李 強，盧 娟，郭洪章，李建國，劉軍剛，楊晨旭

(1. 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2. 暨南大學，廣東 廣州 510000)

潰瘍性壓瘡是長期臥床或骨折患者皮膚易出現(xiàn)的最嚴重并發(fā)癥，深度潰瘍期可累及肌肉、筋膜甚至骨骼，具有難斂、難愈、病程長、易復發(fā)等臨床特點，國家中醫(yī)藥管理局認定該病為外科疑難病癥，亦為國際上面臨的醫(yī)學難題。如治療不及時，可導致肉腐骨露并感染，并發(fā)癥及病死率較高[1-2]?，F(xiàn)代醫(yī)學對潰瘍性壓瘡尚無統(tǒng)一有效的治療方案，既往研究表明中藥外用可促進慢性潰瘍愈合[3]。養(yǎng)陰生肌散為甘肅省中醫(yī)院院內制劑，已臨床應用30多年，在治療潰瘍性疾病方面療效顯著[4-5]。養(yǎng)陰生肌散為中藥復方制劑，其中龍膽草為君藥，具有收斂生肌、消炎止痛的功效。前期高效液相色譜分析結果表明，龍膽苦苷是養(yǎng)陰生肌散的主要成分[5]，可能在養(yǎng)陰生肌方面起主要作用。相關實驗研究報道，龍膽苦苷具有很好的抗炎、消腫止痛作用[6-9]。然而龍膽苦苷單體在治療潰瘍性壓瘡方面的研究尚未見報道，故本課題組進行了相關研究，現(xiàn)將結果報道如下。

1 實驗材料方法

1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠48只，體重(250±20)g，飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心，動物許可證號:SCXK(甘)2011-0001，實驗動物設施證號:SYXK(甘)2011-0001。 動物飼養(yǎng)于標準條件：室溫18～22 ℃，濕度40%～60%，自由飲食。

1.2藥物 養(yǎng)陰生肌散(龍膽草、雄黃、牛黃、青黛、冰片等組成)由甘肅省中醫(yī)院藥劑科提供(甘藥制字Z04000835)。龍膽苦苷分析純購于四川省禾益康生物科技有限公司(CAS號：20831-76-9)。

1.3試劑與儀器 抗增殖細胞核抗原(PCNA)單克隆抗體(英國Abcam公司)；Mayer’s蘇木素染液(北京索萊寶科技有限公司)；免疫組化筆(北京中杉金橋生物科技有限公司)；免疫組化試劑盒(博士德生物工程有限公司)；PCR引物(天一輝遠生物科技有限公司)；qRT-PCR試劑盒(大連TaKaRa生物技術有限公司)；實時定量Agilent PCR儀(美國安捷倫科技公司)；組織石蠟切片機(LEICA公司)；KD-BMII型組織包埋機(浙江省金華市科迪儀器設備有限公司)；PHY-III型組織漂烘機(常州市中威電子儀器有限公司)；高速離心機(湖南省長沙市康湘英離心機有限公司)；通用器械(上海醫(yī)療器械有限公司)。

1.4實驗方法 雄性SD大鼠適應性喂養(yǎng)3 d后，隨機分為正常對照組、模型組、養(yǎng)陰生肌散組及12.5 mg龍膽苦苷組、25 mg龍膽苦苷組、50 mg龍膽苦苷組，每組8只。除正常對照組外，其余各組大鼠參照文獻[6]方法造模，即在10%水合氯醛 (300 mg/kg) 腹腔注射麻醉后，使大鼠仰臥固定于大鼠固定板上，用一重量為0.56 kg的鋼柱垂直施壓于大鼠左后肢，主要受壓的肌肉為股內收肌和恥骨肌，鋼柱和肢體的接觸面積為直徑1 cm的圓形表面，受壓部位單位面積承受的壓力為70 kPa，施壓5 h。正常對照組大鼠麻醉后仰臥固定于固定板上5 h。造模后解除固定，常規(guī)單只分籠飼養(yǎng)[10]，養(yǎng)陰生肌散組大鼠壓瘡部位均勻撒敷50 mg養(yǎng)陰生肌散藥粉，龍膽苦苷各組大鼠撒敷相應劑量龍膽苦苷藥粉，模型組大鼠清創(chuàng)后用安爾碘消毒劑涂擦創(chuàng)面，均2次/d，無菌敷料紗布遮蓋，干預15 d。

