庹 潯,宋繼敏,付 豪,呂小蘭*

1.南昌大學(xué)化學(xué)學(xué)院，江西 南昌 330000 2.南昌大學(xué)藥學(xué)院，江西 南昌 330000

引 言

六溴環(huán)十二烷(Hexabromocyclododecane，HBCD)是一類添加型的含溴阻燃劑，是繼多溴聯(lián)苯醚、四溴雙酚A后被廣泛使用的第三大溴系阻燃劑。2001年至2011年全球HBCD產(chǎn)量由16 700 t增至31 000 t，我國年生產(chǎn)量從500 t增至18 000 t，已成為HBCD的主要生產(chǎn)國[1]。2013年5月經(jīng)締約方大會(huì)第六次會(huì)議審議，聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署理事會(huì)將HBCD納入持久性有機(jī)污染物目錄，引發(fā)國際社會(huì)廣泛關(guān)注。

近年來的研究表明HBCD能夠進(jìn)入大氣、土壤、水體等自然環(huán)境并且能夠在生物體內(nèi)蓄積[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，中國各大城市的空氣中均檢出HBCD，土壤中HBCD含量檢出量高達(dá)11 700 ng·g-1，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過世界標(biāo)準(zhǔn)[2]。特別值得注意的是，在人跡罕至的北極地區(qū)的空氣及生物體內(nèi)都檢測到HBCD的存在[3]。毒理學(xué)相關(guān)研究表明，HBCD對(duì)生物體具有生殖毒性、發(fā)育毒性、神經(jīng)毒性等多種毒性[4]且具有生物放大效應(yīng)，能夠通過食物鏈的傳遞最終嚴(yán)重威脅人類健康。例如：經(jīng)HBCD染毒7天后，雌性大鼠肝臟中大量蛋白的表達(dá)發(fā)生改變[5]，食物鏈高端的魚類體內(nèi)HBCD含量高于食物鏈低端魚類[6]，體外研究表明HBCD對(duì)人肝細(xì)胞和人肝癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性[7]。因此，研究HBCD對(duì)哺乳動(dòng)物毒性作用機(jī)制，可為降低HBCD對(duì)人類健康的威脅提供理論支持。

血清白蛋白作為一種重要的生物分子，在過去的幾百年里一直為人們所關(guān)注。血清白蛋白是血液中重要的蛋白質(zhì)成分，負(fù)責(zé)維持血液的滲透壓以及pH值。血清白蛋白在許多內(nèi)源性物質(zhì)(氨基酸、脂肪酸等)和外源化合物(藥物、環(huán)境污染物等)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[8]。持久性有機(jī)污染物同樣能夠與白蛋白結(jié)合[9]，繼而被轉(zhuǎn)運(yùn)至各個(gè)器官，由此可以推測血清白蛋白在HBCD的致毒機(jī)制中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。目前，尚未見HBCD與血清白蛋白結(jié)合機(jī)制的研究。本文通過實(shí)驗(yàn)研究和理論計(jì)算相結(jié)合的方式，探究HBCD與BSA的作用機(jī)制，以期為從分子水平揭示HBCD對(duì)人類毒性作用機(jī)制提供重要基礎(chǔ)信息。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

帶溫控系統(tǒng)的F-4500熒光分光光度計(jì)(日本日立公司)；紫外-分光光度計(jì)(UV-5500PC上海元析儀器有限公司)；Cary eclipse熒光光譜儀(美國安捷倫公司)；PHS-3C精密PH計(jì)(上海雷磁儀器廠)；溶液：牛血清白蛋白(進(jìn)口分裝)溶于超純水中配制成1×10-3mol·L-1的儲(chǔ)備液，六溴環(huán)十二烷(上海源葉生物，97%)溶于二甲基亞砜(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，A.R.)中配成1×10-2mol·L-1的HBCD儲(chǔ)備液；Tris-HCl緩沖液：2.42 g三羥甲基氨基甲烷(Tris，上海源葉生物科技有限公司，純度為99.9%)和3.51 g NaCl溶于400 mL超純水中配制成pH 7.40的緩沖液；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 方法

1.2.1 熒光光譜、同步熒光的測定

固定研究體系中BSA濃度為3.33×10-6mol·L-1，改變HBCD的濃度(0,3.33,6.66,9.99,13.33,16.67,19.98)×10-6mol·L-1，以280 nm為激發(fā)波長，測定300～450 nm下的熒光發(fā)射光譜。

