李依琳，李勇，楊燁，尚海瓊，林小燕，高馨怡，劉湘

變應(yīng)性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是特應(yīng)性個體在接觸過敏原后鼻黏膜產(chǎn)生由免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的非感染性炎癥反應(yīng)性疾病[1]。大量研究表明，AR的發(fā)生發(fā)展由多個遺傳基因調(diào)控[2-3]，但具體的基因調(diào)控機制尚不明確。AR患者血液IL-4 高水平表達時可誘導(dǎo)特異性IgE的合成和分泌，加快炎癥細胞的成熟、聚集，從而誘導(dǎo)過敏性疾病的發(fā)生[2,4-5]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt，但缺乏翻譯能力的RNA。有研究發(fā)現(xiàn)，在變態(tài)反應(yīng)過程中，多種lncRNA通過調(diào)節(jié)免疫細胞的分化和激活發(fā)揮免疫調(diào)控的作用[6-8]。在lncRNA中，長鏈非編碼RNA-RTL1(long non-coding RNA-RTL1， lnc-RTL1)位于人體14號染色體的DLK1-DIO3印記域，屬于父本表達的蛋白質(zhì)編碼基因[9],筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，在AR患者鼻黏膜組織中l(wèi)nc-RTL1存在差異性表達，但其和AR臨床指標之間的關(guān)系仍需進一步探討。本研究通過qRT-PCR檢測AR患者鼻黏膜組織中l(wèi)nc-RTL1表達水平，分析lnc-RTL1表達與AR相關(guān)臨床指標(癥狀及生活質(zhì)量評分、血清IL-4)的關(guān)系，從轉(zhuǎn)錄后水平研究AR的潛在病理生理機制，為AR的預(yù)防和治療提供新的思路和理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 實驗對象的選擇

選取2019年7月至2020年1月在杭州市第一人民醫(yī)院耳鼻咽喉科住院的48例患者，其中實驗組25例，為伴鼻中隔偏曲的AR患者，男17例，女8例；對照組23例，為單純鼻中隔偏曲患者，男19例，女4例。

AR納入標準：(1)患者年齡在18至60歲之間，性別不限；(2)全部患者均根據(jù)變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南(2015年,天津)[10]診斷為AR，同時患有鼻中隔偏曲且下鼻甲明顯肥大，要求手術(shù)治療；(3)表現(xiàn)出的AR癥狀典型；(4)有明確的過敏原陽性指標，如皮膚點刺結(jié)果顯示塵螨陽性或血清過敏原特異性IgE抗體顯著升高；同時滿足所有條件者可納入實驗組。排除標準：(1)患有嚴重基礎(chǔ)疾病，如凝血功能障礙、良惡性腫瘤及免疫缺陷性疾??；(2)患有鼻息肉、真菌性鼻竇炎等鼻炎相關(guān)性疾??；(3)2周內(nèi)有全身或鼻腔抗組胺藥物或類固醇激素使用史；(4)正在或既往有過特異性免疫治療史；(5)AR相關(guān)癥狀視覺量表評分≤3分，滿足于以上任一選項者不納入研究對象。對照組納入標準：單純患有鼻中隔偏曲且不伴有AR，并要求手術(shù)的患者。本研究經(jīng)過杭州市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準，并簽署患者知情同意書。

試劑Human Interleukin 4(IL4) ELISA試劑盒(48T*1)，上海藍基生物科技有限公司生產(chǎn)；RNA loading buffer，Solarbio公司生產(chǎn)；TRIZOL試劑及組織RNA提取試劑盒，Thermofisher公司生產(chǎn)；Sybgreen實時熒光定量試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，Takara公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 一般資料收集及癥狀評分

