彭松林 王尚 王振民 龍燦玲 唐菀澤 賀小琴 陳高揚

骨形態(tài)計量學是骨科研究中常用的研究骨代謝的手段，但骨組織結構致密且富含鈣鹽和無機鹽導致其脆性增加，普通切片很難切除完整骨組織[1]。目前常用的骨組織切片需進行脫鈣處理，而普通脫鈣液普遍需要3～4 周，甚至幾個月的脫鈣時間，耗時長且對組織形態(tài)有著不可逆轉的損傷[2-3]。由于骨組織的特殊性，導致計算其動態(tài)學參數(shù)時需要借助硬組織切片機，并且為了保證切出完整的條帶，借助塑料包埋技術在骨組織中的切片的方法應運而生[4-5]。目前常規(guī)的骨組織切片需要Leica SP1600 鋸式切片機和SP2600 切片機并配合鎢鋼刀片使用，同時還得借助特殊的膜用來黏附骨組織[6]，導致實驗成本巨大，限制了大部分科研團隊的研究進展[7]。本研究通過普通冰凍切片機和透明膠帶黏附骨組織的方法，觀察其熒光條帶變化和骨組織形態(tài)完整性，旨在探索簡化的不脫鈣硬組織切片技術。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

4%中性多聚甲醛固定液[生工生物工程（上海）股份有限公司]；鈣黃綠素（Sigma 公司，美國）；819 一次性刀片（萊卡，德國）；Cryofilmtype3C 黏附膜（SECTION-LAB，日本）碳酸氫鈉[生工生物工程（上海）股份有限公司]；文具透明膠帶（鎧圳，深圳）；OCT 冷凍切片包埋劑（櫻花，美國）；醫(yī)用生理鹽水；蔗糖（麥克林，上海）。其中，鈣黃綠素需要用含2%的碳酸氫鈉生理鹽水配制成5‰濃度溶解后避光保存現(xiàn)配現(xiàn)用，按照每只動物25 mg/kg 腹腔注射。

Leica CM1860 冰凍切片機（萊卡，德國），Leica Dmi8倒置熒光顯微鏡（萊卡，德國），ZH-GSZ 高速顱骨鉆（安徽正華生物儀器設備有限公司），SkyScan 1076 micro-CT 掃描儀（布魯克，比利時）。

1.2 動物處理

12 只兩月齡SD 雌性大鼠購自廣東省實驗動物中心，所有動物實驗均事先經過醫(yī)院倫理委員會審批并嚴格按照SPF級實驗要求操作。將12 只大鼠隨機分成假手術組（sham）和雙側卵巢切除組（OVX）后，進行卵巢切除實驗，并繼續(xù)飼養(yǎng)2 個月后于取材前第9 天和第2 天按照體重注射對應劑量鈣黃綠素[8]。取材時去除干凈股骨附著物，并于固定液中固定24 h。對股骨進行micro-CT 掃描，判斷骨質疏松模型是否成功。掃描完股骨后蔗糖梯度脫水，進行后續(xù)硬組織切片并計量骨形態(tài)動態(tài)參數(shù)。

1.3 實驗方法

進行microCT 掃描后，將股骨放入20%蔗糖溶液過夜。待骨組織沉底后再換成30%蔗糖溶液脫水1 d，然后用高速顱骨轉切開股骨頭兩端，分別將股骨干部分和股骨頭采用櫻花OCT 包埋，并提前將冰凍切片機降溫至-25℃。待樣本完全冰凍后將包埋好的樣本轉移至樣品槽中，并調整位置使股骨長軸與刀片平行，旋緊固定螺絲將樣本固定，防止在切片過程中松動。先采用20 m 修片，待到切片完整后調成6 m 并調整刀片位置，保證切片時刀片完好沒有豁口。將辦公用透明膠帶黏附于樣本上，用預冷鑷子輕輕刮下樣本表面使兩者接觸充分（見圖1A）同時將表面涂有合成橡膠的Cryofilmtype3C 黏附膜黏附于樣本上作為對比（見圖1B）。用刀片無劃痕一端勻速切片，同時用冰凍切片毛筆輕提透明膠帶/黏附膜，直至切片完全脫離，用鑷子將透明膠帶/黏附膜提起置于載玻片上并做好標記，肉眼可見兩組膜黏附下來的股骨頭組織形態(tài)完整，結構清晰（見圖2），同時熒光顯微鏡下觀察切片效果。并采用HE 染色觀察股骨頭里組織形態(tài)變化，同時觀察股骨頭中熒光形態(tài)。

圖1 透明膠帶/黏附膜在切片過程中與組織的具體應用：A.透明膠帶；B.黏附膜

圖2 切片大體輪廓顯示透明膠和黏附膜組均能很好地切出完整股骨頭形態(tài)

