崔藝燕 田志梅 魯慧杰 鄧 盾 容 庭 李貞明 王 剛 馬現(xiàn)永,2*

(1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動物科學(xué)研究所/畜禽育種國家重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動物營養(yǎng)與飼料重點實驗室/廣東省畜禽育種與營養(yǎng)研究重點實驗室/廣東畜禽肉品質(zhì)量安全控制與評定工程技術(shù)研究中心，廣州 510640；2.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實驗室茂名分中心，廣東 茂名 525000)

中華人民共和國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號公告提出，2020年7月1日起飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料。然而，在禁抗大環(huán)境下，集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖導(dǎo)致的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)仍然是生產(chǎn)過程中無法忽視的嚴(yán)重問題，促生長抗生素的禁用直接或間接地限制了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。因此，尋找、開發(fā)經(jīng)濟適用的環(huán)保健康型飼用抗生素替代產(chǎn)品，對提高機體抗氧化能力和免疫功能，改善動物的生產(chǎn)性能和產(chǎn)品質(zhì)量具有重要意義。

近年來，植物源飼料添加劑引起了人們的廣泛關(guān)注，植物提取物作為抗生素替代產(chǎn)品在動物生產(chǎn)中的使用也有了顯著增加[1]。柑橘是常見的芳香植物，富含黃酮(橙皮苷、柚皮苷、橘皮素和川陳皮素等[2])、酚類、生物堿、萜類和維生素等功能活性物質(zhì)[3]，是人類飲食中總黃酮或特定黃烷酮的主要來源[4]。柑橘提取物成分明確，具抗氧化[5]、抗炎[6]、抗菌[5]、抗癌[7]和抗肥胖[2]等多樣的生理活性，在制藥、食品和保健品等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用，是潛在的飼用抗生素替代品之一。目前，我國柑橘資源具有種植范圍廣、產(chǎn)量大等特點[8]，其副產(chǎn)品是高值化合物的具有經(jīng)濟效益和可再生的資源。已有研究表明，柑橘提取物對豬痢疾短螺旋體菌株具有很好的殺菌效力[9]。柑橘黃酮類物質(zhì)會干擾致癌物質(zhì)的活化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖及癌基因活性[10]。此外，有研究表明，純化的柑橘活性化合物可提高綿羊機體的抗氧化能力[11]，也可促進仔豬[12]和羔羊[13]的生長。柑橘提取物也可提升肉雞[14]和仔豬[15-16]的免疫能力。

動物血液參數(shù)反映了機體的代謝狀況[17]。補充適量的活性成分或添加劑可以調(diào)節(jié)機體的代謝功能，改變整體健康狀態(tài)，減少集約化生產(chǎn)帶來的應(yīng)激危害[18]。橙皮苷可以減緩肝細(xì)胞氧化應(yīng)激，抑制肝損傷的發(fā)生[19]。目前，尚不清楚長期飼喂柑橘提取物是否會對豬機體抗氧化、免疫和肝損害等方面造成負(fù)面影響。因此，本研究通過分析柑橘提取物對肥育豬血液生化指標(biāo)、抗氧化能力、免疫功能和游離氨基酸的影響，旨在評估長期補充柑橘提取物對肥育豬機體代謝的狀況。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

金霉素購自廣東某飼料科技有限公司，柑橘提取物由廣東某環(huán)?？萍及l(fā)展有限公司提供。柑橘提取物含有3.04%維生素C、2.38%維生素E、2.89%檸檬酸和20.77%總黃酮。

選取108頭56日齡19.73±0.39 kg杜×長×大豬，公母各半。按體重隨機分配到3組，每組6個欄，每欄6頭豬。體重達(dá)120 kg時結(jié)束試驗。

1.2 試驗設(shè)計

空白組為基礎(chǔ)飼糧；抗生素組在基礎(chǔ)飼糧上添加75 g/t金霉素；柑橘提取物組在基礎(chǔ)飼糧上添加柑橘提取物(56～112 d 添加250 mL/t柑橘提取物，113～194 d添加200 mL/t柑橘提取物)。