收集48例研究對象的一般臨床資料，按照納入標準及排除標準分為AR組及對照組，AR組研究對象在研究人員的指導(dǎo)下完成RQLQ和VAS問卷。RQLQ量表采用問卷調(diào)查的方式對AR患者的日?；顒?、社交活動、睡眠質(zhì)量、鼻部癥狀、眼部癥狀、情緒等方面做出評分，以數(shù)字0～6表示，0-沒有困擾, 6-極度困擾,數(shù)字越大困擾程度越深[11]。VAS量表為10 cm長的橫向刻度卡尺，對患者的鼻癢、鼻塞、流涕及打噴嚏癥狀做出評價，一端標0表示無癥狀；另一端為10表示癥狀難以忍受；中間數(shù)字依次表示程度遞增，受試者根據(jù)主觀感受在直線上作記號以表示強度，測量起點至記號處的距離為測量值[12]。所有表單的填寫由同一位研究人員負責，以確保表單的真實性及完整性。

1.2.2 樣本收集

在無菌操作下采集48例研究對象1～2 mL外周血，所取血液樣本室溫靜置2 h，再于3 500 r/min離心15 min取其上清液，保存于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。48例患者均需行鼻中隔矯正術(shù)和下鼻甲減容術(shù)，術(shù)前需提前兩周停用激素類藥物，并每日沖洗清理鼻腔，術(shù)中取部分下鼻甲后端黏膜組織，快速放入生理鹽水中清洗干凈后，取部分標本放入含有RNA-Later固定液的試管中，充分搖勻后置于-80 ℃冰箱備用。

1.2.3 ELISA實驗步驟

通過酶聯(lián)免疫方法(ELISA)檢測AR患者外周血IL-4的濃度，檢測方法嚴格按ELISA試劑盒說明書操作。操作步驟如下：取出Human IL-4 ELISA試劑盒，于室溫(20～25 ℃)下放置30 min；取出酶標板，按照標準品的次序分別加入100 μL的標準品溶液于空白微孔中；然后向空白微孔中加入100 μL的樣品，空白對照管則加入100 μL的蒸餾水；接著在各孔中加入50 μL的酶標記溶液(不含空白對照孔)；用封口膠將酶標板密封后，置于37 ℃恒溫恒濕環(huán)境下孵育反應(yīng)1 h；孵育完成后取出，充分清洗酶標板3～5次，保持各孔有充足的水壓(濃縮洗滌液以1∶100的比例與蒸餾水稀釋)，洗滌后用吸水紙徹底拍干。接著于各孔依次加入顯色劑A 50 μL及顯色劑B 50 μL。放置于20～25 ℃下避光反應(yīng)10 min。最后各孔加入50 μL終止液，終止反應(yīng)。

1.2.4 RNA的提取和qRT-PCR

取部分鼻黏膜組織經(jīng)液氮研磨后，重復(fù)PBS洗滌組織標本兩次，加入1 mL Trizol裂解液，經(jīng)過充分混勻后于室溫環(huán)境靜置10 min；然后混合200 μL氯仿劇烈振蕩15 s，重復(fù)室溫靜置10 min；經(jīng)過12 000 r/min、4 ℃離心15 min后，取上層水相轉(zhuǎn)移到新的EP管中；加入等體積異丙醇，輕輕混勻，放置于室溫靜置10 min；再次12 000 r/min、4 ℃離心10 min，棄上清液，取沉淀，用75%乙醇洗滌2次；風(fēng)干后用15～ 30 μL DEPC水溶解得到 RNA 原液。電腦運行NanoDrop 2000軟件，并選定測RNA，然后使用RNA free的水洗測試頭3次，并使用無塵紙擦干，接著使用0.1% DEPC水作為空白對照調(diào)零，最后吸取1 μL的待測樣品加到測試頭上，選擇測定RNA濃度，將測定好的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄，通過熒光定量RT-PCR檢測兩組患者鼻黏膜組織中l(wèi)nc-RTL1表達水平，PCR引物序列如下：GAPDH-F:5′-T-GTTGCCATCAAT-GACCCCT-3′,GAPDH-R:5′-CTC-CACGACGTACTCAGCG-3′;lnc-RTL1-8:1-F:5′-AC-CTTGGAGCCTGCTTACG-3′,lnc-RTL1-8:1-R: 5′-GG-TTCTTCCATGTCC-AGCAT-3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism7.0和SPSS 23.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。兩獨立樣本非參數(shù)檢驗Mann-WhitneyU秩和檢驗進行兩組間差異性分析，采用Spearman相關(guān)性檢驗分析鼻黏膜組織中l(wèi)nc-RTL1表達水平與血清特異性IL-4、AR癥狀評分的相關(guān)性。P<0.05認為差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料

