵首尾相連形成環(huán)縮肽，環(huán)外加上不同類型羥基酸和氨基酸殘基，至少有19種類型[49]。綠僵菌通過釋放破壞素抑制沙漠蝗和美洲大蠊Periplaneta americana Linnaeus的酚氧化酶活性，破壞其參與體液免疫功能[50]，而白僵菌感染甜菜夜蛾后，能夠抑制寄主酚氧化酶的激活，使酚氧化酶的活性和分布明顯降低[51]。研究發(fā)現，破壞素通過改變寄主細胞的Ca2+平衡和細胞內高分子蛋白的磷酸化來抑制吞噬細胞的粘附和擴散能力，并影響漿細胞的細胞骨架形成[52]，破壞素還可引起昆蟲細胞的程序性死亡，從而減弱寄主的免疫能力[53]。結合表型反應，破壞素可激活肌肉細胞的Ca2+通道，引起昆蟲痙攣后麻痹而死[54]；有些破壞素可影響寄主蛻皮激素合成，從而影響昆蟲的變態(tài)，如抑制煙草夜蛾新生4齡幼蟲向5齡的轉化進程[55]。生理和病理的多重作用導致寄主機體病變直至死亡。

2 防蝗菌株選育

2.1 殺蟲真菌種類

在自然條件下病死的昆蟲中，有約60%起因于真菌感染罹病所致。全世界已報道的昆蟲病原真菌有約1000種。在早期，一些昆蟲病原真菌常常只見其無性循環(huán)的過程形態(tài)，如菌絲、分生孢子等，但未見或未知其有性循環(huán)過程，因此暫且歸為半知真菌類（門或綱）。隨著研究的深入和分子系統(tǒng)學的發(fā)展，現在半知真菌類的屬種多數都能夠鑒定到相應的有性型，重新歸入分類系統(tǒng)的適當地位,“半知菌（Imperfecti fungi）”、“不完全菌綱（Deuteromycetes）”等名稱已經被放棄[56,57]。按照目前的系統(tǒng)發(fā)生學，真菌類主要分7門和4個單列亞門[58,59]（圖2），其中子囊菌門Ascomycota和擔子菌門Basidiomycota為高級進化類群；接合孢菌（Zygosporic fungi）和游動孢子菌（Zoosporic fungi）進化相對初級，且不是單系進化，形態(tài)學上顯示多樣化；而微孢子菌門Microsporidia為低等真菌，最初認為是散發(fā)的胞內寄生物，歸為原生動物 Protozoa，現根據多基因座測序和基因組學的證據表明應屬于真菌類[60,61]。

圖2 真菌門類和大約物種數關系圖示[59]Fig. 2 Diagrammatic representation of relationships of fungal taxa and approximate number of species in each phylum or subphylum[59]

昆蟲病原真菌多屬于蟲霉亞門的蟲霉目Entomophthorales和子囊菌門的肉座菌目Hypocreales，還有一些屬于壺菌門 Chytridiomycota、球囊菌門Glomeromycota、擔子菌門Basidiomycota和微孢子菌門 Microsporidia[59]。一般蟲霉目真菌的寄主比較專一，而肉座菌目真菌多數有較寬泛的寄主范圍（表1）。在傳統(tǒng)的形態(tài)學分類系統(tǒng)中，有的物種可能是復合種或含有不同種群類型，例如，最為常見和研究最多的球孢白僵菌Beauveria bassiana和金龜子綠僵菌已積累眾多菌株，顯示具有高度的遺傳多樣性，近年分子系統(tǒng)研究已經可以較好地區(qū)分和細化綠僵菌屬和白僵菌屬內物種和類型[62,63]。即使同一物種，不同株系在寄主范圍、侵染水平、萌發(fā)率等方面也有所差異，表現了株系種群對不同環(huán)境的適應性?？傮w上。昆蟲病原真菌寄主范圍涵蓋了昆蟲綱中的大多數目類，至少有800種。最常見的綠僵菌屬和白僵菌屬寄主分別有200多種和700多種，包括鱗翅目Lepidoptera、鞘翅目Coleoptera、直翅目Orthoptera、同翅目Homoptera等中的多種重要農林害蟲[64]。

表1 重要昆蟲病原真菌屬種的分類地位和寄主Table 1 Taxonomic status and hosts of important genera and species in entomogenous fungi

續(xù)表1

雖然蝗蟲類群龐大，直翅目蝗總科共有8科含1萬余種，中國已知700余種，但豐富的病原真菌種類為蝗蟲生物防治提供了廣泛資源。在蟲霉亞門的蟲霉目和子囊菌門的肉座菌目中都發(fā)現了蝗蟲的病原真菌。蟲霉目研究較多的是蝗噬蟲霉復合體 Entomophaga grylli complex，其至少包括 4種致病型，I型 E.macleodii主要寄生斑翅蝗亞科Oedipodinae的蝗蟲；II型E. calopteni主要寄生黑蝗亞科Melanoplinae的蝗蟲；III型E. praxibuli兩亞科均可寄生；IV型E. asiatica是從日本的一種蝗蟲體分離得到的。用分子標記可將它們區(qū)分鑒別，我國主要有蝗噬蟲霉I型。噬蟲霉類真菌可采用接種蟲體培養(yǎng)，對人工培養(yǎng)基要求較高，如需要牛奶、蛋黃或加牛血清等，目前還難以大量繁殖利用。肉座菌目廣泛存在于自然界，是蝗蟲的主要病原真菌，包括綠僵菌 Metarhizium屬的金龜子綠僵菌、蝗綠僵菌 M. acridum、黃綠綠僵菌 M.flavoviride，白僵菌屬Beauveria的球孢白僵菌、曲霉屬Aspergillus的黃曲霉A. flavus等。綠僵菌和白僵菌是蝗蟲的主要寄生性病原真菌，種群類型多、致病力強且易于人工培養(yǎng)，尤其綠僵菌具有對蝗蟲的致病性優(yōu)勢，成為國內外研究與開發(fā)利用的熱點，并不斷取得可喜進展。