1.5觀察指標及方法

1.5.1創(chuàng)面面積、愈合率及愈合時間 分別在干預3 d、7 d、11 d、15 d后，采用最小刻度為0.5 mm皮尺測量受壓骨骼肌創(chuàng)面面積；觀察各組干預15 d后創(chuàng)面愈合率，統(tǒng)計各組創(chuàng)面愈合時間。創(chuàng)面愈合率=(創(chuàng)面原始面積-創(chuàng)面未愈面積)/創(chuàng)面原始面積×100%。

1.5.2病理形態(tài)學 干預15 d后，麻醉下處死各組大鼠并取出創(chuàng)面骨骼肌組織，采用10%福爾馬林固定后，石蠟包埋，切片厚度4 μm，進行常規(guī)HE染色，在光學高倍顯微鏡下觀察各組織炎性物質浸潤情況。

1.5.3骨骼肌組織中PCNA蛋白表達水平 將骨骼肌纖維組織在4%多聚甲醛中固定并用PBS漂洗后，酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切4 μm厚度切片后，嚴格按照免疫組化操作進行抗原修復、消除內源性過氧化物酶、封閉后抗體孵育、鏈酶蛋白酶-HRP孵育、DAB顯色、蘇木素復染、透明封片等處理后，光學顯微鏡下觀察并拍照。使用Nikon圖像分析軟件分別計算每個切片上組織全貌總面積、染色陽性面積、積分光密度，計算平均灰度值，灰度值=染色陽性面積/組織全貌總面積×積分光密度。

1.5.4骨骼肌組織中 PCNA mRNA表達水平 采用實時熒光定量PCR法檢測：將25 mg創(chuàng)面骨骼肌纖維組織參照總RNA提取試劑盒法提取總RNA。Nanodrop儀上測RNA濃度及純度。檢測A260/A280的比值在1.8～2.1，提示RNA質量較好。取2 g RNA反轉錄成cDNA，引物序列如下：GAPDH上游為5’-GCAAGTTCAACGGCACAG-3’，下游為5’-GCCAGTAGACTCCACGACA-3’；PCNA上游為5’-TTGGCAATGGGAACA-3’，下游為5’-GACAGTGGAGTGGCTTT-3’。然后按兩步法進行擴增，用于RT-qPCR的樣本量為2 L，反應條件為：95 ℃預變性15 s；95 ℃變性10 s，54 ℃退火60 s，循環(huán)次數(shù)40次，進行擴增，結果比較用ΔΔCt法。

2 結 果

2.1各時間點創(chuàng)面愈合面積比較 干預3 d、7 d、11 d、15 d后，養(yǎng)陰生肌散組及龍膽苦苷各組創(chuàng)面面積均顯著低于同期模型組(P均<0.05)，且50 mg龍膽苦苷組干預15 d后創(chuàng)面面積顯著低于同期養(yǎng)陰生肌散組(P<0.05)。見表1。

2.2各組創(chuàng)面愈合率及愈合時間比較 干預15d后，養(yǎng)陰生肌散組及龍膽苦苷各組創(chuàng)面愈合率均顯著高于模型組(P均<0.05)，且50 mg龍膽苦苷組創(chuàng)面愈合率顯著高于養(yǎng)陰生肌散組(P<0.05)。養(yǎng)陰生肌散組及龍膽苦苷各組創(chuàng)面愈合時間均顯著短于模型組(P均<0.05)，且50 mg龍膽苦苷組顯著短于養(yǎng)陰生肌散組(P<0.05)。見表2。

表1 各組大鼠干預后不同時間創(chuàng)面面積比較

2.3各組創(chuàng)面骨骼肌纖維組織形態(tài)學表現(xiàn) HE染色顯示，正常對照組組織結構清晰；模型組創(chuàng)面組織有大量炎性細胞浸潤，組織有水腫，血管有擴張；養(yǎng)陰生肌散組可見零星炎性細胞浸潤，部分組織水腫，血管輕微擴張，少量的新生組織；12.5 mg龍膽苦苷組可見較多炎性細胞浸潤，組織有水腫，血管有擴張；25 mg龍膽苦苷組可見少量炎性細胞浸潤；50 mg龍膽苦苷組可見零星的炎性細胞，無血管擴張，較多新生組織形成。見圖1。

