凌曉靜，許志強，胡巧麗，潘晨，朱理想，魏繼福

過敏性疾病發(fā)病率在全球范圍內(nèi)逐步升高，其中花粉誘導的過敏性疾病也呈逐步上升趨勢[1]。據(jù)統(tǒng)計，我國蒿屬植物有187種，主要分布于我國北方和西南地區(qū)，是引起過敏性鼻炎和氣道高反應性疾病的主要室外過敏原[2-4]。蒿屬植物花粉顆粒較小，直徑為19～25 μm易隨風飄散，產(chǎn)粉量大，且患者過敏癥狀的嚴重程度與空氣中花粉含量呈相關性，蒿屬花粉是我國北方夏秋季主要氣傳性花粉過敏原[1,5-6]。其中，大籽蒿(ArtemisiasieversianaWilld)、黃花蒿(A.annuaL.)和艾蒿(A.vulgaris)是我國蒿屬致敏花粉的三大主要來源，不同于歐洲以艾蒿花粉為主[4]。然而，目前用于過敏原特異性IgE檢測的“金標準”ImmunoCAP，其檢測對象還是主要針對艾蒿(商品編碼：w6)、苦艾蒿(商品編碼：w5)以及部分已鑒定的艾蒿過敏原分子Art v 1(商品編碼：w231)和Art v 3(商品編碼：w233)。雖然國內(nèi)已有黃花蒿花粉變應原點刺液和注射液產(chǎn)品，但其中未明確具體過敏原分子信息,極大地限制了產(chǎn)品標準的制定、患者致敏特征和治療效果在分子水平上的評估以及診斷產(chǎn)品和疫苗的進一步研究發(fā)展。迄今為止，已被國際免疫學聯(lián)合會(International Union of Immunological Societies, WHO/IUIS)命名的黃花蒿花粉過敏原分子共有4種，分別為A.annua1[7]、A.annua2[7]、A.annua3[7]和A.annua7[7-8](http://www. allergen.org)，相比于其同屬物種艾蒿已鑒定的6種過敏原分子(Art v 1-6)[9-14]， 對黃花蒿花粉過敏原分子的研究較少，仍可能存在未明確過敏原。本研究結合轉(zhuǎn)錄組學對黃花蒿花粉進行分析并尋找其中潛在新過敏原，進一步完善黃花蒿花粉中致敏組分信息及其在中國人群中的致敏特征，以促進精準的分子診斷和治療發(fā)展。

1 方法與材料

1.1 材料

黃花蒿花粉轉(zhuǎn)錄組測序由北京奧維森基因科技有限公司負責，南京金斯瑞生物科技有限公司主要負責DNA引物合成以及克隆菌基因測序。PCR試劑盒(TaKaRa Ex Taq, 10×Ex Taq Buffer, dNTP Mixture)，TA克隆試劑盒(pMDTM19-T Vector Cloning Kit)，DNA凝膠純化試劑盒(TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit)，pET-28a質(zhì)粒載體限制性雙切酶(QuickCutTMXho Ⅰ和QuickCutTMNco Ⅰ)，異丙基硫代半乳糖苷 (isopropyl thiogalactoside, IPTG)等都購于寶生物工程(大連)有限公司。重組克隆試劑盒(ClonExpress Ⅱ one step Cloning Kit)購于諾維贊公司。純化重組蛋白的high affinity Ni-NTA resin購于金斯瑞生物科技有限公司。用于ELISA實驗的四甲基聯(lián)苯胺(tetramethyl benzidine, TMB)顯色液、終止液購于碧云天生物技術公司，Anti-IgE(辣根過氧化物酶(horse radish peroxidase, HRP)標記的羊抗人的IgE)購于美國KPL公司。 Western blot實驗中的ECL顯影液和PVDF膜均購于Merck公司。

1.2 方法

1.2.1 黃花蒿花粉烯醇化酶基因克隆和擴增

將轉(zhuǎn)錄組測序結果與WHO/IUIS過敏原數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLAST(basic local alignment search tool, BLAST)同源序列比對分析，得到一個與其他物種過敏原同源的黃花蒿花粉烯醇化酶(enolase)潛在過敏原序列。根據(jù)所得烯醇化酶cDNA序列設計引物5′-CGGGGGATTCCAGTTTC-3′，5′-GATTGCATGGACACTCAAC-3′，進行PCR擴增，對產(chǎn)物TA克隆并測序進一步驗證。根據(jù)序列編碼區(qū)設計重組引物并克隆至pET-28a的NcoⅠ和XhoⅠ位點構建重組質(zhì)粒。

1.2.2 黃花蒿花粉烯醇化酶序列比對

根據(jù)allergome數(shù)據(jù)庫(http://www.allergen. org)中收錄的已報道蛋白類型屬于烯醇化酶的過敏原序列，利用clustalX2與黃花蒿花粉烯醇化酶進行多重序列比對，分析與其他物種烯醇化酶氨基酸序列之間的保守性。運用MEGA7采用鄰近法(N-J法)構建進化樹分析其進化關系。

1.2.3 黃花蒿花粉烯醇化酶的表達和純化

將已經(jīng)構建好的含有編碼黃花蒿花粉烯醇化酶的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞，加入終濃度1 mmol/L IPTG誘導蛋白表達，通過SDS-PAGE電泳驗證并挑選能夠表達目的蛋白的菌落并進行大規(guī)模誘導培養(yǎng)，通過SDS-PAGE驗證蛋白在大腸桿菌中的表達形式后，變性條件下(100 mmol/L NaH2PO4，10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0)通過Ni2+親和層析純化目的蛋白并使用梯度透析法(8→6→4→2→0 mol/L)除去蛋白中的尿素進行蛋白復性。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附反應實驗(enzyme-linked immunosorbent reaction, ELISA)