改變BSA-HBCD體系的溫度(288，293和298 K)，以280 nm為激發(fā)波長，測定300～450 nm的熒光發(fā)射光譜。

固定λem-λex=15 nm,λem-λex=60 nm，分別測定260～320 nm下的同步熒光發(fā)射光譜。

改變體系中BSA和HBCD的比例，分別以280和295 nm為激發(fā)波長，測定發(fā)射波長345 nm下的熒光強(qiáng)度。

1.2.2 紫外光譜

固定研究體系中BSA的濃度為3.33×10-6mol·L-1，改變HBCD的濃度(0,3.33,6.66,9.99)×10-6mol·L-1，以相應(yīng)的HBCD溶液作為參比，測定200～300 nm下BSA-HBCD體系的紫外光譜。

1.2.3 分子對(duì)接

通過ChemBio3D Ultra 14.0得到HBCD的結(jié)構(gòu)，并通過MMFF94分子力場優(yōu)化得到最佳的結(jié)構(gòu)。從RSCB數(shù)據(jù)庫(http://www.rcsb.org/)中得到編號(hào)為1H9Z的白蛋白構(gòu)象。通過Autodock4.2 程序進(jìn)行分子對(duì)接并使用Ligplus+軟件對(duì)ΔG最低的構(gòu)象進(jìn)行分析。

1.2.4 分子動(dòng)力學(xué)

利用分子動(dòng)力學(xué)軟件GROMACS 2016.1程序模擬游離態(tài)和結(jié)合態(tài)的BSA結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性以及HBCD對(duì)BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，每個(gè)體系重復(fù)模擬3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 HBCD與BSA體系熒光光譜、紫外光譜分析

BSA中含有酪氨酸(Tyr)、色氨酸(Trp)和苯丙氨酸(Phe)三種能夠產(chǎn)生熒光的氨基酸殘基，使得BSA具有一定的內(nèi)源性熒光。由圖1(a)所示，隨著HBCD濃度的增加，BSA的熒光強(qiáng)度依次降低，表明HBCD與BSA間存在著相互作用且結(jié)合能力較強(qiáng)，易在體內(nèi)被蛋白質(zhì)儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)運(yùn)。

圖1 HBCD對(duì)BSA熒光光譜(a)和紫外光譜(b)的影響Fig.1 Effect of HBCD on the fluorescence (a) and UV absorption spectra (b) of BSA(a):[BSA]=3.33×10-6 mol·L-1；[HBCD]=(0,3.33,6.66,9.99,13.33,16.67,19.98)×10-6 mol·L-1；(b):[BSA]=3.33×10-6 mol·L-1；[HBCD]=(0,3.33,6.66,9.99)×10-6 mol·L-1

2.2 HBCD與BSA的結(jié)合位置

BSA具有兩個(gè)與外源性物質(zhì)結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)，分別是結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ和結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ。運(yùn)用Autodock4.2程序分別對(duì)HBCD與BSA在結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ和Ⅱ處結(jié)合進(jìn)行理論模擬研究。結(jié)果表明，當(dāng)HBCD進(jìn)入BSA結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ處與其結(jié)合時(shí)吉布斯自由能(ΔG)為-6.5 kcal·mol-1，而進(jìn)入結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ處的ΔG為+4.3 kcal·mol-1?？梢奌BCD與BSA會(huì)更傾向于在結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ進(jìn)行自發(fā)結(jié)合。最佳模擬結(jié)果如圖2(a)和(b)所示。

圖2 HBCD與BSA在結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ的相互作用圖(a)：BSA與六溴環(huán)十二烷結(jié)合圖;(b)：結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ放大圖;(c)：Ligplus+軟件分析2D圖;(d)：Ligplus+軟件分析3D圖Fig.2 The interaction between HBCD and BSA at site Ⅰ(a)：BSA and HBCD interaction model;(b)：Enlarged view of binding site Ⅰ;(c)：Analysis of figure using Ligpius+;(d)：Analysis of 3D figure using Ligpius+

由于BSA的結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ中有能夠產(chǎn)生熒光的氨基酸殘基有Tyr和Trp，而結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ中僅有Tyr。因此，利用結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ和結(jié)合位點(diǎn)Ⅱ結(jié)構(gòu)的差異以及Tyr/Trp性質(zhì)的差異，通過同步熒光和改變激發(fā)波長實(shí)驗(yàn)可進(jìn)一步確認(rèn)HBCD與BSA的結(jié)合位點(diǎn)。

2.2.1 同步熒光實(shí)驗(yàn)

固定λem-λex=15 nm時(shí)，測得蛋白質(zhì)中Tyr的光譜；固定λem-λex=60 nm時(shí)，測得Trp的光譜。由圖3可見，隨著HBCD濃度的增加，Tyr的熒光強(qiáng)度下降幅度很小，幾乎不變[圖3(a)]，而Trp的熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)規(guī)律性下降[圖3(b)]。該結(jié)果表明HBCD與BSA的結(jié)合位點(diǎn)在Trp附近，即兩者在結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ結(jié)合。