25例AR患者，男女比例為17∶8，發(fā)病年齡13～64歲，平均年齡38.2歲。對照組23例，男女比例為19∶4，年齡24～58歲，平均年齡41.6歲。收集兩組患者臨床特征資料，兩組男女性別、年齡以及相關(guān)疾病比例均通過卡方檢驗(P>0.05)(表1)。VAS評分AR組平均98.92分，對照組平均69.43分；RQLQ評分AR組平均84.28分，對照組平均63.09分。

2.2 樣本數(shù)據(jù)

ELISA檢測研究對象外周血血清IL-4的濃度，AR組高于對照組(圖1)，結(jié)果有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。熒光定量RT-PCR檢測兩組患者鼻黏膜組織中l(wèi)nc-RTL1表達水平，發(fā)現(xiàn)AR組患者鼻黏黏膜中l(wèi)nc-RTL1表達水平高于對照組，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。對鼻黏膜中l(wèi)nc-RTL1表達水平與血清IL-4水平進行Spearman相關(guān)性分析，結(jié)果顯示差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)(圖3)；鼻黏膜中l(wèi)nc-RTL1表達水平與AR患者RQLQ和VAS問卷評分進行Spearman相關(guān)分析，結(jié)果顯示差異有統(tǒng)計意義(P<0.001)(圖4～5)。

圖 2 變應(yīng)性鼻炎組及對照組鼻黏膜組織中l(wèi)nc-RTL1的表達

圖 3 AR患者鼻黏膜組織中l(wèi)nc-RTL1表達水平與血清IL-4的相關(guān)性

圖 4 AR患者鼻黏膜組織中l(wèi)nc-RTL1表達水平與VAS癥狀評分的相關(guān)性

圖 5 AR患者鼻黏膜組織中l(wèi)nc-RTL1表達水平與RQLQ生活質(zhì)量評分的相關(guān)性

3 討論

AR的發(fā)病機制復(fù)雜，目前多數(shù)學(xué)者的研究主要集中在“Th1/Th2細胞平衡學(xué)說”、“Treg/Th17平衡學(xué)說”、IL-5、IL-6、IL-17等多種細胞因子水平[13-17]，近來有研究發(fā)現(xiàn)Th9、中性粒細胞及新發(fā)現(xiàn)的 2 型固有淋巴樣細胞(group 2 innate lymphoid cells，ILC2)也參與了AR的發(fā)病并影響治療反應(yīng)[18-19]。AR的發(fā)病過程中有眾多炎性細胞、細胞因子、趨化因子等共同參與，其中IL-4、IL-10和IL-13等細胞因子介導(dǎo)體液免疫并作用于B細胞，主要功能為刺激B細胞增殖并產(chǎn)生免疫球蛋白G1和IgE抗體[14]。IL-4能夠加強B細胞對T細胞的抗原遞呈作用，從而促進炎癥反應(yīng)的發(fā)生，臨床上表現(xiàn)出AR的癥狀[20-21]，研究表明AR患者血清中IL-4常較正常人偏高[22]。本研究通過ELISA檢測AR患者和健康人血清IL-4水平，結(jié)果顯示AR患者血清中IL-4表達水平明顯高于健康人，與上述研究結(jié)果一致。由此可見，血清IL-4參與了AR的病理發(fā)生過程，與AR的關(guān)系十分密切。

