賀凌霄 何 雷 李洪臣 李芳芳 顏培強(qiáng) 姚 遠(yuǎn)薛 剛 孫聚濤 楊鐵釗 徐世曉*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 煙草學(xué)院，鄭州 450002；2.中國煙草總公司 河南省公司，鄭州450046；3.河南省煙草公司 三門峽市公司，河南 三門峽 472000；4.黑龍江省煙草公司 哈爾濱煙葉公司， 哈爾濱 150001)

順-冷杉醇(cis-abienol)是大部分香料煙和部分雪茄煙葉片腺毛分泌物中特有的萜類香氣前體物之一[1]，由腺毛特異性啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)柯巴基焦磷酸合酶(8-hydroxy-copalyl diphosphate synthase，CPS2)[2-5]而合成。Sallaud等[6]通過體外試驗(yàn)證明NtCPS2基因編碼柯巴基焦磷酸合酶，參與賴百當(dāng)類化合物前體物質(zhì)8-羥基-柯巴基焦磷酸(8-α-hydroxy-copalyl-pyrophophate，8-OH-CPP)合成。與香料煙和雪茄煙不同，常規(guī)烤煙品種合成順-冷杉醇，其香氣風(fēng)格會(huì)具有晾曬煙的特征，對(duì)卷煙香氣產(chǎn)生負(fù)面影響，在一定程度上影響其工業(yè)可用性[7-8]。

在賴百當(dāng)類合成途徑中，牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl-PP，GGPP)通過折疊形成賴百當(dāng)類烷骨架結(jié)構(gòu)，在CPS2催化作用下形成8-OH-CPP；在順-冷杉醇合成酶(cis-abienol synthase，ABS)和香紫蘇醇合成酶(sclareol synthase，SCLS)催化作用下，8-OH-CPP分別合成順-冷杉醇(cis-abienol)和賴百當(dāng)烯二醇(labdene-diol)[9]，見圖1。

圖1 煙草赤霉素(a)[10]和賴百當(dāng)二萜(b)[1]合成途徑Fig.1 Synthesis pathway of gibberellin (a)[10] and labdene diterpene (b)[1] in tobacco

賴百當(dāng)類化合物合成的直接前體GGPP是萜類代謝的中間產(chǎn)物，其以丙酮酸、甘油醛-3-磷酸為原料由甲基赤蘚醇-4-磷酸途徑(methylerythritol-4-phosphate pathway, MEP)經(jīng)多步反應(yīng)后生成[11]，后以不同于賴百當(dāng)類合成的折疊方式形成赤霉素類烷骨架結(jié)構(gòu)，在柯巴基焦磷酸合酶(ent-copalyl diphosphate synthase，CPS)、內(nèi)-貝殼杉烯合成酶(ent-kaurene synthase，KS)催化作用下形成內(nèi)-貝殼杉烯(ent-kaurene)；在內(nèi)-貝殼杉烯氧化酶(ent-kaurene oxidase，KO)、內(nèi)-貝殼杉烯酸氧化酶(ent-kaurenoic acid oxidase，KAO)氧化作用下轉(zhuǎn)化成GA12；再通過GA20-氧化酶 (GA20-oxidase，GA20ox)、GA2-氧化酶 (GA2-oxidase，GA2ox) 等合成具有生物活性的赤霉素[10,12-13]，見圖1。