圖3 HBCD對(duì)BSA同步熒光光譜的影響Fig.3 Effect of HBCD on the synchronous fluorescence spectra of BSA[BSA]=3.33×10-6 mol·L-1,[HBCD]=(0,3.33,6.66,9.99,13.33)×10-6 mol·L-1(a)：Δλ=15 nm；(b)：Δλ=60 nm

2.2.2 不同激發(fā)波長下的熒光光譜實(shí)驗(yàn)

當(dāng)激發(fā)波長為280 nm時(shí)，Trp和Tyr的熒光同時(shí)被激發(fā)；激發(fā)波長為295 nm時(shí)，只有Trp的熒光被激發(fā)。因此，比較兩個(gè)不同激發(fā)波長處，熒光強(qiáng)度下降的程度，可以判斷出HBCD與BSA的結(jié)合位點(diǎn)。熒光實(shí)驗(yàn)表明在HBCD濃度由3.33×10-6mol·L-1增至3.33×10-4mol·L-1的過程中，280 nm處熒光強(qiáng)度下降程度始終大于295 nm。當(dāng)HBCD濃度達(dá)到3.33×10-4mol·L-1時(shí)，280 nm處熒光強(qiáng)度下降了64%，明顯大于295 nm處熒光下降強(qiáng)度47%，表明Trp和Tyr的熒光強(qiáng)度在HBCD與BSA作用過程中均被抑制，此實(shí)驗(yàn)再次證明HBCD與BSA在結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ進(jìn)行結(jié)合。這一結(jié)果與分子對(duì)接結(jié)果、同步熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

2.3 HBCD與BSA體系結(jié)合位點(diǎn)數(shù)與結(jié)合常數(shù)的確定

小分子與蛋白大分子相互作用的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n與結(jié)合常數(shù)Ka可以由式(1)[10]得到

log[(F0-F)/F]=logKa+nlog[Q]

(1)

式(1)中，F(xiàn)0及F分別為BSA單獨(dú)存在以及加入HBCD形成復(fù)合體系后的熒光強(qiáng)度，Ka為結(jié)合常數(shù)，n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，[Q]為HBCD的濃度。以log[(F0-F)/F]對(duì)log[Q]作圖，通過直線的斜率與截距得到n值與Ka值，結(jié)果列于表1中。不同溫度條件下，HBCD與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n均約為1，說明兩者發(fā)生結(jié)合作用時(shí)只有1個(gè)結(jié)合位點(diǎn)；隨著體系溫度的上升，結(jié)合常數(shù)Ka逐漸下降，表明HBCD對(duì)BSA的熒光的猝滅機(jī)制為靜態(tài)猝滅。

表1 六溴環(huán)十二烷與牛血清白蛋白結(jié)合作用的結(jié)合常數(shù)與熱力學(xué)參數(shù)Table 1 The binding constant and the thermodynamic parameters of BSA-HBCD at different temperatures

2.4 HBCD與BSA的熱力學(xué)參數(shù)及作用力類型

從本質(zhì)上分析，有四種主要類型的非共價(jià)相互作用力存在于配體與蛋白質(zhì)的結(jié)合過程中，分別是：靜電作用力，氫鍵，范德華力以及疏水作用力[11]。通過分子對(duì)接得到HBCD與BSA結(jié)合的最佳構(gòu)象后，利用LigPlus+軟件分析HBCD與BSA之間的相互作用。如圖2(c)所示，HBCD與5種氨基酸之間具有疏水作用力，其中3種是疏水性氨基酸(Trp,Phe,Leu)，2種是親水性氨基酸(Lys,His)，由此可以初步推測HBCD與BSA結(jié)合的主要作用力是范德華力。

熱力學(xué)參數(shù)是確定分子間作用力的主要依據(jù)，為進(jìn)一步確認(rèn)HBCD與BSA的作用力類型，可通過不同溫度條件下的熒光光譜實(shí)驗(yàn)得到三個(gè)不同溫度下的結(jié)合常數(shù)，結(jié)合式(2)和式(3)，計(jì)算得到三個(gè)熱力學(xué)參數(shù)大小，進(jìn)而判斷作用力類型。若ΔH>0和ΔS>0，表明兩物質(zhì)間的作用力類型為疏水作用；若ΔH<0和ΔS>0，表明兩物質(zhì)間的作用力類型為靜電作用力；若ΔH<0和ΔS<0，表明兩物質(zhì)間的作用力類型為氫鍵或范德華作用力[12]。當(dāng)溫度變化不大時(shí)，系統(tǒng)的焓變與熵變可視為常數(shù)。焓變與熵變通過式(2)計(jì)算得到，系統(tǒng)的吉布斯自由能變化通過式(3)計(jì)算得到。

lnKa=-ΔH/RT+ΔS/R

(2)

ΔG=ΔH-TΔS=-RTlnKa

(3)

