彭名行，田春漫,涂 星,謝慧臣,袁麗君,李三宇

(1. 湖北民族大學(xué)醫(yī)學(xué)部，湖北 恩施 445000；2. 風(fēng)濕病性疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 恩施 445000；3. 達(dá)州中醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，四川 達(dá)州 635000)

膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)以膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、變形及功能障礙為主要臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。目前臨床上常用非甾體類(lèi)抗炎藥物治療KOA，雖能在一定程度上減輕疼痛，但長(zhǎng)期應(yīng)用所致的消化道不良反應(yīng)影響了其治療依從性[2-3]。中醫(yī)藥治療本病具有療效好、不良反應(yīng)小的優(yōu)勢(shì)[4]。復(fù)方竹節(jié)參片是湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院治療KOA的院內(nèi)制劑，在臨床使用10余年，療效確切，無(wú)明顯不良反應(yīng)[5-6]。前期研究證實(shí)，復(fù)方竹節(jié)參片具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、鎮(zhèn)痛、抗風(fēng)濕等藥理作用[7]，但其治療KOA的作用機(jī)制尚不明確。本研究擬采用木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的KOA兔模型為研究對(duì)象，采用復(fù)方竹節(jié)參片進(jìn)行干預(yù)治療，考察其對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路上下游相關(guān)細(xì)胞因子和蛋白表達(dá)的影響，初步揭示其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雄性日本大耳白兔40只，體重(2.0±0.2)kg，購(gòu)自湖北逸摯誠(chéng)生物科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(鄂)2016-0020，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.1.2主要藥物與試劑 復(fù)方竹節(jié)參片(購(gòu)自湖北民族大學(xué)附屬民大醫(yī)院，恩施州衛(wèi)藥制準(zhǔn)字[2011]03-38，批號(hào)：171101)；木瓜蛋白酶(南京奧多福尼生物科技有限公司，批號(hào)：20160308)；白細(xì)胞介素-6(IL-6)(武漢博士德生物工程有限公司,批號(hào)：EK0412)；p-JAK2單抗(xy-3206R，上海信裕生物技術(shù)有限公司)；ERK1、JAK2、STAT3 單抗均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.1.3主要儀器 5810R高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；酶標(biāo)定量測(cè)定儀(德國(guó)Thermo公司)；Western blot電泳及轉(zhuǎn)膜裝置(美國(guó)Bio-Rad公司)；TS-Ⅰ型脫色搖床(江蘇海門(mén)麒麟醫(yī)用儀器廠)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法 取34只兔于第1，4，7天分別于膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射2%木瓜蛋白酶水溶液0.5 mL，另取6只兔作為對(duì)照組，同法注射等量生理鹽水，參考文獻(xiàn)[8]評(píng)價(jià)其造模是否成功，結(jié)果成功模型26只，成功率為76.5%。將造模成功的兔隨機(jī)分為模型組8只和復(fù)方竹節(jié)參片高、中、低劑量組各6只。竹節(jié)參片高、中、低劑量組分別以150 mg/kg、75 mg/kg、37.5 mg/kg給予濃度為60 mg/mL、30 mg/mL、15 mg/mL復(fù)方竹節(jié)參片混懸液5 mL灌胃，對(duì)照組及模型組同法灌胃等體積蒸餾水，均每天1次，連續(xù)14 d。

1.3觀察指標(biāo)及方法

1.3.1兔腳踝周徑測(cè)定 分別于造模前、造模結(jié)束后、灌胃7 d及灌胃14 d，將兔固定于兔臺(tái)，用細(xì)麻線環(huán)繞腳踝一周，測(cè)量并記錄細(xì)麻線長(zhǎng)度，即為兔腳踝周徑。

1.3.2樣本采集 于末次灌胃后禁食不禁水12 h，以10%水合氯醛麻醉各組兔后，腹主動(dòng)脈取血，3 000 r/min離心10 min，取血清，于-80 ℃冰箱中保存；剝離左側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜，置于EP管中，于-80 ℃冰箱中保存；取右側(cè)膝關(guān)節(jié)，置于4%多聚甲醛溶液中固定，-80 ℃冰箱中保存。