目前，有關(guān)NtCPS2基因?qū)?冷杉醇合成代謝途徑的影響已有相關(guān)報(bào)道[1,6.8,15]，但NtCPS2基因與赤霉素合成代謝關(guān)系的研究鮮見報(bào)道。本研究以河南農(nóng)業(yè)大學(xué)自選烤煙品系‘8306’為材料[7]，利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)順-冷杉醇合成基因NtCPS2進(jìn)行編輯產(chǎn)生的突變植株[16]，并篩選出純合突變植株，比較純合突變植株與野生型‘8306’在農(nóng)藝性狀，順-冷杉醇和赤霉素含量及赤霉素合成關(guān)鍵基因的差異，旨在明確NtCPS2基因?qū)?冷杉醇和赤霉素合成的調(diào)控方式，以期為萜類化合物對(duì)植物赤霉素合成反饋調(diào)節(jié)作用提供例證。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為河南農(nóng)業(yè)大學(xué)自選烤煙品系‘8306’野生型(WT)和利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)順-冷杉醇合成基因NtCPS2進(jìn)行編輯的‘8306’編輯系T2-26、T2-45和T2-48。

為得到去除順-冷杉醇的‘8306’品系，‘8306’編輯系根據(jù) cds 序列與基因組序列(NtCPS2，Genebank HE588139.1)在第 2 外顯子區(qū)域設(shè)計(jì) 2 個(gè) gRNA 靶位點(diǎn)序列，構(gòu)建pRGEB32/Cas9-CPS2-gRNA 載體進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，獲得T0代陽性轉(zhuǎn)化植株，對(duì)陽性植株NtCPS2基因進(jìn)行測序表明，T0代共獲得7株成功敲除植株，且突變均發(fā)生在靶點(diǎn)2上[16]。并在T1代中篩選出純合‘8306’編輯系(T1-26、T1-45、T1-48)。本研究所用材料為‘8306’編輯系第二代純合突變株系(T2-26、T2-45、T2-48)。

2018年3月1日播種， 5月1日移栽于河南省鄭州市河南農(nóng)業(yè)大學(xué)科教園。試驗(yàn)土壤是壤質(zhì)潮土，各管理環(huán)節(jié)參考當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙葉生產(chǎn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。當(dāng)煙草中部葉葉長為1.5 cm時(shí)開始計(jì)算葉齡，于葉齡60 d時(shí)，每個(gè)品系挑選5株長勢一致的煙株，每株取中部同位葉2片，沿主脈兩側(cè)截取4片直徑為10 cm的葉圓片，每個(gè)品系取20片葉圓片，用于RNA提取和內(nèi)源GA含量的測定。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1編輯植株目標(biāo)基因靶位點(diǎn)序列突變檢測

用改進(jìn)的CTAB法提取煙草基因組DNA。利用磨樣機(jī)研磨樣品T1-26、T1-45、T1-48，然后采用CTAB抽提緩沖液提取基因組DNA，DNA樣品晾干后，加入ddH2O 100 μL備用。

設(shè)計(jì)引物17KN48-dF(5′→3′)：ATCATAGCGGAATTGTTTGTCTC和17KN48-dR(5′→3′)：TCCGTATAGATACCTAAGCGATCTG擴(kuò)增目的條帶并進(jìn)行純化，送至武漢天問生物科技有限公司測序。利用DANMAN 6.0 軟件將測序結(jié)果與模板序列進(jìn)行比對(duì)。擴(kuò)增反應(yīng)體系：2×PCR Mix 10 μL 上述引物各 0.3 μL，ddH2O 8.9 μL，煙草基因組DNA 0.5 μL。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，32個(gè)循環(huán)(94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s)，72 ℃ 5 min，25 ℃ 1 min。上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，采用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.2.2葉面分泌物二萜類物質(zhì)(順-冷杉醇)的測定

提取煙草葉片中的順-冷杉醇參照陳偉等[17]的方法，通過NIST12檢索譜庫確定各類物質(zhì)成分，并使用內(nèi)標(biāo)法對(duì)物質(zhì)定量。

1.2.3農(nóng)藝性狀測量

每個(gè)品種(系)選擇有代表性的5株，根據(jù)《煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測量方法(YC/T 142—2010)》[18]測定并記錄株高和節(jié)距。

1.2.4內(nèi)源赤霉素分析測試

采集各品種(系)中部葉片0.5 g，用液氮速凍后，存放于-80 ℃冰箱中保存，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)[19](酶免疫試劑盒由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)化控中心提供)進(jìn)行測定。

