趙銳 王譯晗 朱悅 陶琳 單軍

【摘要】 骨質(zhì)疏松癥是臨床常見的代謝性骨病。骨質(zhì)疏松的發(fā)生是由各種原因?qū)е碌某晒羌?xì)胞介導(dǎo)的骨生成減少或破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收增加。骨生成作用主要由成熟的成骨細(xì)胞完成，成骨細(xì)胞主要來源于間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs），在一系列信號通路及細(xì)胞因子等的調(diào)控下，MSCs可以分化為成骨細(xì)胞，進(jìn)而發(fā)揮骨生成作用。因此增強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化能力至關(guān)重要。目前已知多條信號通路參與到MSCs向成骨細(xì)胞分化的過程中，例如Wnt/β-catenin、BMP-Smads、Hedgehog、Notch、PI3K/AKT、MAPKs信號通路等，同時Runx2、Osterix或PPARγ等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子也在成骨分化過程中起到重要調(diào)控作用，這些信號通路與轉(zhuǎn)錄因子的激活或抑制影響著MSCs向成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞的分化傾向，但這些信號通路與轉(zhuǎn)錄因子之間是否存在相互聯(lián)系，以及它們是如何協(xié)同發(fā)揮調(diào)控成骨細(xì)胞分化的作用目前尚不明確。因此，本文針對成骨細(xì)胞分化相關(guān)重要信號通路以及轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展做一綜述，為臨床上大量的骨代謝異常相關(guān)疾病尋找發(fā)病機(jī)制以及治療靶點(diǎn)。

【關(guān)鍵詞】 成骨分化 信號通路 Runx2 Osterix

Advances in Signaling Pathways and Cytokines Regulating Osteoblastic Differentiation/ZHAO Rui， WANG Yihan， ZHU Yue， TAO Lin， SHAN Jun. //Medical Innovation of China， 2021， 18（05）： -176

[Abstract] Osteoporosis is a common clinical metabolic osteopathy. Osteoporosis occurs due to decreasing of bone formation by osteoblasts or increasing of bone resorption by osteoclasts. Bone formation is done by mature osteoblasts， which are mainly derived from mesenchymal stem cells （MSCs）. MSCs can differentiate into osteoblasts under the control of a series of signalling pathways and transcription factors. Therefore， it is important to enhance the differentiation of osteoblasts. Several signalling pathways are known to be involved in MSCs differentiation into osteoblasts， such as Wnt/β-catenin， BMP-Smads， Hedgehog， Notch， PI3K/AKT， MAPKs signalling pathways， meanwhile transcription factors such as Runx2， Osterix and PPARγ also play an important regulatory role in osteoblast differentiation. The activation or suppression of these signalling pathways and transcription factors affect tendency of MSCs differentiation into osteoblasts or fat cells， but it is not clear whether these signalling pathways and transcription factors are related to each other and how they work together to regulate osteoblast differentiation. Therefore， this paper makes a review of the important signalling pathways and transcription factors related to osteoblast differentiation， and seeks the pathogenesis and treatment targets for a large number of bone metabolic abnormality-related diseases in clinical.

[Key words] Osteoblast differentiation Signalling pathway Runx2 Osterix

First-authors address： Shenyang Orthopedic Hospital， Shenyang 110044， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.05.043

骨質(zhì)疏松癥是臨床常見的代謝性骨病，一般表現(xiàn)為骨量減少、骨脆性增加，進(jìn)而導(dǎo)致骨折風(fēng)險增高等。成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨生成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收之間的平衡維持著骨的穩(wěn)態(tài)[1]。骨質(zhì)疏松的發(fā)生由各種原因?qū)е逻@種平衡被打破，出現(xiàn)成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨生成降低或者破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收增加。骨生成作用主要由成熟的成骨細(xì)胞完成，成骨細(xì)胞主要由間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）分化而來，間充質(zhì)干細(xì)胞具有可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞等的能力，在一系列信號通路及細(xì)胞因子的調(diào)控下，MSCs可以分化為

