李晨紅， 宋長(zhǎng)豐， 林志康， 趙宇俠，2*

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué) 研究生院，上海200120； 2.上海健康醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，上海201138；3.華東理工大學(xué) 藥學(xué)院，上海200237）

結(jié)腸癌是胃腸外科常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤，在我國(guó)的發(fā)病率和死亡率均排在前五，且呈逐年上升趨勢(shì)［1-2］，包括結(jié)腸癌在內(nèi)的腫瘤是一種細(xì)胞凋亡過(guò)少而增殖過(guò)多的疾病，若能抑制腫瘤細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡，腫瘤細(xì)胞就有可能停止生長(zhǎng)［3］，從而控制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，因此有效抑制癌細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡是治療的關(guān)鍵，尋找合適的靶點(diǎn)來(lái)調(diào)控腫瘤成為抗腫瘤藥物關(guān)注的熱點(diǎn)問(wèn)題.

最近研究證實(shí)自噬與多種腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和生長(zhǎng)相關(guān)［4］.隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)自噬相關(guān)分子例如Beclin1與腫瘤的發(fā)展有著密不可分的關(guān)系［5］，一定程度的細(xì)胞自噬可以抑制腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移［6-7］，同時(shí)，自噬過(guò)程被證明能夠通過(guò)調(diào)控腫瘤細(xì)胞凋亡及細(xì)胞增殖過(guò)程等形式抑制腫瘤［8-10］.關(guān)于自噬蛋白作為抗腫瘤靶點(diǎn)的研究也已經(jīng)進(jìn)入臨床前研究［11-12］，探討自噬與腫瘤細(xì)胞增殖關(guān)系具有積極的臨床應(yīng)用意義.

中藥抗腫瘤作用的深入研究成為中藥現(xiàn)代化推進(jìn)的一項(xiàng)主要內(nèi)容，AMP作為被廣泛報(bào)道有抗腫瘤作用的中藥單體，對(duì)于其抗腫瘤機(jī)制的研究也有大量報(bào)道，包括誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移、抑制細(xì)胞增殖［13-16］等.而且，AMP也被報(bào)道可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬［13-15］，那么AMP是否能夠通過(guò)自噬作用實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞增殖過(guò)程的調(diào)控進(jìn)而起到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖抑制的作用值得研究，這將為自噬靶點(diǎn)的臨床應(yīng)用提供可行依據(jù).

目前關(guān)于AMP誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞自噬且自噬對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響報(bào)道較少，本研究通過(guò)慢病毒感染法構(gòu)建HCT116-RFP-GFP-LC3重組細(xì)胞株，體外實(shí)驗(yàn)將不同濃度AMP作用于HCT116及重組細(xì)胞株，初步探索AMP對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活力、自噬誘導(dǎo)作用及阻斷自噬晚期降解過(guò)程對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響，為深入研究其抗腫瘤機(jī)制提供一定依據(jù)，以期為結(jié)腸癌的治療提供新思路.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞來(lái)源于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)；自噬慢病毒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建，感染所用感染試劑（Polybrene，Enhanced Infection Solution）均由其提供.RPMI 1640培養(yǎng)基，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素購(gòu)自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清、胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；嘌呤霉素（puromycin），巴佛洛霉素（Baf A1），質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛均購(gòu)自北京建強(qiáng)偉業(yè)科技有限公司；蛇葡萄素（Ampelopsin，AMP）購(gòu)自曼斯特生物科技有限公司；預(yù)染蛋白Marker購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；CCK-8檢測(cè)試劑盒，Bradford蛋白定量試劑盒，SDS-PAGE凝膠制備試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人β-actin、LC3B、P62抗體，山羊抗兔抗體均為美國(guó)Proteintech Group產(chǎn)品；ECL超敏發(fā)光液購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純級(jí)別試劑.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 使用RPMI 1640培養(yǎng)基（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%FBS+質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%青鏈霉素）于37℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞密度進(jìn)行傳代.