2.2 菌株篩選評價

通常可以從病死蟲體上或從土壤中分離獲得菌株，在實驗室對靶標害蟲和其他昆蟲接種進行生物測定，評估菌株的殺蟲毒力和寄主范圍，同時接種在培養(yǎng)基上，評估菌株的碳氮源等營養(yǎng)需求、適宜溫度、pH范圍、生長速率和產孢量等參數。在著名的撒哈拉地區(qū)蝗蟲生物防治國際合作LUBILOSA項目（1989—2002）中，英聯(lián)邦國際生物防治研究所聯(lián)合國際熱帶農業(yè)研究所等多國團隊，從西非、也門、馬達加斯加等地區(qū)的土壤或病蝗中分離出300多個對蝗蟲有效感染的真菌菌株，進行了大規(guī)模生物測定以篩選高毒菌株，還評估了菌株遺傳穩(wěn)定性、產孢能力、孢子穩(wěn)定性、對紫外線和高溫的抗性、田間有效性、對非靶標生物的安全性、對環(huán)境的影響和循環(huán)性等特性，確定了高效的金龜子綠僵菌IMI330189等菌株以及球孢白僵菌、小團孢屬Sorosporella sp.的幾個優(yōu)良的潛力菌株。菌株IMI330189最初鑒定為黃綠綠僵菌，后來根據Driver等[65]的分子系統(tǒng)訂正為金龜子綠僵菌蝗變種M. anisopliae var. acridum，后來在Bischoff等[62]的多基因位點分類中將其獨立為蝗綠僵菌M. acridum。該菌株為項目的順利開展和后來產品的研發(fā)商業(yè)化奠定了基礎。

在澳大利亞，針對當地災害性蝗蟲Chortoicetes terminifera、Phaulacridium vittatum、Locusta migratoria、Austracris guttulosa、Valanga irregularis等進行了生物測定篩選，獲得了高毒力的金龜子綠僵菌FI-985菌株[66,67]。在國內，1993年中國農業(yè)科學院生物防治研究所通過國際合作，自英聯(lián)邦國際生物防治研究所（IIBC）引進了防蝗系列菌株，并對東亞飛蝗進行了毒力測定，顯示菌株Arsef 324（后來確定為金龜子綠僵菌）和IMI330189有較高毒力[68]；同時該研究所科研團隊也從本土菌株中篩選到對東亞飛蝗、亞洲飛蝗、意大利蝗、亞洲小車蝗等高毒力菌株。其他研究者也先后報道了不同地區(qū)采集分離的高毒力的防蝗菌株[69,70]，以及利用溫度梯度熱激脅迫、誘導提升耐熱性和抗UV-B的防蝗優(yōu)良菌株[71]。

2.3 菌株遺傳改良

為了提高菌株殺蟲毒力和抗逆生存能力，可以利用生物技術進行菌株改良。真菌遺傳改良方法主要利用有性（或準性）循環(huán)、原生質體融合、輻射誘變和基因工程途徑來實現。真菌有性循環(huán)和準性生殖（parasexual reproduction）是兩個異性生殖細胞或異核菌絲體結合，通過染色體交換產生遺傳重組的個體。真菌繁殖過程中普遍存在異核現象和準性生殖。利用準性生殖，可以將兩種基因型不同的具有親和性的個體進行體細胞雜交（準性雜交），得到預期新性狀的個體。用綠僵菌野生型菌株與營養(yǎng)缺陷突變株作材料證實了準性雜交現象，并獲得二倍體重組體且具有較高的產孢率和較強的致病性[72]。

輻射誘變除了常規(guī)的紫外照射處理，航天搭載能夠使生物種質在太空環(huán)境的強輻射、超速度、高真空、微重力等因素的復合作用下，發(fā)生大幅度的生理變異和遺傳變異，因而成為高效率育種手段。從航天搭載后的綠僵菌突變株中檢測到的形態(tài)、生長速度、產孢量、致病力等多項生物學特性發(fā)生了不同程度的變異，變異率高，變異趨向有正負雙向性，其中一些突變株的生長特性和致病力優(yōu)于原始菌株[73]。

原生質體融合是指不依靠生物體本身所具有的性別能力，而是人為地利用酶降解去除細胞壁，在滲透壓穩(wěn)定和pH適宜條件下，通過電脈沖或化學助溶劑使細胞融合，細胞壁再生后獲得新種細胞。這種方法可以克服菌絲不相容性，甚至能跨越種、屬間的界限，實現遠緣雜交。以原生質體進行紫外照射處理可獲得較高的誘變效率。以白僵菌和綠僵菌為例，將0.5%纖維素酶和0.5%蝸牛酶的混合酶液、0.6 mol/L NH4Cl或KCl為滲透壓穩(wěn)定劑；在pH 6.5時30 ℃處理菌絲，可從1 g濕菌絲中獲得5×107個以上的原生質體[74,75]。以球孢白僵菌和金龜子綠僵菌為出發(fā)材料，進行相同物種不同菌株之間、不同屬物種之間的原生質體融合試驗，以 β-葡萄糖醛酸苷酶和 KCl作裂解酶和滲透穩(wěn)定劑，以聚乙二醇（PEG）為融合劑，融合再生率達到 0.84%～1.08%，獲得了菌絲生長快和產孢量高的融合子，并發(fā)現由白僵菌和綠僵菌原生質體融合的重組菌株中，胞外蛋白酶Pr1和Pr2的活性比親本增加了兩倍[76]。對蛹蟲草Cordceps militaris原生質體進行紫外誘變處理，篩選出兩株蟲草多糖和子實體產量都明顯高于原始菌株的優(yōu)良菌株[77]。