成骨細(xì)胞，并在進(jìn)一步調(diào)控下成為成熟的成骨細(xì)胞，發(fā)揮骨生成作用。因此增強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化及成熟能力至關(guān)重要。所以，為了更好地揭示成骨細(xì)胞分化及骨形成過程的機(jī)制，迫切需要闡明這些信號通路及細(xì)胞因子是如何在成骨細(xì)胞分化過程中發(fā)揮調(diào)控作用，以期在骨質(zhì)疏松癥的治療中尋找新的藥物靶點(diǎn)?，F(xiàn)對參與調(diào)控成骨細(xì)胞分化的重要信號通路及細(xì)胞因子做一綜述。

1 參與成骨分化調(diào)控的細(xì)胞因子Runx2與Osterix

Runx2也稱核心結(jié)合因子1（Cbfa1），屬于Runt結(jié)構(gòu)域基因家族成員之一，因?yàn)樵诔晒羌?xì)胞的分化和成熟過程中起著至關(guān)重要的作用[2-3]，同時可以抑制MSCs向脂肪細(xì)胞的分化[4]，所以被認(rèn)定為成骨分化過程中最重要的轉(zhuǎn)錄因子之一。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，敲除Runx2基因的小鼠顯示出完全性骨生成障礙[5]。Runx2與成骨細(xì)胞中堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）、Ⅰ型膠原蛋白（COLL-1）、骨脂蛋白（BSP）及骨橋蛋白（OPN）等主要成骨分化相關(guān)基因的表達(dá)密切相關(guān)，因?yàn)橐陨匣虻膯幼有蛄兄卸即嬖诔晒翘禺愋皂樖皆∣SE），而Runx2能夠與之結(jié)合，從而激活這些相關(guān)基因的表達(dá)[6-7]。

Osterix（Osx）同樣是與成骨細(xì)胞分化過程密切相關(guān)的一種轉(zhuǎn)錄因子。有研究表明，敲除小鼠Osterix基因后，小鼠體內(nèi)骨皮質(zhì)和骨小梁發(fā)育障礙，證實(shí)了Osx與Runx2同樣是成骨細(xì)胞分化過程中所必需的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Runx2基因敲除小鼠體內(nèi)的Osx同樣不表達(dá)，提示Osx的表達(dá)受Runx2調(diào)控，Osx位于Runx2的下游[8]。

2 參與成骨分化調(diào)控的信號通路

骨形成受多種合成代謝信號通路的調(diào)節(jié)，包括PI3K/AKT、Wnt/β-catenin、BMP/TGF-β/Smad、MAPK、Notch、Hedgehog等信號通路[9-12]。這些信號通路通過調(diào)控Runx2的表達(dá)，進(jìn)而影響骨形成[10，13-14]。下面對重要的成骨分化相關(guān)信號通路構(gòu)成以及目前研究現(xiàn)狀做一概述。

2.1 Wnt/β-catenin信號通路 Wnt信號通路分為經(jīng)典和非經(jīng)典信號通路。其中，經(jīng)典Wnt信號通路（即Wnt/β-catenin通路）被認(rèn)為是在成骨細(xì)胞分化過程中起到重要調(diào)控作用的信號通路之一。經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路由Wnt配體及其受體以及細(xì)胞內(nèi)信號分子等組成，其成員主要包括膜外Wnt蛋白（配體）、卷曲蛋白受體（frizzled receptors）、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白（LRP5/6）、連環(huán)蛋白（β-catenin）、糖原合成激酶3β（GSK3β）、下游靶基因（如Runx2、Osterix等），以及其他與Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)的因子，如Dkks（Dickkopfs）、SCF β-TrCP等。

研究表明，當(dāng)細(xì)胞外缺乏Wnt蛋白時，GSK3β以復(fù)合體形式存在，復(fù)合體形式下的GSK3β可磷酸化β-catenin，磷酸化的β-catenin會被E3泛素連接酶SCFβ-TrCP識別結(jié)合后經(jīng)由泛素蛋白酶體系統(tǒng)降解，從而降低胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的濃度，進(jìn)而阻斷Wnt/β-catenin信號通路[15]。Wnt/β-catenin信號通路的激活需要Wnt蛋白激活細(xì)胞表面的Frizzled受體，并進(jìn)一步與LRP5/6受體結(jié)合，抑制GSK3β的活性，阻止β-catenin磷酸化，保持了β-catenin蛋白的穩(wěn)定，使未磷酸化的β-catenin轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而增加TCF/LEF的轉(zhuǎn)錄活性和成骨相關(guān)基因的表達(dá)。