1.3 試驗飼糧

基礎(chǔ)飼糧組成和營養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (air-dry basis)

1.4 飼養(yǎng)管理與采樣

試驗在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物科學(xué)研究所豬場進行。根據(jù)養(yǎng)殖場常規(guī)程序進行飼養(yǎng)管理。試驗結(jié)束，選取每欄接近平均體重的2頭肥育豬進行耳靜脈采血，分別采用肝素鈉抗凝管和普通管收集血液，共36頭豬。肝素鈉抗凝管血液顛倒混勻后室溫靜置30 min，經(jīng)3 500 r/min、4 ℃離心10 min，收集血漿，-80 ℃保存。普通管血液室溫靜置4 h，待血液凝固后經(jīng)3 500 r/min、4 ℃離心10 min，收集血清，-80 ℃保存。

1.5 生化指標(biāo)測定

采用血漿測定生化指標(biāo)?？偰懝檀?F002-1-1)、甘油三酯(F001-1-1)、葡萄糖(F006-1-1)、尿素氮(C013-2-1)、白蛋白(A028-1-1)、總蛋白(A045-2-1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(GOT，C010-1-1)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(GPT，C009-1-1)和堿性磷酸酶(AKP，A059-1-1)等測試盒購于南京建城生物工程研究所，具體步驟按說明書進行。

1.6 抗氧化指標(biāo)測定

采用血漿測定抗氧化指標(biāo)?？偟鞍?A045-2-1)、丙二醛(MDA，A003-2-2)、總抗氧化能力(T-AOC，A015-1-2)、總超氧化物岐化酶(T-SOD，A001-1-2)、過氧化氫酶(CAT，A007-1-1)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px，A005-1-2)等測定試劑盒均購買于南京建成生物工程研究所，具體操作按說明書進行。

1.7 免疫指標(biāo)測定

采用血清測定免疫指標(biāo)。豬白介素IL-2、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和豬免疫球蛋白IgA、IgM、IgG等測試盒均購自北京方程生物科技有限公司，具體操作按說明書進行。

1.8 游離氨基酸含量測定

根據(jù)文獻[15]的方法，游離氨基酸的含量通過自動氨基酸儀(L-8900，HITACHI，日本)測定。準(zhǔn)確吸取400 μL血漿，加入1.2 mL 10%的磺基水楊酸并充分混合。4 ℃，12 000 r/min離心15 min，用0.22 μm濾膜過濾上清液進行測定。

1.9 數(shù)據(jù)處理

用 SPSS 19.0進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，并用 Duncan 氏法進行多重比較。結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05為差異顯著，0.05≤P<0.10為有趨勢。

2 結(jié) 果

2.1 柑橘提取物對肥育豬血漿生化指標(biāo)的影響

由表2可知，柑橘提取物組和抗生素組血漿尿素氮含量差異不顯著(P>0.05)，但與空白組相比，這兩組尿素氮含量分別顯著降低了19.66%和15.53%(P<0.05)。與抗生素組相比，柑橘提取物有降低血漿總膽固醇含量的趨勢(0.05≤P<0.10)，與空白組無顯著差異(P>0.05)。3組間其他生化指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)。表明柑橘提取物改善了肥育豬血漿生化指標(biāo)，與抗生素效果相似。

表2 柑橘提取物對肥育豬血漿生化指標(biāo)的影響Table 2 Effects of citrus extract on the plasma biochemical indexes of finishing pigs

2.2 柑橘提取物對肥育豬血漿抗氧化能力的影響

由表3可知，柑橘提取物組和抗生素組血漿T-AOC 含量差異不顯著(P>0.05)。與空白組相比，柑橘提取物組T-AOC含量顯著提高了67.21%(P<0.05)，而抗生素組與空白組差異不顯著(P>0.05)。3組間其他抗氧化指標(biāo)無顯著差異(P>0.05)。表明柑橘提取物和抗生素提高了肥育豬抗氧化能力，二者功效相似。