遺傳工程改良菌株是近年的主要方向，至今已發(fā)現一些昆蟲病原真菌的毒力基因、抗逆基因及其調控相關基因，外源基因的導入方法日臻成熟。向絲狀真菌中轉化外源 DNA的方法有農桿菌介導，或制備原生質體并借助PGE-CaCl2促進融合，或借助電脈沖來完成轉化。蟲生真菌抗性育種中，第一個利用基因轉移技術的成功范例是構建重組質粒 pBENA3，將構巢曲霉 Aspergillus nidulans的抗苯菌類基因BenA3導入金龜子綠僵菌的原生質體，轉化率為9個轉化子/50 μg DNA/2×106原生質體，轉化菌株對苯菌靈的抗性比原菌株高 10倍[78]。基因工程對昆蟲病原真菌遺傳改造的另一個突破性進展是試驗選擇了MCL1作為啟動子，利用綠色熒光報告基因，首次將一種北非蝎的昆蟲?；陨窠浂舅囟嚯腁aIT（中性蝎毒）反編碼成真菌基因，構建了帶有抗性標記的替換質粒，經原生質體轉化后，篩選抗性菌落，在受控操縱子的調節(jié)下使金龜子綠僵菌在侵染至昆蟲體內時高水平表達。轉化的工程菌株顯著提高了殺蟲速率，對煙草天蛾的毒力提高22倍，對埃及伊蚊Aedes aegypti的毒力提高9倍；與此同時，還顯著減少了昆蟲的活動性，降低了昆蟲的取食率[79]。還有，把來自一種鉗蝎Buthotus judaicus的殺蟲蝎毒素（Bj alpha IT）基因整合到蝗綠僵菌中，增強了對東亞飛蝗的毒力，使 LC50降低了 18.2倍，局部接種和注射工程菌的LT50分別減少了28.1%和30.4%[80]。近年研究陸續(xù)發(fā)現了更多的昆蟲病原真菌毒力相關基因、抗逆生長相關基因和產孢調控基因等，都可作為菌株遺傳改良的好材料。將酯酶基因（MestI）從通常廣譜寄主的羅伯氏綠僵菌M. robertsii轉移到特定的蝗綠僵菌，擴大了宿主范圍[81]。如黑色素酶（melanin）在金龜子綠僵菌中的表達使得菌株對紫外線和高溫的抵抗力增強[82]；將高效的古細菌光解酶（photolyase）基因整合到羅伯氏綠僵菌基因組中，可以提高真菌的光修復能力，從而提高對陽光的抵抗力[83]；黃綠綠僵菌菌株用于防治巴西蚱蜢Rhammatocerus schistocercoides，轉化了苯菌靈抗性基因（beta-tubulin gene）后，高抗轉化子對苯菌靈抗性提高了 30倍，在非選擇性培養(yǎng)基上連續(xù)轉代 20次后仍保持抗性穩(wěn)定，而且一些糜蛋白酶（Chymoelastase，Pr1）分泌量比野生型更大，分生孢子萌發(fā)率更高，在生產和應用上更具潛力[84]。

3 規(guī)?；a與應用

在獲得對蝗蟲高致病力菌株的基礎上，還需要根據菌株生長特性，建立大量培養(yǎng)或規(guī)?；a的方法，以獲得足夠的批量產品。

3.1 規(guī)模化生產

3.1.1 液固兩相發(fā)酵工藝 大多數昆蟲病原真菌具有由分生孢子-萌發(fā)-菌絲體生長-產生分生孢子的無性繁殖過程，此過程增殖快，分生孢子是侵染昆蟲的基本單元。因此，可利用營養(yǎng)生長和產孢的生活史兩個階段進行人工介入，通過發(fā)酵實現菌劑的規(guī)?；a。菌株營養(yǎng)和環(huán)境條件是調控生長和產孢的關鍵因子，有很多關于不同種類真菌或菌株的營養(yǎng)要求和生長環(huán)境條件的研究報道。總體來看，多數真菌或菌株均有一定適宜范圍的碳源、氮源、無機離子和微量元素，溫度、濕度、pH和耗氧性，因此相關研究有較大的共通性。綠僵菌和白僵菌的大量培養(yǎng)和規(guī)模生產的方法和基本工藝流程大致相同，可以進行液體深層發(fā)酵（Submerged fermentation）、固態(tài)發(fā)酵（Solid-state fermentation）和液固雙相發(fā)酵（Liquid-solid two-phase fermentation）。固體發(fā)酵相對于液體發(fā)酵的優(yōu)缺點列于表2。液固雙相發(fā)酵是以大量增殖的菌絲體接種到固體基質，雖延長了流程，但較好地取長補短，發(fā)揮液、固相發(fā)酵優(yōu)勢。3種類型發(fā)酵參數各有不同，最終產物也不同。液體發(fā)酵的產物是菌絲體、芽生孢子或液生分生孢子，而固態(tài)發(fā)酵產物是氣生分生孢子。不同的產物形式各具特性，從產物的活性、穩(wěn)定性和發(fā)酵控制條件考慮，氣生分生孢子是適合于規(guī)?；a和應用的產品形式。為了獲得高產并降低成本，通常需要根據所選用菌株的營養(yǎng)需求和生長條件進行多因子優(yōu)化，以達到最優(yōu)效益。

表2 固體發(fā)酵相對于液體深層發(fā)酵的優(yōu)缺點[85]Table 2 Advantages and disadvantages of solid state fermentation in comparison to submerged fermentation

在LUBILOSA項目中，對高效防蝗菌株金龜子綠僵菌IMI330189進行了液體深層培養(yǎng)、固體表面培養(yǎng)和液固兩相培養(yǎng)研究。深層培養(yǎng)的菌絲體制成干粉，使用時可加水噴霧或噴灑，而在大米或小米表面培養(yǎng)獲得分生孢子粉，產量可達100 g/kg固體基料，使用時將孢子粉配置成油懸浮劑進行超低量噴霧[86]。比較幾種大量培養(yǎng)球孢白僵菌和擬青霉Paecilomyces fumosoroseus的培養(yǎng)基表明，在松散固體培養(yǎng)基中，大米最適合生長和孢子形成；在液體培養(yǎng)基中，椰子水最適合[87]。對綠僵菌金龜子和黃綠綠僵菌的大量標準化培養(yǎng)條件研究顯示，以大米為固相產孢基質，高密度聚乙烯袋為容器，接種分生孢子懸浮液，在25 ℃下孵育15 d，產孢水平分別達到30×108和70×108CFU/g，顯著高于接種孢子經液體培養(yǎng)基培養(yǎng)2 d的產物[88]。對金龜子綠僵菌IMI330189的液體發(fā)酵動力學進行研究，利用Sigmoid函數構建了該菌株液體發(fā)酵過程中的菌體生長和底物消耗的動力學模型，所建模型能夠較好地擬合金龜子綠僵菌IMI330189液體發(fā)酵過程，并擬合求解出各模型參數，優(yōu)化參數后，生長速率在發(fā)酵第22.8 h達到最大值，為0.084/h；總糖比消耗速率在第9.6 h達到最大值，為0.246/h；總氮比消耗速率在第10.3 h達到最大值，為0.007/h；菌體對總糖的得率系數在39.8 h達到最高，為0.861 g/g[89]。比較2株金龜子綠僵菌菌絲生長及次代產孢的環(huán)境因素，經過優(yōu)化得到最佳培養(yǎng)條件，菌株1為28 ℃、pH 7、裝液比為75 mL/250 mL、加入微量元素Mn、全光照培養(yǎng)；菌株2為28 ℃、pH 9、裝液比為75 mL/250 mL、加入微量元素Cu，黑暗培養(yǎng)時生長最好、次代產孢量最高?？梢姴煌陮庹?、通氣、微量元素的需求有明顯差異[90]。