Wnt/β-catenin信號通路具有促進(jìn)成骨分化和抑制成脂分化的作用[16]。這種作用已在多種細(xì)胞模型中被證實(shí)。例如，在3T3-L1細(xì)胞系中，Wnt/β-catenin信號通路和成脂特異性轉(zhuǎn)錄因子過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）相互調(diào)節(jié)以調(diào)控細(xì)胞的成脂分化趨勢[17]。加入Wnt3a可增強(qiáng)BM-MSC和C3H10T1/2細(xì)胞的成骨分化，同時抑制向脂肪細(xì)胞的分化[18-19]。加入Dkk1，可加強(qiáng)3T3-L1細(xì)胞成脂分化效果，敲除Dkk1導(dǎo)致MSCs的成脂分化效應(yīng)降低，而MC3T3-E1細(xì)胞和BM-MSCs成骨分化效應(yīng)增強(qiáng)[17，20]。

Wnt/β-catenin信號通路在調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化及骨形成方面最終作用于Runx2，Wnt/β-catenin信號通路通過調(diào)控Runx2的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮Runx2調(diào)節(jié)成骨分化相關(guān)基因ALP、OCN、COLL-1、BSP及OPN等表達(dá)的作用，促進(jìn)了成骨細(xì)胞的分化與成熟。Runx2基因啟動子序列中存在一個TCF作用元件，β-catenin通過與此作用元件進(jìn)行結(jié)合，繼而啟動Runx2及下游靶基因的表達(dá)，從而對成骨細(xì)胞分化及骨形成進(jìn)行調(diào)控[21]。

2.2 BMP/Smads信號通路 在參與成骨細(xì)胞分化過程的眾多信號通路中，BMP/Smads信號通路是激活成骨細(xì)胞分化及骨形成十分重要的一條通路。BMPs是TGF-β超家族中的重要成員。其中BMP2、4、7、9等，在成骨細(xì)胞分化過程中起到重要的調(diào)節(jié)作用，因此被認(rèn)為是目前骨代謝領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一[22]，同時多數(shù)學(xué)者認(rèn)為BMPs對成骨細(xì)胞分化的調(diào)控作用更具有特異性[23]。BMP/Smads/Runx2/Osterix信號通路被認(rèn)為是介導(dǎo)成骨細(xì)胞分化最重要以及最特異性的通路之一，研究表明，BMPs通過結(jié)合細(xì)胞膜上特異性受體進(jìn)而激活BMP/Smads通路，使下游的Smads蛋白（如Smad1、5）發(fā)生磷酸化，然后進(jìn)一步啟動成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子基因（如Runx2、Osterix等）轉(zhuǎn)錄，Runx2、Osterix繼續(xù)促進(jìn)成骨分化相關(guān)基因ALP、OCN、COLL-1、BSP及OPN等的表達(dá)，從而增強(qiáng)了MSCs向成骨細(xì)胞分化及骨形成的能力[10，23]。

泛素蛋白酶體系統(tǒng)在BMP/Smads信號通路中發(fā)揮了重要調(diào)控作用，特別是屬于E3泛素連接酶的Smurf蛋白，其中最具代表性的Smurf1，它能特異性識別和結(jié)合Runx2及Smad1，促使它們經(jīng)過泛素蛋白酶體途徑降解，進(jìn)而抑制了由BMP/Smads信號通路介導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化及骨形成[24-25]。human MSCs（hMSCs）細(xì)胞在經(jīng)過成骨誘導(dǎo)后泛素特異性蛋白酶USP34的表達(dá)增加，敲除USP34會抑制hMSCs細(xì)胞成骨分化。選擇性敲除小鼠MSCs細(xì)胞中的USP34導(dǎo)致細(xì)胞骨形成能力下降。此外，USP34的缺失會減弱BMP2介導(dǎo)的骨分化，進(jìn)而損害骨生成能力，而進(jìn)一步敲除Smurf1恢復(fù)了USP34缺失MSCs細(xì)胞在體外的成骨潛力。證明了，USP34通過減弱Smurf1介導(dǎo)的泛素化降解Smad1和Runx2的能力，穩(wěn)定了Smad1和Runx2，進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞分化及骨形成[26]。有研究表明，TGF-β/BMP-2信號通路是在成骨細(xì)胞分化晚期細(xì)胞成熟過程中，而非早期發(fā)揮主要作用[27]。