1.2.2 慢病毒感染 將HCT116細(xì)胞按5×103個(gè)/mL接種于96孔板中，細(xì)胞密度約30%開(kāi)始感染，操作嚴(yán)格按照吉?jiǎng)P基因公司提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，以感染復(fù)數(shù)（MOI）為20設(shè)置實(shí)驗(yàn)分組，按照不同感染條件將實(shí)驗(yàn)分為4組：正常培養(yǎng)基組、含質(zhì)量濃度5μg/mL Polybrene的正常培養(yǎng)基組、Enhanced Infection Solution組和含質(zhì)量濃度5μg/mL Polybrene的Enhanced Infection Solution組.感染72 h后激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞熒光蛋白表達(dá)情況，選取MOI為20、含質(zhì)量濃度5μg/mL Polybrene的Enhanced Infection Solution條件擴(kuò)大培養(yǎng)，每2～3 d換含puromycin（終質(zhì)量濃度3μg/mL）的完全培養(yǎng)液一次，至不感染篩選對(duì)照組細(xì)胞被puromycin殺光，將感染并篩選后的細(xì)胞進(jìn)行傳代，并繼續(xù)施加puromycin進(jìn)行維持性篩選培養(yǎng)，連續(xù)篩選并傳3代后，凍存保種穩(wěn)定細(xì)胞株.

1.2.3 激光共聚焦觀(guān)察結(jié)腸癌細(xì)胞熒光表達(dá) 將HCT116-RFP-GFP-LC3重組細(xì)胞按5×105個(gè)/mL接種于6孔板爬片中，待細(xì)胞貼壁后棄培養(yǎng)基，用PBS洗2次，加入適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS洗3次，封片劑封片，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡在200×下觀(guān)察并記錄綠紅色熒光表達(dá)，確認(rèn)構(gòu)建重組細(xì)胞株成功.

將重組細(xì)胞按5×104個(gè)/mL接種于24孔板中，分別用AMP（質(zhì)量濃度0、50、75μg/mL）組及AMP（質(zhì)量濃度0、50、75μg/mL）+Baf A1組處理24 h，檢測(cè)AMP誘導(dǎo)HCT116-RFP-GFP-LC3重組細(xì)胞自噬情況.棄培養(yǎng)基，PBS洗2次，用1 mL DAPI溶液覆蓋細(xì)胞染色15 min，PBS洗3次，加入適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛溶液固定10 min，PBS洗2次，封片劑封片，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡（630×）隨機(jī)觀(guān)察3個(gè)視野并記錄，LC3自噬點(diǎn)的計(jì)算方法參照Popp等［17］研究方法，采用Image J軟件中“Threshold”和“Analyze Particles”功能進(jìn)行圖像分析.

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活力 將HCT116細(xì)胞按1×104個(gè)/mL接種于96孔板中，用AMP（質(zhì)量濃度0、25、50、75、150、300μg/mL）處理24 h，每孔加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%CCK-8溶液反應(yīng)1 h.酶標(biāo)儀檢測(cè)每孔在450 nm處的吸光度（OD值），計(jì)算

設(shè)置3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定AMP對(duì)HCT116細(xì)胞增殖影響.

1.2.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀(guān)察 將HCT116細(xì)胞按5×105個(gè)/mL接種于6孔板中，用AMP（質(zhì)量濃度0、25、50、75、150、300μg/mL）處理24 h，用PBS洗2次，質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定5 min，PBS洗2次，倒置顯微鏡（100×）下觀(guān)察并記錄細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化.

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá) 將HCT116細(xì)胞按5×105個(gè)/mL接種于6孔板中，AMP（質(zhì)量濃度0、50、75μg/mL）組及AMP（質(zhì)量濃度0、50、75μg/mL）+Baf A1組處理24 h，用預(yù)冷的PBS（含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%PMSF）洗滌3次后，加入RIPA裂解液，冰上裂解30 min，4℃12 000 g條件下離心取上清，采用Bradford法定量蛋白濃度.隨后取40μg蛋白進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%SDS-PAGE電泳，250 mA、0.5 h條件下PVDF膜轉(zhuǎn)膜1 h，質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗兔抗人的β-actin、LC3B、P62抗體（稀釋比例為1∶1 000）后4℃孵育過(guò)夜；次日TBST液洗膜后加入山羊抗兔的二抗（稀釋比例為1∶2 000），室溫孵育2 h，充分洗膜后ECL發(fā)光液避光孵育1 min顯影，用Image Lab軟件分析每組目的蛋白和相對(duì)應(yīng)的內(nèi)參蛋白條帶灰度值.