1.2.5GGPP分析測試

采集各品種(系)中部葉片0.5 g，用液氮速凍后，存放于-80 ℃冰箱中保存，采用間接酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)(上海潤裕生物科技有限公司提供)進(jìn)行測定。

1.2.6煙草葉片總RNA的提取

采用Plant RNA isolation Aid提取供試材料葉片總RNA，于-80 ℃保存。逆轉(zhuǎn)錄：利用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)(Vazyme，R223-01)將待測RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，儲(chǔ)存在-20 ℃冰箱備用。

引物設(shè)計(jì)采用Roche LCPDS2軟件(表1)并由上海捷瑞生物工程有限公司合成。熒光定量PCR利用ChamQ SYBR qPCR Master Mix試劑盒(Q311-03，Vazyme)在LightCycler?480 Ⅱ型熒光定量PCR儀(Roche，Swiss)上進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)體系：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5.0 μL，引物各0.2 μL，cDNA 1.0 μL，Nuclease-free H2O 3.6 μL。PCR程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。通過2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量并作圖。

表1 熒光定量引物序列(5′→3′)Table 1 Sequences of fluorescence quantitative primers (5′→3′)

2 結(jié)果與分析

2.1 編輯植株靶位點(diǎn)序列突變的差異分析

由圖2可知，對(duì)‘8306’編輯系PCR擴(kuò)增檢測結(jié)果顯示，擴(kuò)增產(chǎn)物大小約468 bp。測序表明在NtCPS2基因開放閱讀框第239位置插入單個(gè)堿基，其中T1-26和T1-45 插入單個(gè)T堿基，T1-48插入單個(gè)A堿基(圖3)。測序結(jié)果利用解碼網(wǎng)站http:∥skl.scau.edu.cn/dsdecode/進(jìn)行分析，確定T1-26、T1-45、T1-48均為純合型堿基插入。

2.2 不同編輯株系的順-冷杉醇含量及合成關(guān)鍵基因表達(dá)量

由圖4可知，在‘8306’不同的編輯系中，順-冷杉醇含量較WT均顯著降低。不同株系中冷杉醇含量由高到低為，WT>T2-45>T2-26>T2-48。

M，DNA Marker；T1-26、T1-45、T1-48，‘8306’編輯系純合突變植株。下同。M， DNA Marker； T1-26， T1-45， T1-48 and‘8306’editing series homozygous mutant plants. The same below.圖2 3個(gè)煙草‘8306’基因編輯株系的PCR檢測結(jié)果Fig.2 PCR detection among 3 gene editing series of tobacco ‘8306’

紅色方框中是gRNA靶序列；陰影框中的GGG為PAM序列；A/T表示堿基突變位點(diǎn)。The red box represents the gRNA target sequence; GGG stands for PAM sequence in shadow box; A/T is for base insertion.圖3 3個(gè)煙草‘8306’基因編輯株系的PCR產(chǎn)物測序結(jié)果Fig.3 Sequencing results for PCR products among 3 gene editing series of tobacco ‘8306’

柱中不同小寫字母表示P<0.05水平差異顯著。下同。Different lowercase letters in the column indicate significant difference in P<0.05. The same below.圖4 3個(gè)煙草‘8306’基因編輯株系的順-冷杉醇含量Fig.4 Cis-abienol content among 3 gene editing series of tobacco ‘8306’

‘8306’編輯系的NtCPS2相對(duì)含量較WT顯著降低(圖5)，同順-冷杉醇含量變化趨勢一致。

圖5 3個(gè)煙草‘8306’基因編輯株系順-冷杉醇合成關(guān)鍵基因的表達(dá)Fig.5 Key genes expression differences for cis-abienol among 3 gene editing series of tobacco ‘8306’