1.3.3膝關(guān)節(jié)病理樣本制備與形態(tài)觀察 取4%多聚甲醛溶液中固定的右側(cè)膝關(guān)節(jié)組織，經(jīng)常規(guī)脫水，脫鈣，石蠟包埋，切片，HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.3.4血清中IL-6水平測(cè)定 取上述待測(cè)血清，按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)血清中IL-6水平。

1.3.5滑膜組織中JAK2、p-JAK、STAT3、ERK1蛋白表達(dá)檢測(cè) 取滑膜組織，常溫解凍，稱取滑膜組織重量，勻漿后加入蛋白裂解液充分裂解組織、離心、分離上清液，把樣品煮沸變性，按照BCA試劑盒操作進(jìn)行蛋白定量，然后將樣品加入電泳凝膠中進(jìn)行蛋白分離，裁剪出目的蛋白的蛋白膠后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，封閉后加入濃度均為1∶1 000的JAK2、p-JAK、STAT3、ERK1抗體，孵育過(guò)夜后用TBS沖洗，加入二抗后室溫下孵育2 h，用TBS(Tris-HCl緩沖鹽溶液)清洗條帶后進(jìn)行ECL底物發(fā)光。將膠片進(jìn)行掃描，用凝膠圖像處理系統(tǒng)(Gel-Pro-Analyzer軟件)分析目標(biāo)條帶的光密度值。

2 結(jié) 果

2.1各組兔腳踝關(guān)節(jié)腫脹程度比較 造模結(jié)束后模型組、復(fù)方竹節(jié)參片各組兔腳踝周徑均顯著長(zhǎng)于對(duì)照組及造模前(P均<0.05)，各造模組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；灌胃7 d后，復(fù)方竹節(jié)參片各組兔腳踝周徑均有縮短趨勢(shì)，但與模型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；灌胃14 d后，復(fù)方竹節(jié)參片各組兔腳踝周徑均顯著短于模型組(P均<0.05)，且復(fù)方竹節(jié)參片各組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2各組兔膝關(guān)節(jié)病理形態(tài)學(xué)表現(xiàn) 對(duì)照組滑膜細(xì)胞排列整齊，踝關(guān)節(jié)軟骨表面光滑無(wú)破壞，滑膜組織結(jié)構(gòu)完整無(wú)破壞，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血管增生等炎性癥狀；模型組軟骨組織結(jié)構(gòu)遭到破壞，滑膜細(xì)胞增生變形、纖維化，細(xì)胞排列紊亂，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)增生及滑膜血管翳形成；與模型組比較，復(fù)方竹節(jié)參片高劑量組膝關(guān)節(jié)軟骨破壞減少，其滑膜組織增生減輕，所觀察到的細(xì)胞形態(tài)未出現(xiàn)紊亂，無(wú)血管翳形成；復(fù)方竹節(jié)參片中、低劑量組炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯改善，滑膜細(xì)胞排列相對(duì)整齊，血管翳明顯減少。見(jiàn)圖1。

表1 各組兔腳踝周徑比較

2.3各組兔血清IL-6水平比較 對(duì)照組、模型組及復(fù)方竹節(jié)參片高、中、低劑量組血清IL-6水平分別為(106.96±14.10)μg/mL、(199.94±14.35)μg/mL、(147.04±5.23)μg/mL、(154.49±7.66)μg/mL、(181.04±11.47)μg/mL，模型組顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，復(fù)方竹節(jié)參片高、中劑量組均顯著低于模型組及復(fù)方竹節(jié)參片低劑量組(P均<0.05)，復(fù)方竹節(jié)參片高、中劑量組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4各組兔滑膜組織中JAK2、p-JAK、STAT3、ERK1蛋白表達(dá)量比較 與對(duì)照組比較，模型組滑膜組織中JAK2、p-JAK、STAT3、ERK1表達(dá)量均顯著升高(P均<0.05)；與模型組比較，復(fù)方竹節(jié)參片各組滑膜組織中p-JAK2、STAT3、ERK1蛋白表達(dá)量及復(fù)方竹節(jié)參片高劑量組滑膜組織中JAK2蛋白表達(dá)量均顯著降低(P均<0.05)。見(jiàn)圖2。