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有研究結(jié)果均采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料呈正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定表達(dá)RFP-GFP-LC3蛋白的細(xì)胞系鑒定結(jié)果 HCT116-RFP-GFP-LC3重組細(xì)胞由攜帶有LC3、RFP、GFP全基因的重組慢病毒感染，其中RFP、GFP和LC3作為一個(gè)重組基因組同步共表達(dá)，熒光檢測(cè)捕捉到的RFP或GFP熒光蛋白表達(dá)則標(biāo)志為L(zhǎng)C3表達(dá)，反之亦然；載體結(jié)構(gòu)中包含嘌呤霉素（puromycin）抗性，采用puromycin（3μg/mL）持續(xù)篩選細(xì)胞，得到感染效率100%的HCT116-RFP-GFP-LC3重組細(xì)胞株.激光共聚焦顯微鏡下觀(guān)察經(jīng)感染和嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)RFP-GFP-LC3蛋白的重組細(xì)胞，可以看到RFP或GFP熒光蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞，且細(xì)胞狀態(tài)較好（圖1，其中（a）為白光下重組細(xì)胞；（b）為紅色熒光LC3蛋白細(xì)胞；（c）為綠色熒光LC3蛋白細(xì)胞；（d）為（b）和（c）的熒光蛋白細(xì)胞merge圖），可以作為檢測(cè)細(xì)胞自噬標(biāo)志性蛋白LC3表達(dá)的細(xì)胞模型.

圖1 重組細(xì)胞的RFP-GFP-LC3熒光蛋白表達(dá)情況Fig.1 RFP-GFP-LC3 fluorescent protein in recombinant cells

2.2 AMP對(duì)HCT116細(xì)胞毒性作用 CCK-8法檢測(cè)結(jié)果（圖2（A）為AMP對(duì)HCT116細(xì)胞增殖影響）顯示，不同濃度的AMP（質(zhì)量濃度為0、25、50、75、150、300μg/mL）作用于HCT116細(xì)胞24 h后，在低質(zhì)量濃度（0～75μg/mL）范圍內(nèi)對(duì)HCT116細(xì)胞增殖抑制不顯著（P＞0.05）.形態(tài)學(xué)上觀(guān)察無(wú)明顯差異（圖2（B）為AMP對(duì)HCT116細(xì)胞形態(tài)影響，其中a、b、c、d、e、f分別指代AMP質(zhì)量濃度為0、25、50、75、150、300μg/mL處理后HCT116細(xì)胞形態(tài)圖），但高質(zhì)量濃度AMP（150、300μg/mL）抑制HCT116細(xì)胞增殖活力，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，表明AMP具有抗腫瘤作用.

圖2 AMP對(duì)HCT116細(xì)胞毒性的影響Fig.2 The effect of AMP on the cytotoxicity of HCT116 cells

2.3 AMP誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬的結(jié)果

2.3.1 激光共聚焦法觀(guān)察自噬體形成情況 在本實(shí)驗(yàn)中，選用AMP（質(zhì)量濃度0、50、75μg/mL）組及AMP（質(zhì)量濃度為0、50、75μg/mL）+Baf A1組作用HCT116-RFP-GFP-LC3細(xì)胞24 h后，激光共聚焦顯微鏡結(jié)果如圖3所示，其中圖3（a）為各組細(xì)胞自噬發(fā)生情況，圖3（b）為各組自噬熒光蛋白表達(dá)統(tǒng)計(jì)圖，Baf A1為自噬晚期抑制劑，正常對(duì)照組的綠色或紅色熒光在細(xì)胞中呈散在分布，自噬水平較低，自噬發(fā)生率5.15%，AMP（質(zhì)量濃度50、75 μg/mL）處理組的細(xì)胞出現(xiàn)綠色或紅色熒光點(diǎn)狀聚集的自噬體，自噬發(fā)生率分別為26.72%、19.47%，說(shuō)明AMP能夠誘導(dǎo)HCT116-RFP-GFP-LC3細(xì)胞發(fā)生自噬.

圖3 激光共聚焦檢測(cè)AMP-AMP＋Baf A1處理組的HCT116-RFP-GFP-LC3細(xì)胞自噬點(diǎn)Fig.3 The fluorescent spot of recombinant cells in the AMP-AMP＋Baf A1 groups were observed by laser confocal microscopy（X630）

一般把自噬過(guò)程分成3個(gè)階段.第一階段：自噬誘導(dǎo)信號(hào)刺激細(xì)胞，細(xì)胞質(zhì)中形成杯狀具雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬前體；第二階段：自噬前體在一些自噬蛋白的作用下不斷延伸，如伴隨此過(guò)程的LC3不斷被聚集到自噬前體上，對(duì)自噬前體的延伸起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而包裹一些胞漿成分形成自噬泡；第三階段：自噬泡通過(guò)胞內(nèi)運(yùn)輸系統(tǒng)到達(dá)溶酶體，溶酶體、自噬體兩者融合，并在溶酶體的水解酶作用下降解包裹物［18-20］.