對于固體培養(yǎng)，基質有多種選擇，可直接用谷物?；蚴杷奢d體加谷物粉為主的營養(yǎng)配方，并采用適宜的溫度、光照等控制條件，主要考慮最終產孢量和價格成本。在金龜子綠僵菌的三級固體放大培養(yǎng)中，以90%麥麩加10%玉米粉作為發(fā)酵培養(yǎng)基，加水量約60%，經過優(yōu)化，得到最佳產孢培養(yǎng)條件為初始基質pH 6.0、27 ℃、避光，培養(yǎng)6 d孢子產量可達1.21×1010孢子/g干培養(yǎng)基[91]。研究表明，蛭石和稻殼均可作為綠僵菌固相培養(yǎng)的優(yōu)良載體，玉米粉和麥麩組合是良好的營養(yǎng)源，與不同載體配合的產孢量達到20×108孢子/g以上。液固接種比以8:10最佳；接種后適宜的基質含水量約為55%，產孢量達28.9×108孢子/g；恒溫培養(yǎng)時以25 ℃為宜，而采用調溫方式是先在25 ℃下培養(yǎng)16 d后轉移到21 ℃下再培養(yǎng)5 d，可獲得最高產孢量；光照調節(jié)對菌株生長和產孢有重要影響，前期暗環(huán)境培養(yǎng)14 d，再光照培養(yǎng)7 d的產孢量最高；高通氣量利于菌株生長和產孢[92]。為了降低固體基質成本，考察了重復利用大米基質的產孢量，通過響應面方法，確定重要變量為時間和溫度，相互作用為溫度×糖蜜和溫度×時間，重復利用大米基質和新大米同樣在25 ℃培養(yǎng)20 d內獲得了最高產孢率。鑒于糖蜜具有增加產孢作用但其濃度對產率并不關鍵，建議設定 5%以降低成本[93]。還有不少類似的研究結果，可構成金龜子綠僵菌規(guī)?；幕A平臺和技術參數。為了控制產品質量，建議使用基質碳、氮比作為控制指標，確定接種量、溫度等培養(yǎng)條件，使用農副產品為潛在基質，加上可循環(huán)利用的油形成配方，這可能是一種低成本且對環(huán)境可持續(xù)的規(guī)?；a技術[94]。

3.1.2 其他培養(yǎng)方式 金龜子綠僵菌的分生孢子的另一種形成方式是微循環(huán)產孢。孢子萌發(fā)后，當培養(yǎng)條件適宜時，可不經過營養(yǎng)菌絲生長階段，或營養(yǎng)菌絲生長受到極大限制時，就直接重復產孢[95]。理論上，如果能夠控制好微循環(huán)產孢條件，將可以縮短發(fā)酵周期，降低生產成本，但這種微循環(huán)產孢方式只在一些菌株觀察到，并與培養(yǎng)成分和培養(yǎng)條件密切相關，且不易控制，產量有限。

微菌核（microsclerotia，MS）是絲狀真菌生活史中一種較常見的特化結構，是由菌絲緊密連接交織而形成的黑化、緊實的休眠體，可形態(tài)多樣、大小不一。菌核外面通常有一層由緊密相連的菌絲頂端構成的皮層，中間菌髓由松散的、寬大的菌絲構成，是微菌核的主要部分，菌髓的細胞中聚集了許多營養(yǎng)物質，使其能夠應對不良環(huán)境。當環(huán)境適宜時，能萌發(fā)產生新的營養(yǎng)菌絲或分生孢子等繁殖體。這種結構的抗逆性和穩(wěn)定性具有十分誘人的開發(fā)潛力。第一例報道的昆蟲病原真菌微菌核是在金龜子綠僵菌發(fā)酵培養(yǎng)中發(fā)現的，由此提出了以微菌核作為一種產品的新形式。研究還報道，微菌核只能在液體深層發(fā)酵后期才能生成，碳源濃度與碳氮比影響微菌核的產量，碳源濃度為36 g/L、碳氮比在30:1和50:1時MS的產量最大，分別達到2.7×108和2.9×108MS/L，產微菌核方法獲得了美國專利[96]。

綠僵菌破壞素的培養(yǎng)條件也被積極探討，以期開發(fā)作為殺蟲劑。用響應面法優(yōu)化了金龜子綠僵菌破壞素A的培養(yǎng)條件，得到1個擬合程度高、誤差小的模型，該模型給出的最佳培養(yǎng)條件為：蔗糖22.7 g/L、蛋白胨13.4 g/L和發(fā)酵時間9.70 d，預測綠僵菌破壞素A最大質量濃度為6.90 μg/mL，實際測得質量濃度為6.89 μg/mL[97]。此結果為綠僵菌大規(guī)模發(fā)酵獲得破壞素產品提供理論依據，有望使綠僵菌毒素得到廣泛的開發(fā)和應用。

芽生孢子是通過出芽方式產生的無性孢子，許多真菌在液體發(fā)酵中都可以大量產生。在3 L容量的攪拌釜式生物反應器中，通過響應面方法得到了優(yōu)化的蝗綠僵菌M. acridum芽生孢子生產的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵參數，玉米漿69.25 g/L、酪蛋白80.68 g/L加磷酸氫二鉀15.17 g/L，控制條件為26 ℃，pH 3.3，恒定攪拌速度635 r/min，發(fā)酵120 h，可獲得最大產量1.25×108芽生孢子/mL[98]。這些可作為擴大規(guī)模生產的基礎。但由于芽生孢子難于保存，至今未得到推廣。

3.2 制劑工藝

為了提高田間應用效果，還需要研制菌劑配方和改進加工技術，以保持菌劑中真菌的活力，并使之滿足貯存、運輸和田間施用的要求。

早期的昆蟲病原真菌田間應用都是直接采用發(fā)酵產品，并不受制劑加工，產品貯存和施用方式的限制。為了便于產品貯藏、施用和提高防效，需要將生產的菌體制劑化。制劑化的產品有利于標準化和登記管理，是產品商業(yè)化的重要前提。產品制劑化技術隨著生產技術和規(guī)模的發(fā)展不斷改進和成熟，但由于商業(yè)利益的原因，制劑關鍵技術很少公開，只能從產品數量、用量及有限的文獻中獲知一些信息。以綠僵菌為例，2015年，全球有13個國家或地區(qū)的83個綠僵菌產品注冊在案，適用于蝗蟲防治應用的主要有可超低量噴霧的油懸浮劑（有的稱油劑，應糾正）[99]，在不同環(huán)境和使用器具條件下可濕性粉劑、粉劑、餌劑也適于應用。