將1μg的重組黃花蒿花粉烯醇化酶于4 ℃過夜包被至ELISA板孔中，并用1%牛血清白蛋白(BSA)封閉。后加入1∶10稀釋于PBS-0.1% Tween 20的蒿屬過敏患者血清100μL/孔，37 ℃孵育2 h后使用PBS-0.1% Tween 20進行洗滌，使用HRP標記的羊抗人IgE作為二抗和TMB顯色液對結合在黃花蒿花粉烯醇化酶上的IgE進行檢測。

1.2.5 免疫印跡實驗(Western blot)

10 μg的黃花蒿烯醇化酶經(jīng)過SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印至PVDF膜，經(jīng)過5%脫脂牛奶封閉后，與ELISA中陽性的血清(1∶10稀釋于PBS-0.1% Tween 20)在4 ℃孵育過夜，洗滌后使用HRP標記的羊抗人IgE和化學發(fā)光法檢測結合在PVDF膜上黃花蒿花粉烯醇化酶的IgE。

1.2.6 競爭抑制實驗(inhibition enzyme-linked immunosorbent reaction, iELISA)

2 結果

2.1 黃花蒿花粉烯醇化酶基因的克隆和擴增

轉(zhuǎn)錄組測序所得黃花蒿烯醇化酶基因序列經(jīng)PCR擴增，瓊脂糖電泳結果顯示擴增產(chǎn)物大小在1 000～2 000 bp之間(圖1A)。隨后對產(chǎn)物克隆和測序得到一個長度為1 433 bp的基因片段，開放閱讀框為1 335 bp，編碼444個氨基酸(圖1B)。根據(jù)clustalX2的多重序列比對，黃花蒿花粉烯醇化酶與矮豚草Amb a 12的相似性最高(91%)，其次為橡膠樹Hev b 9(89%)，與玉米Zea m 22和百慕大草Cyn d 22相似性均為88%，與其他14個烯醇化酶過敏原的氨基酸序列的相似性在56%～68%之間(圖2)。對黃花蒿花粉烯醇化酶與18個其他來源的烯醇化酶過敏原進行進化樹分析，黃花蒿花粉烯醇化酶與矮豚草Amb a 12聚為一簇，同屬于菊科植物，自展值為72。黃花蒿花粉烯醇化酶連同Amb a 12又與大戟科橡膠樹乳膠Hev b 9聚成一簇，自展值為63(圖1C)。

2.2 黃花蒿花粉烯醇化酶的表達、純化

根據(jù)誘導超聲后SDS-PAGE電泳圖驗證蛋白主要以包涵體表達(箭頭處所示)，重組蛋白C末端含有加入的六個組氨酸標簽，在變性條件下經(jīng)鎳離子Ni2+親和凝膠層析純化后經(jīng)SDS-PAGE驗證，在相對分子質(zhì)量55 000附近顯示出一條單一的蛋白條帶(圖3A)。

2.3 酶聯(lián)免疫吸附反應以及蛋白印跡實驗

ELISA驗證黃花蒿花粉烯醇化酶與過敏患者血清中IgE結合活性，在38份蒿屬過敏患者血清中有9份OD值大于cut off值(cut off值=陰性血清反應吸光度的平均值+3×陰性血清吸光度標準偏差)，其IgE結合率為24%(9/38)(圖3B)。利用免疫印跡對黃花蒿花粉烯醇化酶的IgE結合活性進一步驗證，發(fā)現(xiàn)9份ELISA陽性結合血清中，5份可以在免疫印跡中顯示出陽性結合條帶(圖3C)。

2.4 抑制性酶聯(lián)免疫吸附反應

在黃花蒿花粉粗提物和重組蛋白濃度為1 μg/mL時，花粉提取物與重組烯醇化酶可分別抑制96.00%和11.83%血清IgE與花粉提取物的結合(圖3D)。

3 討論

蒿屬花粉被認為是我國最重要的室外過敏原之一[3]。黃花蒿花粉作為三大蒿屬致敏花粉中的一員[4]，根據(jù)WHO/IUIS數(shù)據(jù)庫僅有4種過敏原分子已被鑒定，分別是A.annua1(防御素樣蛋白)[7]、A.annua2(病程相關蛋白)[7]、A.annua3(脂質(zhì)運載蛋白)[7]和A.annua7(半乳糖氧化酶)[7-8]。本研究通過對黃花蒿花粉轉(zhuǎn)錄組學測序和蛋白組學

圖 1 黃花蒿花粉烯醇化酶序列信息和進化樹

圖 2 黃花蒿花粉烯醇化酶與其他物種中同源過敏原多重序列比對

圖 3 黃花蒿花粉烯醇化酶表達、純化和活性(SDS-PAGE電泳及Western blot圖中箭頭所指為目的蛋白條帶)

綜上，從黃花蒿花粉中鑒定到一個新過敏原烯醇化酶，并首次在蒿屬花粉中證明烯醇化酶的IgE結合活性，進一步完善了蒿屬花粉中的具體過敏原組分信息，為組分診斷和治療提供基礎。