實(shí)驗(yàn)中HCT116-RFP-GFP-LC3重組細(xì)胞中紅綠色熒光均能代表LC3蛋白的表達(dá)，區(qū)別在于自噬后期，自噬后期溶酶體與自噬體融合形成自噬溶酶體，環(huán)境pH值發(fā)生改變，而綠色熒光蛋白對(duì)酸性環(huán)境敏感.當(dāng)環(huán)境pH＜5時(shí)，綠色熒光發(fā)生淬滅，不能用來(lái)表征LC3表達(dá)，只能檢測(cè)到紅色熒光點(diǎn)狀聚集，因此綠色熒光只能用來(lái)檢測(cè)自噬前兩個(gè)階段.第三階段溶酶體降解過(guò)程，綠色熒光猝滅，紅色熒光可以持續(xù)表達(dá)表征LC3表達(dá)，紅綠熒光共定位復(fù)合為黃色熒光，綠色熒光的淬滅證明自噬晚期降解過(guò)程完成，紅綠色同時(shí)存在則說(shuō)明自噬處于前兩階段或晚期溶酶體降解過(guò)程阻斷，自噬過(guò)程沒(méi)有完成［4，18，20］.

自噬晚期抑制劑Baf A1通過(guò)抑制H+-ATP酶，從而阻止自噬體和溶酶體融合，LC3Ⅱ蛋白就會(huì)聚集在自噬體膜上不被降解，綠色熒光蛋白不發(fā)生淬滅，紅綠色熒光均能被檢測(cè)到，此時(shí)能觀(guān)察到更多細(xì)胞的LC3Ⅱ蛋白熒光自噬點(diǎn)，因此，自噬熒光亮點(diǎn)的細(xì)胞數(shù)增加表明自噬晚期降解過(guò)程被阻斷.換言之，加入Baf A1后，若觀(guān)察到自噬點(diǎn)增加證明了自噬晚期降解過(guò)程被成功阻斷，而不是自噬誘導(dǎo)增強(qiáng).本研究中，相對(duì)于control組，control+Baf A1組綠色熒光較暗，紅色熒光較多，此時(shí)綠光淬滅，紅光正常表達(dá)，表明自噬過(guò)程完整；同時(shí)，相對(duì)于AMP（質(zhì)量濃度0、50、75μg/mL）組，AMP（質(zhì)量濃度0、50、75μg/mL）+Baf A1組的自噬發(fā)生率分別為13.78%、34.69%、40.10%，紅色或綠色點(diǎn)狀聚集的細(xì)胞數(shù)量分別增多了168%、30%、106%，說(shuō)明Baf A1有效阻斷AMP誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞自噬晚期降解過(guò)程.

2.3.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)自噬相關(guān)蛋白表達(dá)結(jié)果通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法對(duì)AMP（質(zhì)量濃度0、50、75μg/mL）及AMP（質(zhì)量濃度0、50、75μg/mL）+Baf A1組進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果如圖4所示，其中圖4（a）為自噬相關(guān)蛋白印跡圖，圖4（b）為對(duì)應(yīng)自噬蛋白表達(dá)量統(tǒng)計(jì)圖.相對(duì)于空白對(duì)照組，AMP（質(zhì)量濃度50、75μg/mL）組細(xì)胞的LC3II蛋白表達(dá)水平上調(diào)，AMP（質(zhì)量濃度50μg/mL）組變化不顯著（P＞0.05），表明AMP誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞自噬，同時(shí)AMP（質(zhì)量濃度50μg/mL）組的P62蛋白被降解，表明自噬流晚期自噬溶酶體降解過(guò)程完成.

加入Baf A1后，自噬晚期降解過(guò)程阻斷，相對(duì)于AMP（質(zhì)量濃度0、50、75μg/mL）組，AMP+Baf A1組的LC3II蛋白表達(dá)上調(diào)，其中AMP（質(zhì)量濃度0、75μg/mL）+Baf A1組雖然LC3II蛋白表達(dá)數(shù)值上調(diào)，但變化不顯著（P＞0.05）；相對(duì)于AMP組，AMP+Baf A1組的P62蛋白表達(dá)數(shù)值上調(diào)，其中AMP（質(zhì)量濃度0、50μg/mL）+Baf A1組數(shù)值增大但不顯著，表明Baf A1加入后阻斷溶酶體降解過(guò)程，從而LC3II和P62蛋白未被降解表達(dá)上調(diào)，側(cè)面證明AMP誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生自噬流.