隨著基因組學(xué)的迅速發(fā)展，研究發(fā)現(xiàn)非編碼RNA在部分疾病的發(fā)生發(fā)展中起著決定性作用[23],曾一度被認為是無功能“轉(zhuǎn)錄垃圾”的非編碼RNA，近年來被證實在疾病發(fā)生發(fā)展過程以及細胞分化、生物發(fā)育中發(fā)揮巨大作用[24]。其中長鏈非編碼RNA是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的非編碼RNA,被認為參與了表觀遺傳調(diào)控、細胞周期調(diào)控和細胞分化調(diào)控，并積極參與包括癌癥在內(nèi)的多種生物學(xué)過程和病理狀態(tài)[25]。有研究在14q32號染色體上發(fā)現(xiàn)一個印記簇，包括DIO3基因區(qū)域的父系表達印跡基因之一lnc-RTL1[26]，筆者前期研究應(yīng)用基因芯片的方法發(fā)現(xiàn)lnc-RTL1在AR患者鼻黏膜組織中存在顯著差異性表達，可能通過調(diào)控相關(guān)下游信號分子表達參與AR發(fā)病機制中某些特定的生物學(xué)過程和信號通路[27]。在前期研究的基礎(chǔ)上本研究進一步通過qRT-PCR檢測lnc-RTL1在AR患者和健康人群中均有表達，發(fā)現(xiàn)前者lnc-RTL1表達水平高于后者且具有顯著差異，提示lnc-RTL1在AR的發(fā)生發(fā)展中可能起正向基因調(diào)控作用。

近年來研究發(fā)現(xiàn)，Toll樣受體(Toll-like receptors，TLR)作為參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，調(diào)控Thl/Th2應(yīng)答[28-29]。TLR能夠激活細胞內(nèi)的信號介質(zhì)——促分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)等，從而誘導(dǎo)炎癥因子的表達。有研究通過建立變應(yīng)性鼻炎大鼠模型發(fā)現(xiàn)，在Toll樣受體核因子通路(TLR-NF-κB)信號傳導(dǎo)中，NF-κB高表達可抑制IL-4的生成并促進干擾素-γ的生成，導(dǎo)致免疫偏移[30]。研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cεRI信號通路中的MAPK13基因為lnc-RTL1的潛在調(diào)控靶點[31]，提示lnc-RTL1可能在基因?qū)用嫔蠈oll樣受體表達有調(diào)控作用。

Qian等[8]進行相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA ANRIL與IL-4、IL-6、IL-13均呈正相關(guān)，與IL-10和IFN-α呈負相關(guān)，說明lncRNA在基因?qū)用嫔蠈R的發(fā)病機制和炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生具有一定程度的調(diào)控作用。本研究對AR鼻黏膜上皮細胞lncRNA lnc-RTL1與血清IL-4水平進行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)AR患者鼻黏膜lnc-RTL1表達水平與血清IL-4水平無明顯相關(guān)性，提示lnc-RTL1可能不參與IL-4的蛋白表達調(diào)控，而是通過調(diào)控其他AR相關(guān)細胞因子蛋白的表達，從而對AR的發(fā)病機制產(chǎn)生一定作用。

AR癥狀反復(fù)發(fā)作，嚴重影響患者生活質(zhì)量甚至生長發(fā)育。目前評價AR癥狀嚴重程度最常用的疾病專用量表是RQLQ以及VAS量表。通過Spearman相關(guān)分析，本研究進一步對鼻黏膜上皮細胞中l(wèi)nc-RTL1表達水平與AR患者炎癥癥狀的相關(guān)性進行探討，發(fā)現(xiàn)lnc-RTL1表達水平與AR患者主觀癥狀評分和生活質(zhì)量評分呈負相關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)，即AR病情越嚴重，鼻黏膜lnc-RTL1表達水平越低。由于lnc-RTL1在AR患者鼻黏膜中表達水平較正常人高，提示lnc-RTL1可能是一項AR保護性指標。

本研究從鼻黏膜lnc-RTL1表達與血清IL-4以及AR患者癥狀的關(guān)系角度著手研究，探討lnc-RTL1表達水平與AR嚴重程度的相關(guān)性，從基因?qū)用嫔蠟锳R的預(yù)防和治療提供研究新思路。由于樣本量及研究條件限制，且本研究只從lnc-RTL1入手研究，還存在一定的不足，目前l(fā)nc-RTL1在AR發(fā)病機制中的研究尚未成熟，有待于在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上進行更加深入的探索。