當初開展防治沙漠蝗國際合作項目 LUBILOSA的一個重要基礎是英國已經研發(fā)獲得了綠僵菌的油懸浮制劑，他們篩選到適宜的油基，能夠在應用時很容易地將孢子均勻懸浮在油基中，制成可超低量噴霧的配方。該制劑優(yōu)點是使感染性孢子很好地附著于昆蟲表皮，同時孢子在油滴中得到保護，可避免在高溫低濕環(huán)境下因快速失水干燥而失活。后來該產品經過毒理安全性、環(huán)境安全性評估，最終由南非的BCP公司和法國的NPP公司成功開發(fā)，在幾個非洲國家獲得注冊，商品名為“GreenMuscle”，被FAO準許為蝗蟲防治產品，并大量生產，多年在非洲和亞洲多個國家用于防治沙漠蝗[100]。

澳大利亞針對當地嚴重為害的蝗蟲，也成功研發(fā)了高毒力金龜子綠僵菌FI-985的油懸浮劑，獲得澳大利亞聯(lián)邦科學與工業(yè)研究組織（Commonwealth Scientific and Industrial Research Organization，CSIRO）許可登記注冊，商品名為“Green Guard”，并由SGB Australia Pty Ltd公司進行了大量生產，多年用于蝗災防控，取得了巨大的成功。應用表明綠僵菌對其他昆蟲、水生環(huán)境都沒有不利影響，且無殘留物，是對環(huán)境可持續(xù)發(fā)展友好的產品。Green Guard油懸浮劑（金龜子綠僵菌60億孢子/mL）產品曾在2008年由澳大利亞貝克安德伍德公司在中國取得注冊登記和應用。在美國，已注冊了一種基于球孢白僵菌的產品，名為“Mycotrol”，可用于防治各種害蟲，包括蝗蟲和蚱蜢。

近20年來，我國真菌制劑研發(fā)和注冊登記進展加快，自2002年第一個真菌殺蟲劑獲得注冊登記，至今已登記的防蝗真菌農藥有6個（種次）金龜子綠僵菌和5個（種次）球孢白僵菌（表3），防治對象為飛蝗、草原蝗蟲、竹蝗等。近年來，有研究開發(fā)綠僵菌的餌劑、粉劑、可乳化粉劑，以利于在各環(huán)境下選擇適合的劑型應用。產品的防治對象為飛蝗、草原蝗蟲、竹蝗等。

表3 我國已注冊的真菌防蝗產品Table 3 Fungal pesticides registered for controlling locusts and grasshoppers in China

4 真菌防蝗技術和應用

4.1 真菌防蝗技術及其評價

真菌病害在蝗蟲中的自然流行機率很低，需要人工增殖并釋放到自然蝗蟲種群中，提高蝗蟲的感病率，才能將蝗蟲種群密度控制在經濟為害水平以下。

已報道了很多有潛力的蝗蟲病原真菌在田間的防效試驗，但付諸大規(guī)模應用的較少。應用產品主要是綠僵菌和少量白僵菌，劑型主要是孢子的油懸浮劑、可濕性粉劑，還有餌劑和粉劑。施用與評價方法參照化學農藥，以施藥處理后在較短時期內的蝗蟲死亡率作為指標?？傮w來看，報道的防效是在施菌后1周內可見蝗蟲死亡，在2～4周是死亡率上升期，4周后仍有少數死亡，總死亡率可達到60%以上，有的超過90%。由于產品中菌株毒力差異、劑型和施用方法差異等導致最終死亡率有較大范圍波動。相對于化學農藥，真菌的致死速率較慢而持續(xù)時期較長是一個顯然的事實和重要特征。

實際上，對于田間蝗蟲發(fā)生的不同情況如發(fā)生面積、發(fā)生量和種群發(fā)育階段等，可采用不同的防治方案，包括在嚴重發(fā)生區(qū)、農作區(qū)的應急控害方案和在荒漠區(qū)、蝗蟲幼齡階段的適度容忍持續(xù)控制方案。方案的選擇可依據經濟與生態(tài)損失評估來制定閾值。對于我國內蒙古草原，根據5種優(yōu)勢蝗蟲即亞洲小車蝗、毛足棒角蝗Dasyhippus barbipes、寬須蟻蝗Myrmeleotettix palpalis、狹翅雛蝗Chorthippus dubius和小蛛蝗Aeropedellus variegates minutus的自然種群結構和數量、蝗蝻和成蟲的平均壽命、不同發(fā)育階段的日食量等數據，通過估算蝗蟲造成的牧草損失，提出了優(yōu)勢種蝗蟲（3齡蝻期）的防治經濟閾值為17～38頭/m2，其中亞洲小車蝗最小（16.9）、小蛛蝗最大（37.4）[101]。對于不同區(qū)域的生產效益和生態(tài)承受能力，經濟閾值有所變化，特別對于天然草場和荒漠區(qū)，其生態(tài)功能更為重要。然而，由于生態(tài)因子較多且變化復雜，很少有蝗蟲防治的生態(tài)閾值的報告。生態(tài)閾值需要增加考慮生物多樣性資源指數、受害指數、干旱因子、補償易害指數等，一個可參考的生態(tài)閾值（Ecological threshold）簡化模型定義為：ET=[(-1)/(D×LnR)]×[K/FL_n＋CC/(FL_n×P×EC)]，其中R為草原投影蓋度；K為α%草原平均生產力水平；FL_n為蝗蟲混合種群每蟲損失估計；CC為防治費用；EC為防治效果；P為產品價格；D為干旱因子[102]。一項在內蒙古通遼草場進行的天然罩籠與人工模擬試驗，對主要為害的亞洲小車蝗不同蝻齡的取食量與產草量損失曲線進行了擬合，并且考慮了補償生長因子，確定該草場的防治指標應在5～15頭/m2，防治適期為3齡或3齡以前，并結合防蝗生態(tài)閾值模型，計算出當地草場的生態(tài)經濟閾值為11.04頭/m2，可見計算結果與試驗結果相符，說明采用生態(tài)經濟閾值比傳統(tǒng)的經濟閾值評估更貼合實際[103]。