圖4 AMP-AMP＋Baf A1組誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3I/II和P62的表達(dá)量Fig.4 The expression of the autophagy-related proteins of LC3I/II and P62 in the AMP-AMP＋Baf A1 groups

2.4 阻斷自噬晚期降解過(guò)程對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響 根據(jù)CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取有顯著性差異的細(xì)胞增殖抑制濃度AMP（質(zhì)量濃度0、75、150、300μg/mL），加入Baf A1后，自噬晚期降解過(guò)程阻斷，AMP與AMP+Baf A1組間細(xì)胞增殖活力影響不顯著（P＞0.05）（圖5），結(jié)果表明AMP（質(zhì)量濃度0～300μg/mL）范圍內(nèi)，自噬晚期溶酶體降解過(guò)程阻斷對(duì)細(xì)胞增殖活力無(wú)影響.

圖5 Baf A1對(duì)AMP誘導(dǎo)的HCT116細(xì)胞增殖活力影響Fig.5 The effect of Baf A1 on AMP-induced proliferation in HCT116 cells

3 討論

細(xì)胞增殖是生物體的重要生命特征，細(xì)胞以分裂的方式進(jìn)行增殖，增殖是生物體生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖和遺傳的基礎(chǔ)［21］.腫瘤是一種細(xì)胞周期疾病，腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞生長(zhǎng)周期的失調(diào)直接相關(guān)，諸多研究表明通過(guò)藥物干預(yù)抑制腫瘤細(xì)胞的周期進(jìn)程可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖［22］.本研究中，AMP（0～300μg/mL）作用于結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞24 h后，高濃度下細(xì)胞增殖活力受到抑制，細(xì)胞形態(tài)變化，但低濃度范圍內(nèi)對(duì)HCT116細(xì)胞增殖影響不大，細(xì)胞形態(tài)影響較小，說(shuō)明AMP具有潛在抗腫瘤的臨床應(yīng)用價(jià)值，這與AMP能夠抑制肺癌、卵巢癌和胃癌的增殖，還能增強(qiáng)奧沙利鉑抗結(jié)腸癌的活性［16］報(bào)道相一致.

大量報(bào)道表明，哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian Rapamycin Target of Rapamycin，mTOR）是細(xì)胞增殖和自噬的中心調(diào)節(jié)器，因此自噬可能參與并影響細(xì)胞增殖過(guò)程［23-24］，成為調(diào)控細(xì)胞增殖的靶點(diǎn).研究表明，AMP能夠誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞［14］和人膠質(zhì)瘤細(xì)胞［15］自噬，也有報(bào)道稱(chēng)褪黑素通過(guò)自噬增強(qiáng)神經(jīng)干細(xì)胞增殖［25］，雙氫青蒿素通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞自噬抑制HepG 2.2.15細(xì)胞增殖［26］.本研究通過(guò)AMP對(duì)細(xì)胞自噬的誘導(dǎo)以及自噬晚期降解過(guò)程阻斷檢測(cè)細(xì)胞增殖，來(lái)探索AMP抑制HCT116細(xì)胞增殖的作用是否通過(guò)自噬作用調(diào)控和實(shí)現(xiàn).