表2 各組大鼠干預后創(chuàng)面愈合時間及愈合率比較

2.4各組創(chuàng)面骨骼肌組織中PCNA蛋白及mRNA表達水平 免疫組化結果顯示，正常對照組可見骨骼肌細胞，無PCNA陽性細胞；模型組可見少許PCNA陽性細胞，主要散在分布在壓瘡面及與正常組織交接的邊緣；養(yǎng)陰生肌散組可見較多PCNA陽性細胞，分布在創(chuàng)面中央和創(chuàng)面邊緣，同時有大量肌細胞增殖；50 mg龍膽苦苷組可見PCNA陽性細胞分布密集，同時伴有肌細胞增生，見圖2。養(yǎng)陰生肌散組及龍膽苦苷各組創(chuàng)面骨骼肌組織中PCNA mRNA及蛋白表達水平均顯著高于模型組(P均<0.05)，且50 mg龍膽苦苷組增高明顯，但與養(yǎng)陰生肌散組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)，見表3。

圖1 各組大鼠骨骼肌組織HE染色表現(xiàn)(×400)

圖2 各組大鼠骨骼肌組織中PCNA蛋白表達情況(×400)

3 討 論

潰瘍性壓瘡為臨床中常見的外科難治性疾病，創(chuàng)面易反復感染并炎性滲出，病情嚴重者甚至并發(fā)敗血癥或需截肢，嚴重影響患者的生活質量，給患者帶來巨大的心理壓力及經(jīng)濟負擔[11]。本病屬于中醫(yī)“臁瘡”等范疇，《靈樞·癰疽》記載“熱勝則肉腐，肉腐則為膿”，其病機以正虛為本，濕熱毒侵犯，腐肉生成引發(fā)皮膚潰瘍[12]?！办’彙钡闹嗅t(yī)外治首見于漢，古人描述“外科之法, 最重外治”，中醫(yī)外治法相比較中藥內服具有藥量小、不良反應少、用法簡單及臨床療效好的特點。

表3 各組大鼠骨骼肌組織中PCNA蛋白及mRNA表達水平比較

既往研究表明，龍膽苦苷具有明顯的抗炎作用[6-9]。張艷霞等[8]研究表明，龍膽苦苷能夠降低關節(jié)炎模型大鼠血清中白細胞介素-1β(IL-1β)、環(huán)氧合酶-2(COX-2)、前列腺素E2(PGE2)水平。趙文娜等[9]研究發(fā)現(xiàn)，龍膽苦苷能夠顯著降低結腸炎大鼠血清中白細胞介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性因子水平，并隨著用藥劑量的增加效果越顯著；病理學觀察發(fā)現(xiàn)，龍膽苦苷能顯著減少炎性細胞的數(shù)量，促進大腸腸黏膜組織的修復。本實驗結果顯示，龍膽苦苷能夠顯著促進潰瘍性壓瘡大鼠創(chuàng)面愈合，提高創(chuàng)面愈合率，縮短創(chuàng)面愈合時間，能有效減少炎性細胞數(shù)量及促進新生組織形成。

PCNA在細胞核內合成，并存在于細胞核內，為DNA聚合酶δ的輔助蛋白，其含量能夠良好反映細胞的增殖情況[13]。本實驗結果顯示，龍膽苦苷能夠顯著增加潰瘍性壓瘡創(chuàng)面骨骼肌組織中PCNA蛋白及mRNA表達，促進肌細胞增殖。

綜上所述，養(yǎng)陰生肌散主要是通過龍膽苦苷成分發(fā)揮治療潰瘍的作用；龍膽苦苷能夠有效縮短潰瘍性壓瘡創(chuàng)面愈合時間并提高愈合率，促進創(chuàng)面細胞的增殖及新生組織的形成，減少炎性細胞，其機制可能與龍膽苦苷可上調潰瘍性壓瘡創(chuàng)面組織細胞中PCNA的表達相關。本實驗既為龍膽苦苷單體藥物治療潰瘍性壓瘡提供了理論和實驗支持，也為臨床劑型改進提供了理論參考。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。