式(2)和式(3)中，Ka為HBCD與BSA結(jié)合的結(jié)合常數(shù)，R是氣體常數(shù)，以lnKa對(duì)-1/T作圖，由直線的斜率和截距分別得到ΔH和ΔS，計(jì)算結(jié)果見表1。由表1可知，ΔG<0，說明HBCD與BSA的結(jié)合反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行的，ΔH<0和ΔS<0，說明HBCD與BSA之間主要作用力類型為范德華力或氫鍵。

2.5 HBCD與BSA間能量轉(zhuǎn)移

根據(jù)Forster能量轉(zhuǎn)移理論，兩種化合物分子間滿足供能體發(fā)出熒光，供能體的熒光發(fā)射光譜和受體的吸收光譜有重疊或者供能體和受體足夠的接近，且最大距離在7 nm范圍內(nèi)時(shí)，將會(huì)有非輻射能量轉(zhuǎn)移。按照相關(guān)方程處理HBCD的紫外吸收光譜與BSA熒光光譜的重疊譜圖(圖4)。得到J=3.413×10-15cm3·mol·L-1，R=2.04 nm，r=3.45 nm。計(jì)算機(jī)模擬的結(jié)果表明BSA與HBCD間的結(jié)合距離為3.40 nm[圖2(d)]，該值與實(shí)驗(yàn)結(jié)果接近，進(jìn)一步說明實(shí)驗(yàn)的可靠性。r<7 nm表明HBCD與BSA間存在非輻射能量轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致BSA熒光猝滅。

圖4 BSA的熒光發(fā)射光譜(a)和HBCD的紫外吸收光譜(b)Fig.4 Fluorescence emission spectra of BSA (a) and UV absorption spectra of HBCD (b)[BSA]=[HBCD]=3.33×10-6 mol·L-1

2.6 HBCD對(duì)BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響

2.6.1 分子動(dòng)力學(xué)模擬

通過分子動(dòng)力學(xué)模擬(MD)可以研究HBCD與BSA復(fù)合物在水溶液中的動(dòng)力學(xué)情況。根據(jù)均方根偏差(RMSD)及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)變化可以判斷HBCD對(duì)BSA二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響。BSA與HBCD形成的復(fù)合體系的均方根偏差如圖5(a)。研究體系的RMSD值在2 ns以后變化幅度很小，說明HBCD能夠與BSA形成穩(wěn)定的復(fù)合物，并且復(fù)合物體系穩(wěn)定。進(jìn)一步分析BSA處于游離態(tài)與穩(wěn)定態(tài)時(shí)的二級(jí)結(jié)構(gòu)，如圖5(b)所示，其中無規(guī)則卷曲(coil)、彎曲(Bend)、β-折疊(Turn)、α-螺旋(α-Helix)、5-螺旋(5-Helix)、3-螺旋(3-Helix)的含量都不發(fā)生變化，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明HBCD不會(huì)改變BSA的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖5 HBCD對(duì)BSA的RMSD(a)和二級(jí)結(jié)構(gòu)含量(b)的影響Fig.5 RMSD (a) and the average contents of Secondary structure (b) of BSA

2.6.2 HBCD與BSA的三維熒光光譜分析

圖6 BSA和BSA-HBCD的三維熒光光譜圖Fig.6 Three-dimensional fluorescence spectra of BSA and BSA-HBCD[BSA]=[HBCD]=3.33×10-6 mol·L-1

3 結(jié) 論

通過整合多種光譜學(xué)技術(shù)以及計(jì)算機(jī)模擬技術(shù)，本文探究了HBCD與BSA之間相互作用的化學(xué)本質(zhì)。HBCD通過靜態(tài)猝滅和非輻射能量轉(zhuǎn)移導(dǎo)致BSA內(nèi)源熒光猝滅；根據(jù)計(jì)算結(jié)果可知HBCD與BSA的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)為1，結(jié)合常數(shù)為2.796 6×104L·mol-1(288 K)，2.194 1×104L·mol-1(293 K)，1.174 4×104L·mol-1(298 K)；HBCD會(huì)自發(fā)地與BSA在結(jié)合位點(diǎn)Ⅰ進(jìn)行結(jié)合，兩者的結(jié)合距離為3.45 nm。ΔH<0，ΔS<0，ΔG<0，表明HBCD與BSA之間自發(fā)結(jié)合過程是熵增加、吉布斯自由能減小的過程，結(jié)合作用力主要為范德華力或氫鍵；HBCD與BSA結(jié)合不會(huì)使BSA的構(gòu)象發(fā)生改變。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果能夠幫助人們在一定程度上理解溴系阻燃劑在生物體內(nèi)的運(yùn)輸機(jī)制，為研究HBCD的毒理機(jī)制提供重要的理論基礎(chǔ)。