由此可見，BMP/Smads通路是參與調(diào)控成骨細(xì)胞分化的重要信號通路之一，與Wnt/β-catenin信號通路類似，BMP/Smads信號通路可通過作用于Runx2、Osterix從而起到增強(qiáng)MSCs向成骨細(xì)胞分化的效果，同時其自身也受到多種因素的調(diào)節(jié)，例如蛋白磷酸化、泛素化途徑等。

2.3 Hedgehog信號通路 Hedgehog信號通路是由Hedgehog相應(yīng)配體（Ihh、Shh、Dhh）、受體（Ptc、Smo）及細(xì)胞內(nèi)信號分子（Gli）等組成。缺失Hedgehog蛋白時，Ptc抑制Smo的活性;當(dāng)Hedgehog與Ptc1受體結(jié)合后，Smo受體被激活，激活的Smo進(jìn)一步激活Gli，促使它們?nèi)牒?，進(jìn)而啟動下游靶基因的表達(dá)。

近期研究發(fā)現(xiàn)，Hedgehog信號通路主要參與促進(jìn)MSCs向成骨細(xì)胞分化，并阻止其向脂肪細(xì)胞分化[28]，而且這種作用是通過調(diào)控Runx2的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的[2，29-31]。其中，Shh在成骨分化早期而Ihh主要在分化后期起主要作用[32-33]。研究表明，在MSCs細(xì)胞中，過表達(dá)Gli2能增強(qiáng)成骨細(xì)胞分化及礦化能力，敲除Runx2后這種促進(jìn)效果被消除[29];而在未敲除Runx2的MSCs中，通過降低Gli2的表達(dá)能顯著抑制Ihh介導(dǎo)的成骨分化，證明了Ihh及Gli2對成骨分化具有促進(jìn)作用，同時這種作用依賴于Runx2的表達(dá)增高。有研究證明Runx2對Hedgehog信號通路也存在調(diào)節(jié)作用，Runx2可以直接調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞、成骨前體細(xì)胞和成骨細(xì)胞中的Ihh表達(dá)，同時可以影響成骨前體細(xì)胞和成骨細(xì)胞中的Gli1和Ptc1表達(dá)[34]。同時也有實(shí)驗(yàn)證明，在細(xì)胞成骨分化過程中Hedgehog信號通路的調(diào)節(jié)作用不是持續(xù)存在的，在某些成骨分化階段其他調(diào)節(jié)成骨分化信號通路發(fā)揮主導(dǎo)作用，例如Wnt通路等[31]。

總之，Hedgehog信號通路與Wnt/β-catenin、BMP/Smads信號通路一樣具有通過調(diào)控Runx2的表達(dá)來調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化及骨形成的作用，因而同樣被視作調(diào)控成骨細(xì)胞分化及骨形成的關(guān)鍵信號通路之一，但這種調(diào)控作用是由Hedgehog信號通路單獨(dú)直接調(diào)控，還是必須借助Wnt/β-catenin或BMP/Smads信號通路而協(xié)同發(fā)揮作用尚無法確定，此外，對于Hedgehog信號通路于體內(nèi)外發(fā)揮促進(jìn)成骨分化作用是否存在時限性仍有爭議。