細(xì)胞自噬是真核生物中進(jìn)化保守的對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行周轉(zhuǎn)的重要過(guò)程，利用溶酶體吞噬并降解自身受損蛋白或細(xì)胞器并得以循環(huán)利用［4，18］.本論文通過(guò)構(gòu)建RFP-GFP-LC3雙熒光自噬指示細(xì)胞系作為檢測(cè)細(xì)胞自噬標(biāo)志性蛋白LC3表達(dá)的細(xì)胞模型，選取AMP（質(zhì)量濃度0、50、75μg/mL）作用于重組株24 h后，激光共聚焦觀(guān)察正常對(duì)照組細(xì)胞中綠色或紅色熒光呈散在分布，自噬發(fā)生率為5.15%，AMP（質(zhì)量濃度50、75μg/mL）組的細(xì)胞出現(xiàn)綠色或紅色熒光點(diǎn)狀聚集的自噬體，自噬發(fā)生率分別為26.72%、19.47%，說(shuō)明AMP能夠誘導(dǎo)HCT116-RFP-GFP-LC3細(xì)胞發(fā)生自噬，這與中藥雷公藤甲素誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞自噬的研究相一致［27］.自噬體與溶酶體融合時(shí)，與膜表面偶聯(lián)的LC3Ⅱ熒光蛋白被降解，自噬熒光顆粒減弱或細(xì)胞自噬數(shù)目減少，而這個(gè)過(guò)程被Baf A1阻斷，因此LC3Ⅱ蛋白進(jìn)入溶酶體后，就會(huì)聚集在自噬體膜上不被降解，此時(shí)觀(guān)察到更多細(xì)胞的LC3Ⅱ蛋白熒光自噬顆粒點(diǎn)或更多數(shù)量的細(xì)胞自噬.實(shí)驗(yàn)中，相對(duì)于AMP（質(zhì)量濃度0、50、75μg/mL）組，AMP+Baf A1組的自噬發(fā)生率分別為13.78%、34.69%、40.10%，紅色或綠色點(diǎn)狀聚集的細(xì)胞數(shù)量分別增多了168%、30%、106%，說(shuō)明Baf A1能夠有效阻斷AMP誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞的自噬溶酶體降解過(guò)程，側(cè)面證明發(fā)生自噬流過(guò)程.

LC3是自噬活性標(biāo)志物，可直觀(guān)反應(yīng)自噬表達(dá)水平，目前最為廣泛的檢測(cè)方法是通過(guò)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)LC3蛋白表達(dá)水平，SQSTM1/P62是選擇性自噬最重要的貨車(chē)蛋白，也被稱(chēng)為選擇性自噬受體，它是連接LC3與待降解泛素化底物的橋梁，通常選擇P62結(jié)合LC3蛋白翻轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)自噬流［19-20］.蛋白質(zhì)印跡法對(duì)AMP（質(zhì)量濃度0、50、75μg/mL）組及AMP+Baf A1組進(jìn)行了驗(yàn)證，其LC3蛋白表達(dá)結(jié)果與自噬點(diǎn)檢測(cè)的LC3熒光表達(dá)觀(guān)察結(jié)果一致，對(duì)應(yīng)自噬誘導(dǎo)和自噬降解過(guò)程阻斷的P62的低表達(dá)與未降解蓄積的高表達(dá)相呼應(yīng)，這與AMP能夠促進(jìn)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（HNSSC）自噬的結(jié)果一致［13］，以上結(jié)果均能證實(shí)AMP誘導(dǎo)細(xì)胞自噬.

本論文在探索自噬對(duì)細(xì)胞增殖影響中，采用自噬抑制劑Baf A1人工干預(yù)，在AMP（質(zhì)量濃度0～300μg/mL）劑量范圍內(nèi)，加入Baf A1，自噬晚期溶酶體降解階段阻斷，圖5結(jié)果顯示阻斷自噬晚期降解過(guò)程對(duì)AMP組與AMP+Baf A1組間細(xì)胞增殖活力影響不顯著（P＞0.05），這說(shuō)明阻斷自噬降解過(guò)程對(duì)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖無(wú)影響.

目前討論AMP誘導(dǎo)的結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞自噬影響增殖的研究還很少，本研究證實(shí)AMP可抑制細(xì)胞增殖，發(fā)揮抗腫瘤作用，誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞發(fā)生自噬，Baf A1阻斷AMP（質(zhì)量濃度0～300μg/mL）誘導(dǎo)的自噬晚期降解過(guò)程，且圖5結(jié)果證明阻斷自噬晚期降解過(guò)程不影響細(xì)胞增殖（P＞0.05），但自噬參與機(jī)體多種途徑，是否影響凋亡或抑制細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）表達(dá)等調(diào)控抗腫瘤作用還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探索，以期為臨床治療結(jié)腸癌提供有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)與理論基礎(chǔ)，并揭示了細(xì)胞自噬是調(diào)控結(jié)腸癌治療的潛在靶點(diǎn).

致謝 上海健康醫(yī)學(xué)院種子基金（E1-0200-19-201132）和上海健康醫(yī)學(xué)院百人庫(kù)項(xiàng)目（B1-0200-19-311133）對(duì)本文給予了資助，謹(jǐn)致謝意.