3 討 論

目前KOA發(fā)病機(jī)制尚不明確，但國(guó)內(nèi)外普遍認(rèn)為其可能與合成及分解代謝相關(guān)的炎癥因子、脂蛋白基因、細(xì)胞因子和自由氧化因子等有關(guān)[9-10]。 JAK/STAT是重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，JAK家族與STATs家族成員均存在于人體細(xì)胞質(zhì)中，主要參與炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、細(xì)胞損傷、凋亡、介導(dǎo)機(jī)體免疫等[11]。IL-6是JAK/STAT信號(hào)通路重要上游的細(xì)胞因子，是一種具有多種生理功能的炎性細(xì)胞因子，KOA發(fā)生后，IL-6能與IL-6受體結(jié)合，激活下游JAK/STAT信號(hào)通路，使得JAK2和磷酸化JAK2(p-JAK)的表達(dá)量均顯著增加，進(jìn)而誘導(dǎo)STAT3蛋白表達(dá)量增加，間接誘導(dǎo)ERK1蛋白表達(dá)上調(diào)[12]。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)調(diào)控JAK/STAT信號(hào)通路，可以抑制骨性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)，抑制軟骨細(xì)胞凋亡，明顯緩解關(guān)節(jié)軟骨的退變[13-15]。

圖1 各組兔膝關(guān)節(jié)HE染色表現(xiàn)(×400)

圖2 各組兔滑膜組織中JAK2、p-JAK、STAT3、ERK1蛋白表達(dá)情況

KOA屬于祖國(guó)醫(yī)學(xué)“骨痹”“痹證”范疇，該病以中老年患者居多，是由于中年以后，肝腎精血虛虧，筋骨失養(yǎng)，氣血運(yùn)行不暢， 經(jīng)脈不通，不通則痛，不通則腫。所以治療重在滋補(bǔ)肝腎、益氣活血、舒筋活絡(luò)[6]。復(fù)方竹節(jié)參片以益氣活血、散瘀止痛的竹節(jié)參為君藥，以血當(dāng)歸、白芍、淫羊藿為臣藥，與君藥合用以達(dá)養(yǎng)血活血、滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋壯骨之效；佐以搜風(fēng)除濕、散寒逐瘀之青風(fēng)藤、地蜂子、穿地龍等，共奏滋補(bǔ)肝腎、益氣活血、祛風(fēng)除濕之功，組方用藥與KOA中醫(yī)病機(jī)相契合。

本研究采用經(jīng)典的木瓜蛋白酶膝關(guān)節(jié)腔注射進(jìn)行KOA兔模型造模，探討了復(fù)方竹節(jié)參片治療KOA的可能作用機(jī)制。結(jié)果顯示，木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的KOA模型家兔關(guān)節(jié)明顯腫脹；膝關(guān)節(jié)病理切片表現(xiàn)為軟骨組織結(jié)構(gòu)破壞，滑膜細(xì)胞增生變形，有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；血清IL-6水平及滑膜組織中JAK2、p-JAK、STAT3、ERK1蛋白表達(dá)量顯著升高。提示木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射可以誘導(dǎo)膝關(guān)節(jié)的炎性反應(yīng)，從而促進(jìn)炎性因子IL-6的分泌，進(jìn)而激活JAK/STAT信號(hào)通路，進(jìn)一步加重關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致軟骨的破壞和滑膜的增生，最終形成KOA。給予模型家兔復(fù)方竹節(jié)參片干預(yù)后，家兔血清IL-6水平及滑膜組織中JAK2、p-JAK、STAT3、ERK1表達(dá)量均明顯降低，提示復(fù)方竹節(jié)參片可能通過(guò)抑制炎性因子IL-6表達(dá)，從而抑制JAK/STAT信號(hào)通路，進(jìn)而減輕關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)，減少軟骨細(xì)胞的破壞，最終達(dá)到治療KOA的目的，分析IL-6、JAK2、p-JAK、STAT3、ERK1是復(fù)方竹節(jié)參片的主要作用靶點(diǎn)。

目前尚未見(jiàn)經(jīng)典的治療KOA的成藥，故本研究未設(shè)置陽(yáng)性藥物對(duì)照，在治療作用的比較上尚存在一定的局限性。此外，以木瓜蛋白酶誘導(dǎo)的KOA動(dòng)物模型是否具有相應(yīng)的中醫(yī)證候?qū)傩?，是否符合?fù)方竹節(jié)參片的組方特色，還有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。