2.4 其他參與成骨分化的信號通路 大量實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Notch信號通路在調(diào)節(jié)MSCs向成骨細(xì)胞分化過程中起到重要作用，但得到的研究結(jié)果并不完全一致，多數(shù)研究認(rèn)為Notch信號通路發(fā)揮抑制成骨細(xì)胞分化以及降低骨量的作用[35-37]。另一方面，也有研究表明，Notch信號通路在體外具有促進(jìn)成骨細(xì)胞分化的作用，而且這種促進(jìn)效果伴隨著BMP2的表達(dá)增加[38]。PI3K/AKT信號通路在許多細(xì)胞活動中起著重要作用，如細(xì)胞生長、增殖等[39]。最近的研究證明，PI3K/AKT信號通路在成骨分化過程中可能起到重要調(diào)控作用[40-41]。有研究表明，MAPKs家族成員JNK、ERK和p38MAPK信號通路通過調(diào)控成骨分化而影響骨骼的形成[42-43]，同時p38MAPK和Prkd1信號通路參與MC3T3-E1細(xì)胞的在缺氧條件下的成骨分化[44]。

3 調(diào)控成骨分化的細(xì)胞因子、信號通路之間的聯(lián)系

目前認(rèn)為Runx2在成骨細(xì)胞分化的起始階段發(fā)揮主要作用，誘導(dǎo)MSCs分化為未成熟的成骨細(xì)胞。而Osx的進(jìn)一步作用導(dǎo)致成骨細(xì)胞的最終分化與成熟，Runx2作為Wnt/β-catenin信號通路下游的信號因子，而Osx是BMP-Smads信號通路下游的信號因子，有文獻(xiàn)認(rèn)為成骨分化早期Wnt/β-catenin信號通路起主要調(diào)控作用，而分化后期BMP-Smads信號通路發(fā)揮主導(dǎo)作用使成骨細(xì)胞進(jìn)一步分化成熟[45]。有研究表明，Akt可以通過增強(qiáng)Runx2的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而促進(jìn)BMPs介導(dǎo)的成骨分化[10]，說明Akt信號通路與BMP-Smads信號通路之間存在著相互影響。多項(xiàng)研究證明，Hedgehog信號通路與BMP2發(fā)揮協(xié)同作用促進(jìn)MSCs的成骨分化[2，46]。實(shí)驗(yàn)證明，Notch信號通路發(fā)揮抑制成骨細(xì)胞分化的效果是通過降低Wnt/β-catenin信號通路活性而達(dá)到的[35]，同時這種抑制效果伴隨著Runx2的表達(dá)降低，BMP信號通路可能也參與到對成骨分化抑制的調(diào)控[36]，但也有文獻(xiàn)表明這種抑制分化效果是通過降低Wnt/β-catenin信號通路活性而非BMP信號通路[37]。

綜上所述，MSCs向成骨細(xì)胞分化的調(diào)控機(jī)制十分復(fù)雜，Wnt/β-catenin、BMP-Smads、Hedgehog、Notch、PI3K/AKT、MAPKs等多條主要信號通路可以通過直接或間接作用于Runx2、Osterix或PPARγ等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，而調(diào)節(jié)MSCs向成骨細(xì)胞或脂肪細(xì)胞的分化傾向，并且這些信號通路不是孤立存在的，它們通過作用于共同的轉(zhuǎn)錄因子，或在調(diào)控分化過程中的不同時期發(fā)揮主導(dǎo)作用而彼此相互聯(lián)系，協(xié)同參與調(diào)控成骨細(xì)胞分化。同時通過對這些成骨分化信號通路以及轉(zhuǎn)錄因子的深入研究，發(fā)現(xiàn)它們被激活或抑制的機(jī)制也十分復(fù)雜，蛋白磷酸化、蛋白泛素化途徑、長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA）、微小RNA（microRNAs，miRNAs）、外泌體Exosomes（Exos）等都對成骨細(xì)胞分化信號通路以及轉(zhuǎn)錄因子有重要的調(diào)控作用。因此，還需要在現(xiàn)有研究基礎(chǔ)上，全面的、深入的針對成骨分化相關(guān)重要信號通路以及轉(zhuǎn)錄因子開展機(jī)制研究，為臨床上大量的骨代謝異常相關(guān)疾病尋找發(fā)病機(jī)制以及治療靶點(diǎn)。

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（收稿日期：2020-06-03） （本文編輯：張爽）