表3 柑橘提取物對肥育豬血漿抗氧化能力的影響Table 3 Effects of citrus extract on the plasma antioxidant capacity of finishing pigs

2.3 柑橘提取物對肥育豬血清免疫指標(biāo)的影響

由表4可知，柑橘提取物和抗生素組血清IgA和IgM濃度差異不顯著(P>0.05)。但與空白組相比，抗生素和柑橘提取物組IgA濃度分別顯著提高了13.17%和15.50%(P<0.05)?？股亟M較空白組顯著降低了IgM濃度(P<0.05)，柑橘提取物組與空白組的IgM濃度差異不顯著(P>0.05)。3組間IL-2、IL-6、IL-8、TNF-α和IgG濃度均無顯著差異(P>0.05)。表明柑橘提取物改善了肥育豬的免疫功能，效果優(yōu)于抗生素。

表4 柑橘提取物對肥育豬血清免疫指標(biāo)的影響Table 4 Effects of citrus extract on the serum immune indexes of finishing pigs

2.4 柑橘提取物對肥育豬血漿游離氨基酸的影響

由表5可知，柑橘提取物組血漿亮氨酸濃度較抗生素組顯著提高了11.74%(P<0.05)，較空白組提高了11.10%(P<0.05)，抗生素組與空白組差異不顯著(P>0.05)。與空白組和抗生素組相比，柑橘提取物組脯氨酸濃度有提高的趨勢(0.05≤P<0.10)。柑橘提取物和抗生素組天冬酰胺、谷氨酸和丙氨酸的含量差異不顯著(P>0.05)，但與空白組相比，二者顯著提高了天冬酰胺、谷氨酸和丙氨酸的含量(P<0.05)。3組間其他氨基酸含量差異不顯著(P>0.05)。表明柑橘提取物提高了血漿游離氨基酸含量，效果優(yōu)于抗生素。

表5 柑橘提取物對肥育豬血漿游離氨基酸的影響

3 討 論

3.1 柑橘提取物對肥育豬血漿生化指標(biāo)的影響

血液是機體內(nèi)環(huán)境的重要組成，是機體與外界環(huán)境以及體內(nèi)各組織之間物質(zhì)交換的媒介[20]。本試驗重點分析柑橘提取物對肥育豬生理代謝的影響，各組間生長性能沒有顯著差異(未發(fā)表數(shù)據(jù))。機體的代謝狀況可以通過生物化學(xué)相關(guān)參數(shù)來反映。血液總蛋白、白蛋白和尿素氮可以反映動物蛋白質(zhì)的整體代謝[17]。在正常范圍內(nèi)，總蛋白和白蛋白含量越高，機體合成蛋白質(zhì)的能力越強。本研究表明，長期飼喂柑橘提取物和抗生素對肥育豬血漿總蛋白含量無影響。Akbarian等[21]研究報道，在熱條件下，200和400 mg/kg橙皮提取物可顯著提高肉雞血清總蛋白水平。與本研究結(jié)果不一致，這可能是肉雞和肥育豬的動物差異，以及不同提取物中有效成分種類、純度或組成不同導(dǎo)致的。尿素氮可以用作蛋白質(zhì)利用效率的指標(biāo)[22]。尿素氮濃度與氮沉積速率和蛋白質(zhì)利用率呈負(fù)相關(guān)[23]，若尿素氮減少，則表明氮利用效率增加或蛋白質(zhì)分解減少。本研究表明，長期飼喂柑橘提取物和抗生素顯著降低了血漿尿素氮的含量。這意味著柑橘提取物和抗生素增強了機體氮代謝、提高了氨基酸利用效率，改善了機體對蛋白質(zhì)的利用。柑橘提取物與抗生素具有相似的效果。