2 結果

按照此法對股骨干進行不脫鈣冰凍切片，切片厚度均為6 m，組織結構完整。鈣黃綠素標記的骨組織在熒光顯微鏡下能觀察到明顯的熒光條帶。microCT 結果顯示卵巢切除組大鼠骨量相對于假手術組明顯下降（見圖3），同時大鼠靜態(tài)骨形成參數(shù)顯示與假手術組相比，卵巢切除組骨量、骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量以及骨小梁間距顯著降低（見圖4）。硬組織切片熒光結果顯示，卵巢切除組大鼠和假手術組相比兩條熒光條帶間間隙明顯狹窄很多（見圖5），鈣黃綠素熒光標記結果與microCT 結果一致；大鼠動態(tài)骨形成參數(shù)顯示：骨礦沉積率、相對骨形成率顯著減少（見圖6）。同時股骨頭切片外觀大體完整（見圖2），熒光下可見深淺不一的代表鈣鹽沉積的綠色熒光同時HE染色結果顯示切片結構大體完整，骨小梁結構清晰（見圖7）。因受冰凍切片的條件所限，組織形態(tài)不如石蠟切片致密美觀。但冰凍切片結果不影響實驗觀察，可作為快速檢測計量骨組織的簡便方法。

圖3 股骨MicroCT分析：A.假手術組和卵巢切除組股骨遠端代表性MicroCT 圖像；B.骨小梁結構3D 重建模型

圖4 靜態(tài)骨形成參數(shù)：A.骨表型參數(shù)；B.骨組織形成率；C.骨小梁厚度；D.骨小梁數(shù)量

圖5 不同膜在sham 組和ovx 組新骨形成過程中綠色熒光條帶寬度

圖6 大鼠動態(tài)骨形成參數(shù)：A.骨礦化沉積率；B.相對骨形成率

圖7 硬組織切片股骨頭熒光圖和HE 染色結果（×100）

3 討論

人的骨骼通過成骨細胞和破骨細胞不斷重建，它們的有序供給對骨骼內環(huán)境的穩(wěn)定有著重要作用。骨重建包括骨吸收及其耦聯(lián)的骨形成兩方面，在正常情況下，成骨細胞介導的骨形成和破骨細胞介導的骨吸收維持動態(tài)平衡[9]。多個信號通路在骨重建過程中起到重要的作用，已有研究發(fā)現(xiàn)在骨折愈合早期，抑制EGFR 信號通路能抑制骨內、外膜來源SCs 的增殖，促進其成骨、成軟骨的分化[10]。骨組織形態(tài)計量學是近年來興起的關于骨動態(tài)學參數(shù)的計算，通過特殊的鈣標記物（鈣黃綠素）用來評價骨動態(tài)形成過程[11]。運用熒光標記和透射光圖像融合的特征從而得出骨重建的效果[12]。鈣黃綠素熒光標記動物已成為骨動態(tài)學參數(shù)的重要一環(huán)[13]，但因熒光染料的特殊性，常規(guī)的石蠟脫鈣切片會對熒光造成干擾。目前，國內外通用的方法是采用硬組織冰凍切片法來研究骨動態(tài)學[14-16]。因為冰凍切片的特殊性，很多黏附膜不能在低溫下黏附組織，因此Aaron 等[17]提出了一項新鮮骨組織切片制備技術，他們使用一種壓力敏感黏合劑黏附骨組織，并在表面涂覆高分子聚合物，以保證獲得完整組織切片。該技術極大地提高了骨組織計量學的發(fā)展，使得后續(xù)的科研工作者們能通過鈣黃綠素熒光標記得出骨重建的效果。然而硬組織切片對儀器要求較高（要求特殊的進口鎢鋼刀片）并且需要特殊的黏附薄膜，極大阻礙了科研進程。

經過摸索筆者發(fā)現(xiàn)利用普通的冰凍切片機（Leica CM1860）配合透明膠帶也能達到良好的熒光效果，對骨動態(tài)學參數(shù)的計算無任何影響。這極大地簡化了不脫鈣骨切片的方法并能得到良好的實驗結果。本研究使用高黏附性黏附膜和透明膠帶黏附組織作對比，發(fā)現(xiàn)透明膠帶也能成功切出完整條帶并且2 條熒光條帶非常清晰明顯。提示我們簡便的硬組織不脫鈣切片方法行之有效，并且成本低廉，操作方便，適合大部分科研單位使用。冰凍切片對刀片要求較高，為了保證切片的完整性，盡量換新的刀片，在切片過程中需要保證透明膠帶和組織貼合好，這樣才能得到完整的切片結果。并且盡量邊切片邊在熒光顯微鏡下觀察，從而得到完美的實驗結果。