2.3 不同編輯株系的內(nèi)源赤霉素含量

由圖6可知，與野生型相比，各編輯株系內(nèi)源赤霉素含量顯著增加，且編輯株系間差異顯著，以T2-45 的含量最高，即T2-45>T2-26>T2-48>WT。表明在‘8306’編輯順-冷杉醇控制基因NtCPS2后內(nèi)源赤霉素含量顯著升高。

圖6 3個(gè)煙草‘8306’基因編輯株系內(nèi)源赤霉素含量Fig.6 Endogenous gibberellin content among 3 gene editing series of tobacco ‘8306’

圖7 3個(gè)煙草‘8306’基因編輯株系的GGPP含量Fig.7 GGPP content among 3 gene editing series of tobacco ‘8306’

2.4 不同編輯株系的牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸(GGPP)含量

由圖7可知，在‘8306’編輯順-冷杉醇控制基因NtCPS2后GGPP含量較未編輯植株WT(‘8306’)均顯著增加，編輯系間T2-45的GGPP含量最高，顯著高于T2-26。

2.5 ‘8306’編輯系赤霉素合成關(guān)鍵基因的表達(dá)分析

由圖8可知，與野生型相比，各編輯株系CPS和KAO基因相對(duì)表達(dá)量顯著升高，GA2ox顯著降低，T2-26、T2-45的DXR基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比顯著升高，T2-45和T2-48的GA20ox基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比顯著升高，T2-45的KO基因相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照相比顯著升高；編輯株系間，除KAO外，各基因相對(duì)表達(dá)量差異均不顯著。

2.6 ‘8306’編輯系的農(nóng)藝性狀

從圖9和圖10可以看出，與WT相比，‘8306’各編輯株系的株高和節(jié)距均顯著增加，編輯株系間差異不顯著，表明編輯順-冷杉醇控制基因NtCPS2可以顯著提高‘8306’各編輯株系煙株的高度，增加煙株節(jié)距。

圖8 3個(gè)煙草‘8306’基因編輯株系赤霉素合成關(guān)鍵基因的表達(dá)Fig.8 Key genes expression gibberellin among 3 gene editing series of tobacco ‘8306’

圖9 煙草野生型與3個(gè)‘8306’基因編輯株系的株高(a)和節(jié)距(b)Fig.9 Plant height (a) and internode (b) between tobacco wild-type and 3 gene editing series of tobacco ‘8306’

圖10 葉齡15 d煙草野生型與3個(gè)‘8306’基因編輯株系的株高Fig.10 Plant height between tobacco wild-type and 3 gene editing series of tobacco ‘8306’ with 15 d leaf-age

3 討 論

本研究通過編輯NtCPS2基因使‘8306’的順-冷杉醇含量降低71.01%～94.67%，赤霉素含量增加16.68%～38.27%。赤霉素合成途徑中正調(diào)控關(guān)鍵基因GA20ox表達(dá)量顯著增加，負(fù)調(diào)控關(guān)鍵基因GA2ox表達(dá)量顯著減小，并且GGPP合成的關(guān)鍵基因DXR表達(dá)量提高，GGPP含量增加顯著。

已有研究表明煙草中順-冷杉醇的含量與NtCPS2基因表達(dá)量呈正相關(guān)，王國平[1]、常愛霞[15]和李艷華等[8]發(fā)現(xiàn)在特香型烤煙品種 ‘大白筋599’、‘革新三號(hào)’和‘豫煙11號(hào)’中順-冷杉醇含量較高的同時(shí)NtCPS2基因表達(dá)量也顯著高于其他品種。Sallaud等[6]在不含順-冷杉醇的林煙草中進(jìn)行了NtCPS2和NtABS轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NtCPS2通過催化GGPP形成8-OH-CPP，NtABS利用8-OH-CPP為底物合成順-冷杉醇(圖1(b))。本研究編輯NtCPS2基因抑制了柯巴基焦磷酸合酶的合成，減少順-冷杉醇直接前體物質(zhì)8-OH-CPP的含量從而降低煙草葉片中順-冷杉醇的含量(圖11)。