關(guān)于柑橘提取物對動物血脂代謝的報道很少。補充檸檬提取物可降低肥育豬膽固醇水平，但不會改變血液中甘油三酯的水平[24]。研究報道，與基礎(chǔ)日糧組相比，飼糧中添加柑橘提取物可降低肉雞和母羊血清總膽固醇含量[21,25]。而本研究表明，柑橘提取物未能降低肥育豬血漿總膽固醇的含量，而抗生素有提高膽固醇含量的趨勢。柑橘成分β-隱黃質(zhì)可顯著抑制肥胖小鼠血脂水平的升高，而對正常小鼠無明顯影響[26]。柑橘提取物對血脂的影響不一致，這與提取物成分和動物種屬密切相關(guān)。有研究表明飼喂抗生素14 d對小鼠血清總膽固醇和甘油三酯無影響[27]。本試驗長期飼喂抗生素對膽固醇的提高，可能由于抗生素的長期飼喂影響了機體的脂代謝。

GOT和GPT是反映肝功能的重要指標(biāo)，當(dāng)肝細(xì)胞受損或細(xì)胞膜通透性增加時，二者會滲透到血液中，增加血液轉(zhuǎn)氨酶活性[28]。有研究報道，口服柚皮苷的綿羊血清GOT活性顯著下降，表明柚皮苷對肝臟健康有改善作用[13]。在本研究中，長期飼喂柑橘提取物和抗生素的肥育豬血漿GOT和GPT水平與空白組均無顯著差異，這表明長期飼喂柑橘提取物和抗生素未對肥育豬肝臟造成損害。轉(zhuǎn)氨酶與氨基酸的代謝強度相關(guān)，在非必需氨基酸合成和蛋白質(zhì)分解過程起重要作用[29]。肝功能正常時，轉(zhuǎn)氨酶活性的提高表示蛋白質(zhì)合成和分解代謝速度加快。柑橘提取物在數(shù)值上提高了轉(zhuǎn)氨酶的活性，這也反映了機體蛋白質(zhì)和氨基酸合成代謝強度較快。這與尿素氮水平下降反映的蛋白質(zhì)利用率提高一致。

3.2 柑橘提取物對肥育豬血漿抗氧化的影響

氧化應(yīng)激會損害細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)和減少畜牧業(yè)生產(chǎn)?？寡趸负蚑-AOC是反映機體抗氧化能力的重要指標(biāo)[30]。MDA反映機體脂質(zhì)過氧化受損情況[31]。前述二者緊密相關(guān)，抗氧化酶活性隨脂質(zhì)過氧化增加而下降[31]。植物黃酮類化合物被認(rèn)為是動物生產(chǎn)中合成生長促進劑的天然替代品，可強化抗氧化防御機制[32]。研究報道，檸檬精油較基礎(chǔ)日糧組提高母羊T-AOC[25]。本研究結(jié)果表明，長期飼喂柑橘提取物顯著提高了肥育豬血漿T-AOC，與上述研究一致。與對照組和檸檬皮提取物組相比，橙皮提取物顯著增加肉雞血液GSH-Px活性[21]。高溫條件下口服柚皮苷可增加羔羊血漿SOD和GSH-Px活性[13]。橙皮苷通過提高T-AOC、SOD活性和降低MDA濃度，改善脂多糖脅迫肉雞血漿氧化狀態(tài)[33]。從以上研究可以看出，柑橘提取物具有較好的抗氧化能力，能減緩集約化生產(chǎn)導(dǎo)致的氧化應(yīng)激狀態(tài)。不同的是柑橘提取物對不同動物的作用效果存在差異，如對抗氧化酶活性和MDA含量的反應(yīng)不同。另外，還需考慮到提取物與純化物的組成、濃度、添加量和使用時間的影響。