在防蝗應急方案中，針對大量發(fā)生的遷移性蝗蟲，研究人員研發(fā)了菌藥互補、混配復配與間隔施藥等應急防控技術，可克服真菌起效慢的弱點，提高防治效果，同時有效減少化學農藥用量，有利于蝗蟲可持續(xù)防控。研究發(fā)現，金龜子綠僵菌與一些化學農藥具有協(xié)同增效作用。比較氯蟲苯甲酰胺（chlorantraniliprole）與金龜子綠僵菌處理的蝗蟲體上10種酶活性變化，表明谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）、酯酶（ESTs）和苯酚氧化酶（PO）的活性在初期被抑制，而超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和過氧化物酶（POD）的活性則在處理后的較晚期下降；芳基?；福ˋA）和幾丁質酶（CHI）在初期增加，而乙酰膽堿酯酶（AChE）在以后一段時間增加，它們分別在不同階段調節(jié)昆蟲對病原體的免疫和抗性能力。而且菌藥聯(lián)合處理增加了蝗蟲死亡率，研究者推測協(xié)同作用破壞了宿主中Ca2+的響應機制和宿主體內的狀態(tài)的平衡，從而誘導死亡[104]。經過兼容性篩選，確定了1%高效氯氰菊酯與100億孢子/mL的綠僵菌油懸浮劑復配，共毒系數為263；噴施處理東亞飛蝗，第5 d的死亡率達到90%以上，比單獨100億孢子/mL綠僵菌油懸浮劑處理提前7～8 d，并降低化學農藥用量90%，減少了對環(huán)境的非目標生物影響[105]。

荒漠區(qū)的經濟價值相對較低，蝗蟲幼齡階段為害相對有限，可適度容忍蝗蟲種群短期生存，此類情形適于應用真菌防控。施用的真菌可在幾天或十幾天內感染致病蝗蟲，抑制種群發(fā)展，并且在種群及環(huán)境中定殖下來，持續(xù)防治當代和后代蝗蟲。在非洲貝寧北部防控稻蝗Hieroglyphus daganensis的田間試驗期間，監(jiān)測到應用黃綠綠僵菌油制劑的感染性呈指數下降，半衰期為6.8 d，但殘存孢子可繼續(xù)感染蝗蟲并占施菌12 d時總感染量的40%～50%；還開發(fā)了一個簡單的宿主-病原體模型用于檢測殘留孢子在當季內和季后的感染，結果表明，殘留孢子濃度的少量增加可使總死亡率大大增加，在蝗蟲種群長效控制中起至關重要的作用[106]。在墨西哥使用蝗綠僵菌防治農田蝗蟲Sphenarium purpurascens試驗中，用分子方法和培養(yǎng)技術，監(jiān)測了噴灑的綠僵菌在空氣、土壤和營養(yǎng)覆蓋層中的生存持久性，表明在施菌后的 66個星期內，綠僵菌在地表持續(xù)存活，種群數量顯著波動，最高時達到初始濃度的4倍，后期逐漸下降到其初始濃度的一半左右?？諝夂蜖I養(yǎng)覆蓋層中綠僵菌濃度則穩(wěn)步下降，8個月后完全消失[107]。在我國內蒙古錫林浩特牧場，應用金龜子綠僵菌防治蝗蟲2年后，從試驗區(qū)23個隨機樣點采集土壤，進行了菌株特異性SCAR標記檢測，證明了施用的綠僵菌在田間可長期保持存活[108]。金龜子綠僵菌能夠在植物根際和根內的宿存是其維持田間種群的重要原因，在干旱的內蒙古草原監(jiān)測，綠僵菌施用后種群數量在30 d內快速下降，但能夠在蝗蟲喜食的羊草Leymus chinensis、針茅Stipa grandis根際土壤中以低密度延續(xù)宿存至少75 d；采用菌株熒光蛋白標記基因egfp的特異PCR檢測，證明了綠僵菌在羊草和針茅根內宿存[109]。

綠僵菌能夠在蝗蟲種群中擴散傳播，是維持長效防控的重要基礎。當種群中病蟲達到一定比例，綠僵菌疾病可由病蟲傳播給健康蟲體。亞洲小車蝗3齡蝗蝻的罩籠試驗表明，將綠僵菌處理3 d后的蝗蝻與未處理蝗蝻按 10:50、20:40、30:30、40:20混合飼養(yǎng)時，疾病傳播幾率分別可達 24.6%、31.0%、39.0%和52.0%。以同樣處理和比例進行短星翅蝗Calliptamus abbreviatus的混合飼養(yǎng)，疾病傳播幾率分別為15.6%、23.5%、32.7%和40.0%。進一步田間試驗發(fā)現，在圓形核心區(qū)施用綠僵菌后，施菌區(qū)外都出現蝗蟲感染，感染率隨時間的推移逐漸上升，在處理后40 d施藥區(qū)外400 m八個方向的疾病感染率均值可達8.95%。由此，研究者提出間隔施菌的技術方案，并進行了試驗評價，結果在間隔30、60、120 m 的間隔區(qū)域，施菌后49 d校正蟲口減退率分別達到 58.39%、63.41%、57.17%，證明了蝗蟲移動擴散的習性可以有效地將病原傳播到未處理區(qū)域，這種間隔施藥方式可以降低成本、提高效益，在推廣綠僵菌防治蝗蟲技術中有重要意義[110]。

4.2 真菌防蝗應用

鑒于沙漠蝗的大規(guī)模暴發(fā)和為了減少化學農藥的污染，聯(lián)合國糧農組織在 21世紀初成立了一個獨立的咨詢機構，即農藥裁判組（PRG），其作用是基于糧農組織獲得的各類科學數據，對可能用于蝗蟲防控的制劑提出有效性、環(huán)境安全性和對非靶標生物風險性等預測，為受蝗災影響的國家選擇合適的殺蟲劑提供建議。在咨詢的備用產品庫中，生物農藥綠僵菌和昆蟲生長調節(jié)劑被推薦為新的替代品[111]。在美國，為了防治西部種植區(qū)每年夏天的蝗蟲和蟋蟀侵擾，美國農業(yè)部農業(yè)研究服務局和相關科研機構專家建議采用綠僵菌、白僵菌等真菌殺蟲劑，并對種植者進行技術培訓[112]。在我國，20年來持續(xù)開展以綠僵菌為主的草原蝗蟲綠色防控技術研究和推廣，在內蒙古、新疆、甘肅等草原區(qū)域進行了大規(guī)模示范，自 2012年起綠僵菌產品被列入農業(yè)農村部防控蝗蟲災害的推薦產品。