圖11 3個(gè)煙草‘8306’基因編輯株系赤霉素[10]和賴百當(dāng)二萜[1]合成途徑Fig.11 Synthesis pathway of gibberellin[10] and labdene diterpene[1] in 3 gene editing series of tobacco ‘8306’

本研究發(fā)現(xiàn)編輯NtCPS2基因后，生成甲基赤蘚醇-4-磷酸 (MEP)的關(guān)鍵基因DXR的表達(dá)量顯著升高[20]，說明編輯NtCPS2基因可以減少賴百當(dāng)?shù)暮铣蓪?duì)萜類代謝中間產(chǎn)物GGPP的競爭，促使CPS、KAO顯著升高和GA2ox顯著降低，從而促進(jìn)C20類赤霉素轉(zhuǎn)化為C19類赤霉素[21]，并抑制植株中具有生物活性的GA1和GA4轉(zhuǎn)化為無活性的GA8和GA34[22]，進(jìn)而增加具有生物活性的赤霉素含量[23]，使得‘8306’編輯系的株高和節(jié)距顯著增加。

已有研究證明植物激素茉莉酸和赤霉素等可以提高腺毛分泌物中萜類物質(zhì)的含量，Sui等[24]發(fā)現(xiàn)茉莉酸可以通過提高CBTS和P450的表達(dá)量來提高西柏三烯二醇的含量。Traw等[25]和Maes等[26]研究證實(shí)赤霉素與茉莉酸協(xié)同調(diào)控可提高青蒿素含量。但腺毛分泌的萜類化合物對(duì)植物激素反饋調(diào)節(jié)作用的研究較少。

已有研究發(fā)現(xiàn)與類胡蘿卜素積累相關(guān)的基因Or(Orange)發(fā)生突變后，在突變體中Or基因通過某種方式下調(diào)CPS基因的表達(dá)從而導(dǎo)致活性赤霉素含量的降低[27-28]。Fraser等[29]通過反義RNA技術(shù)抑制八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase, PSY)基因PSY的表達(dá)，導(dǎo)致番茄中類胡蘿卜素含量較野生型減少14倍，轉(zhuǎn)基因株系中與類胡蘿卜素合成共用相同底物的物質(zhì)—赤霉素的含量提高3～5倍。NtCPS2基因與PSY一類，均是萜烯合成酶(terpene synthases, TPSs)的關(guān)鍵基因，編輯NtCPS2基因后，也對(duì)赤霉素合成途徑中的TPSs細(xì)胞色素P450單加氧酶(cytochrome P450 monooxygenases, P450 s)和2-酮戊二酸依賴的雙加氧酶(2-oxoglutarate-dependent dioxygenases, 2ODDs)相關(guān)合成基因CPS、KO、KAO、GA20ox和GA2ox產(chǎn)生影響。降低NtCPS2基因表達(dá)量可能減少對(duì)萜類代謝中間產(chǎn)物GGPP的競爭，并且促使了DXR基因表達(dá)量的增加，從而增加了赤霉素合成前體物質(zhì)GGPP的含量，同時(shí)影響赤霉素合成途徑中相關(guān)基因，進(jìn)而提高赤霉素含量。

4 結(jié) 論

本研究發(fā)現(xiàn)利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對(duì)烤煙‘8306’的順-冷杉醇合成關(guān)鍵基因NtCPS2編輯，降低了順-冷杉醇的含量，影響赤霉素合成途徑中DXR、GA20ox、GA2ox等基因的表達(dá)量，顯著增加煙草葉片內(nèi)的赤霉素合成前體物質(zhì)GGPP的含量，萜類化合物對(duì)植物赤霉素合成起反饋調(diào)節(jié)作用。