3.3 柑橘提取物對肥育豬血清免疫指標(biāo)的影響

免疫球蛋白具有免疫調(diào)節(jié)功能，是體液免疫的重要指標(biāo)，對機體健康十分重要。IgA對機體提供被動免疫[34]。IgG參與免疫記憶，反映機體全身免疫狀態(tài)[37]。IgM產(chǎn)生于初級免疫應(yīng)答[36]。本試驗發(fā)現(xiàn)抗生素和柑橘提取物提高肥育豬血清IgA含量，抗生素降低了IgM含量。本課題組曾報道，柑橘提取物和抗生素能夠提高仔豬血清IgA和IgG含量，促進機體健康[16]。大鼠口服橙皮苷增加血清IgM的含量，對IgG和IgA含量無影響[37]。Pourhossein等[14]發(fā)現(xiàn)，甜橙皮提取物通過增加血清IgG和IgM的產(chǎn)生來增強肉雞的免疫力。攝入橙皮苷對致敏大鼠血清IgA無變化[38]。研究報道，抗生素飼喂小鼠14 d，克林霉素顯著降低血清IgA的含量，氨芐青霉素增加IgG的含量[27]。不同抗生素對機體免疫反應(yīng)的效果也是不一致的，這主要是由于抗生素的種類和作用機制決定的?？梢婇L期飼喂柑橘提取物對肥育豬免疫功能有一定改善作用。

3.4 柑橘提取物對肥育豬血漿游離氨基酸的影響

游離氨基酸的分布反映了來自所有組織和器官的營養(yǎng)素及其代謝產(chǎn)物的總代謝流[39]。游離氨基酸是肌肉蛋白質(zhì)合成所需氨基酸的主要直接來源，是機體蛋白質(zhì)更新的關(guān)鍵指標(biāo)[40]。本研究表明，長期飼喂柑橘提取物和抗生素的肥育豬血漿中丙氨酸、谷氨酸和天冬酰胺含量較高。這些氨基酸參與三羧酸循環(huán)和尿素循環(huán)。血漿中谷氨酸和天冬酰胺的濃度較高可能反映了對蛋白質(zhì)的消耗[41]。機體氨基酸分解較快時會使轉(zhuǎn)氨反應(yīng)加快，產(chǎn)生較多的氨，谷氨酸濃度也會升高[42]。過多的氨和谷氨酸在酶的催化下轉(zhuǎn)化為谷氨酰胺[43]，由于反應(yīng)可逆，谷氨酰胺處于動態(tài)平衡，其含量無顯著差異。柑橘提取物也提高了亮氨酸和脯氨酸的含量。這些氨基酸濃度的增加可能是由于氨基酸分解代謝增加所致?；蛘撸赡軞w因于飼糧中氨基酸的生物利用度增加。亮氨酸主要參與蛋白質(zhì)的合成與分解代謝過程，刺激蛋白質(zhì)合成，抑制蛋白質(zhì)降解[44]。亮氨酸含量的提高與尿素氮水平下降是一致的，這從另一角度說明，柑橘提取物改善了氮的消化率，增加了氨基酸利用度。Pi等[45]研究認(rèn)為，抗生素降低生長豬血清賴氨酸、精氨酸、谷氨酰胺和谷氨酸的濃度，而這些氨基酸的回腸表觀消化率增加或保持不變。這些影響可能是由于抗生素或柑橘提取物誘導(dǎo)的腸道微生物群氨基酸發(fā)酵的變化，尚需進一步研究驗證。

免疫刺激可以將氨基酸從蛋白質(zhì)保留重新分配到免疫應(yīng)答相關(guān)過程，從而影響氨基酸的利用[46]。丙氨酸、谷氨酸和亮氨酸在免疫過程中起重要作用[47-48]。柑橘提取物組丙氨酸、谷氨酸和亮氨酸含量的提高與IgA水平的提高一致，抗生素組丙氨酸和谷氨酸含量與IgA水平顯著高于空白組，這表明柑橘提取物和抗生素提高了機體的免疫能力，二者具有相似的免疫效果。

部分氨基酸對組織氧化應(yīng)激具有保護作用，如脯氨酸調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的氧化還原環(huán)境并保護細(xì)胞免受氧化應(yīng)激[49]。亮氨酸可提高谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶和CAT的活性，丙氨酸可增強谷胱甘肽還原酶活性[50]。這2種氨基酸含量的提高，與柑橘提取物組血漿T-AOC的提高是一致的，即柑橘提取物具有較好的抗氧化效果。