利用綠僵菌防治蝗蟲是國內外微生物防治害蟲最成功的實例之一。國際合作 LUBILOSA項目成功研發(fā)了綠僵菌產品GreenMuscle，連續(xù)多年在撒哈拉地區(qū)和非洲其他地區(qū)應用。通常的用法是在2 L的油基中加100 g孢子粉，配置成均勻懸浮劑，超低容量噴霧用于1 ha，即用量大約5×1012孢子/ha。在貝寧3個區(qū)域的環(huán)境系統(tǒng)進行了防蝗示范，調查顯示，貝寧南部區(qū)域在施菌后10 d，蝗蟲5齡或成蟲的數量下降了90%；貝寧北部試驗區(qū)中，茂密的植被不適于噴霧，但蝗蟲的取食活動能從植物中補償到一定孢子，在施菌后14 d防效可達70%。在其他區(qū)域的示范也獲得了類似的結果[113]。項目結束后，產品繼續(xù)商業(yè)化應用于非洲、亞洲多國的沙漠蝗和其他蝗蟲防控。

另一個成功應用案例是綠僵菌防蝗產品 Green Guard被澳大利亞蝗災管理委員會 APLC（Australia’s Plague Locust Commission）批準，在1998年11月到1999年3月間，用于超低容量的飛機噴灑，在東亞飛蝗的若蟲發(fā)生地帶進行防治。經調查，在高粱作物、開闊的草原或開闊的林地，施菌量3～4×1012分生孢子/hm2的條件下，處理后蝗蟲的存活率下降到10%以下。在較低劑量或茂密的林地中，蝗蟲種群下降較小，施菌處理后一周內，蝗蟲種群數量變化不大，但隨后移動范圍迅速減小、速度變慢。在植被高大、茂密的區(qū)域，噴灑后，幼蟲種群數量下降較慢，有的幼蟲移動范圍擴大，有的甚至移出處理區(qū)域。在用綠僵菌處理過的地帶，若蟲很少蛻變?yōu)槌上x，即種群受到了抑制。相比之下，在鄰近未經處理的地區(qū)有許多成蟲集群，必須使用化學殺蟲劑加以控制。澳大利亞APLC據此制定并實行了蝗蟲防控指導方案，為在集群小、直接為害力有限的若蟲階段開始介入處理。試驗示范明確了綠僵菌Green Guard能夠有效抑制本地低容度飛蝗種群，它可作為蝗害預防控制計劃的重要組成部分。綠僵菌對蝗蟲的致死作用較慢，但不會妨礙其在此類方案中抑制蝗害的作用[114]。中國在實驗室內和田間試驗下也評估了澳大利亞Green Guard產品的防蝗效果。在實驗室中，Green Guard產品導致東亞飛蝗4齡若蟲70%～80%的死亡率。在天津和河南省進行的田間試驗中，應用Green Guard油懸浮劑，使用背負式噴霧器處理了40 hm2（2002年）和160 hm2（2003年）草地，劑量為50～125 g孢子配制在1125～1500 mL油基中，用于1 hm2的超低容量噴霧，施菌處理8～11 d后，田間種群減少了65%～97%[115]。

在墨西哥，也利用綠僵菌防治包括蝗蟲在內的多種害蟲。根據國家農業(yè)食品質量安全管理局SENASICA（Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria）2017年的報告，在墨西哥不同州，應用蝗綠僵菌在 41698 hm2進行了施菌處理，以控制不同種類的蝗蟲和蚱蜢，包括 Schistocerca piceifrons piceifrons，Melanoplus sp.，Sphenarium sp.，Brachystola sp.[116]。

在埃及，對商業(yè)制劑Bioranza（金龜子綠僵菌）和Biovar（球孢白僵菌）進行了沙漠蝗防效評估，結果表明，無論對若蟲直接噴灑油性菌劑，還是通過土壤處理的間接施用，綠僵菌對蝗蟲的感染死亡率和快速效果均比球孢白僵菌高得多[117]。

在國內，中國農業(yè)科學院植物保護研究所（原生物防治研究所）從20世紀90年代初期開始昆蟲病原真菌防蝗應用研究，不僅評估了不同綠僵菌菌株對東亞飛蝗的毒力[67]，還在天津北大港水庫蝗區(qū)，以綠僵菌孢子不同濃度的油劑噴霧進行防蝗試驗，在田間處理后第10 d校正死亡率為81.5%，人工模擬小區(qū)試驗在第10 d供試蟲全部死亡[118]，另外進行了10 hm2的田間試驗，證明綠僵菌田間治蝗的良好效果[119]。20多年來，綠僵菌菌劑在北方多省區(qū)草原大面積應用。在新疆，用綠僵菌油劑防治干旱荒漠草原和山地草原蝗蟲試驗，表明真菌殺蟲劑油劑具有殺蟲譜廣（對蝗總科昆蟲均有效）、容易大規(guī)模生產、便于低容量噴霧和適于干旱氣候等優(yōu)點[120,121]。在內蒙古草原進行了用綠僵菌油劑超低量噴霧防治蝗蟲的試驗，表明菌劑對5種蝗蟲（亞洲小車蝗、紅翅皺膝蝗、毛足棒角蝗、白邊痂蝗、輪紋異痂蝗）的防效顯著。噴藥后8 d，對主要蝗蟲亞洲小車蝗（占混合蟲口的92.2%）的防治效果達48.0%，12 d后增至88.1%。死亡蟲體上的綠僵菌孢子的擴散有可能繼續(xù)起著控制蝗蟲蟲口密度的作用[122]。在甘肅用黃綠綠僵菌餌劑和油劑防治草原蝗蟲，蟲種有祁連山痂蝗Bryodema qilianshanenensis等幾種，投撒餌劑后用樣筐取樣調查，顯示7和12 d的平均防效為66.5%和76.7%；油劑試驗以靜電超低容量噴霧，防效高于綠僵菌餌劑，7和12 d的平均防效為75.8%和84.6%。施藥后3～4 d感病死亡的蟲態(tài)多為4～5齡若蟲，25 d后出現死亡成蟲，之后2周仍陸續(xù)有死亡蟲體，表明綠僵菌有較好持續(xù)控制效果[123]。多年來，在新疆、內蒙古、甘肅、青海等地都有大面積示范推廣試驗，表明綠僵菌制劑可迅速達到控制高密度蝗群的目標，還能實現長期傳播控制，致使蝗群不能為害成災[1]。綠僵菌產品還在河灘、湖區(qū)荒灘等蝗蟲滋生地防治東亞飛蝗的低齡蝗蝻[124,125]，有效抑制其種群發(fā)育，防止成蟲集群起飛，把可能對農區(qū)的大規(guī)模為害遏制在種群遷飛之前。

另外，還有廣譜的球孢白僵菌產品可用于防治蝗蟲及其他害蟲，如在美國注冊的產品Mycotrol可防治各種害蟲，包括蝗蟲和蚱蜢。LUBILOSA項目在西非的試驗中也測試了球孢白僵菌，但發(fā)現在田間環(huán)境的高溫度下，其效力不如綠僵菌菌株。在中國黑龍江齊齊哈爾索伯臺草原，應用白僵菌100億孢子/mL油懸浮劑防治草原蝗蟲，用量為2250～3000 mL/hm2，藥后7 d達到作用高峰，平均防效為68.24%～77.44%，防效可持續(xù)7 d[126]。在竹林中用球孢白僵菌防治黃脊竹蝗Ceracris kiangsu跳蝻，得到的校正死亡率達到68.2%[127]。

有記錄噬蟲霉類真菌可導致田間發(fā)生蝗蟲流行病，說明此類真菌對蝗蟲具有高致病力，也分離到相關菌株，但由于難以人工大量培養(yǎng)和貯存，至今未能用于蝗蟲防治實踐。

5 討論與展望

5.1 昆蟲病原真菌防蝗的優(yōu)勢與不足

昆蟲病原真菌資源廣泛，專性侵染昆蟲（節(jié)肢動物）而對脊椎動物無毒無害，與環(huán)境友好兼容，還具有對寄主不易產生抗藥性、許多種類可人工大量培養(yǎng)等優(yōu)點，使之成為最有前景的生物殺蟲劑。近 30年來，針對蝗蟲的研究進展顯示，從綠僵菌、白僵菌等種類可篩選出對蝗蟲高毒力的菌株，并且可通過常規(guī)篩選或遺傳改良來提高菌株毒力、生長性狀和抗逆能力，通過優(yōu)化培養(yǎng)基和可控條件大量培養(yǎng)菌劑，通過改善劑型技術來維持貯存活力和增強對蝗蟲的侵染，研究改善施用技術，使其盡可能適應蝗蟲習性和生態(tài)，以提高防治效果。利用綠僵菌和白僵菌防蝗已經從實驗室走向田間應用并商業(yè)化。

然而，研究和實際應用中仍存在一些問題，以至于產品注冊和大規(guī)模示范后也未能大規(guī)模持續(xù)商業(yè)化應用。究其原因，在研究和技術方面可能有以下幾點：1）蝗蟲種類繁多，而菌株殺蟲毒力通常只對某些蝗蟲種類強而對其他蝗蟲種類較弱，因此產品對不同區(qū)域的蝗蟲的防效有波動，而市場的普適性要求較高；2）根據自然規(guī)律，真菌對蝗蟲的致病過程需要一定時間，通常需要3～5 d甚至更長時間才能見效，而市場通常期待快速應對嚴重蝗害；3）真菌防蝗產品價格相對較高，即使已研究改進了發(fā)酵工藝，仍然由于工藝過程較復雜，活體貯存條件較高，在應用規(guī)模有限的情況下，成本競爭力仍不敵化學農藥；4）真菌制劑的使用技術要求相對較高，一般需要專業(yè)人員或需經過專業(yè)培訓，指導用戶使用時把握蝗蟲發(fā)育進度和掌握避免真菌失活的時機，以達到高效防治。

5.2 真菌防蝗應用的策略與展望

鑒于真菌防蝗產品的特點以及當前的研究進展，作者認為，在未來研究中，可進一步通過菌種的遺傳改良來提高菌株的毒力、普適性和殺蟲速度，通過改進發(fā)酵工藝降低產品成本，通過制劑技術提高田間殺蟲效果。然而，一個重要的防治策略是在蝗蝻幼齡期施菌干預種群發(fā)展以防止蝗災暴發(fā)。因為基于真菌與蝗蟲各自的生物學特點及其致病關系，蝗蟲在幼齡階段擴散較慢、為害較小。試驗證明，低齡期（2～4齡）比高齡期（5齡）或成蟲更容易感然病害；當出現末齡幼蟲或成蟲遷飛時施菌，可能效果甚微或無濟于阻止和減少已經造成的損害[64,128]。在幼齡蝗蝻期間施用菌劑如綠僵菌等，可使病原真菌在蝗蟲種群中侵染定殖，即使沒有快速引起多數蟲體發(fā)病死亡，也能夠抑制發(fā)育、減緩擴散，同時蟲體攜帶病原真菌移動擴散，一旦罹病死亡，便能夠大量增殖病原體并釋放出來，作為新的侵染源再度影響蝗蟲發(fā)育和種群擴張。另外，病原真菌具有田間擴散性和在根際土壤及植物體內中有一定的宿存能力[129,109]，加上一些制劑手段有助于真菌的宿存和增殖，有可能在蝗蟲棲境中長期保存一定密度的病原種群，借助環(huán)境因子實時捕捉機會侵染寄主，介入蝗蟲種群的消長，從而抑制蝗蟲種群暴發(fā)增長。

為了實施蝗蝻早期人工干預的策略，對蝗蟲滋生發(fā)源地帶的發(fā)現和監(jiān)測十分重要?；认x多在水域附近荒灘產卵孵化，這些區(qū)域通常遠離監(jiān)視，無人治理或無主管理，因此蝗蝻種群得以順利發(fā)展、集群乃至暴發(fā)遷飛到農田為害作物。對于無人治理或無主管理的蟲源地帶，因經濟效益低，還不能商業(yè)化進入，只能依靠政府和公益性組織的聯(lián)合，通過大數據如高空遙感監(jiān)測結合氣象與生物學信息等，發(fā)布監(jiān)測預警，及時組織人工干預或征購商業(yè)服務。

蝗災防控涉及經濟和生態(tài)的長期綜合管理，當前沙漠蝗嚴重擴張為害，再次引起各國政府和相關行業(yè)的重視。從真菌防蝗研究與應用進展上看，以綠僵菌為主的真菌防蝗技術已經相對成熟，無論在不同地區(qū)的防蝗效果或規(guī)?；a技術都能夠支持參與大規(guī)模蝗害防控，可作為蝗蟲防控的重要組成部分。根據其特點和防效評估，真菌防蝗更適于在蝗蝻期施用，以干預種群發(fā)展、避免暴發(fā)成災。通過技術完善和市場優(yōu)化，具有高效、長效和環(huán)境友好特性的昆蟲病原真菌產品必將在蝗災防控中發(fā)揮更重要的作用。