徐思詩，郎美東

(華東理工大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200237)

1 引 言

水凝膠作為一種具有高吸水和保水性的高分子交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)材料，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域有著十分廣泛的應(yīng)用。由于生物醫(yī)用材料在無毒性、生物相容性和生物可降解性方面有著十分嚴格的要求，研究者們常采用天然大分子如多糖、多肽、蛋白質(zhì)等作為水凝膠的主鏈結(jié)構(gòu)[1-3]。殼聚糖(CS)是一種由甲殼素脫乙?；玫降奶烊粔A性多糖，能夠溶于酸性溶液，具有優(yōu)異的無毒性、生物粘附性、抗菌性及生物可降解性[4-6]。

CS水凝膠可分為官能化改性后通過共價鍵交聯(lián)形成的化學(xué)水凝膠，以及通過靜電作用力形成的物理水凝膠[7-9]。Li等[10]用氯乙酸將殼聚糖羧甲基化制得N，O-羧甲基殼聚糖(NOCC)，同時利用糖單元保留的部分氨基與氧化透明質(zhì)酸(OHA)的醛基發(fā)生席夫堿反應(yīng)，形成一種可注射原位交聯(lián)NOCC-OHA 水凝膠。Birch等[11]在中性條件下利用果膠和CS制備了一種用于創(chuàng)口敷料的溫敏性聚電解質(zhì)復(fù)合水凝膠CS/Pec，其儲能模量G'會隨溫度的升高逐漸減小。然而其G'max也小于1000 Pa，凝膠強度有待加強。另外，多數(shù)改性CS水凝膠的凝膠時間長達幾小時甚至幾天，制備方法頗為復(fù)雜，這使其投入實際應(yīng)用變得較為困難。

點擊化學(xué)反應(yīng)的概念最早源自Sharpless，是指一些操作簡單得就像敲擊鼠標(biāo)一樣的化學(xué)反應(yīng)，這些反應(yīng)具有快速、高選擇性、廣泛適用性、對氧氣與水不敏感、操作便捷、產(chǎn)物易純化等眾多優(yōu)點，極大地簡化了化合物的合成步驟[12-13]。其中，巰基-烯點擊化學(xué)反應(yīng)是制備各種原位交聯(lián)水凝膠的理想方式[14-15]。Zhao等[16]將巰基化殼聚糖CS-NAc與雙鍵化葡聚糖Dex-Ma通過巰基-烯點擊化學(xué)反應(yīng)交聯(lián)形成CNDM 水凝膠，隨著投料比與質(zhì)量分數(shù)的改變，凝膠時間從12 min到12 h 不等。Ma 等[17]將CS 與PEG-DA 進行Michael 加成反應(yīng)，制備得到的雙鍵化殼聚糖PEGDA-CS具有光交聯(lián)特性和良好的水溶性。但基于巰基-烯點擊化學(xué)殼聚糖水凝膠相關(guān)的研究并不充分，無論是CS改性的實驗操作，還是水凝膠的交聯(lián)時間及可重復(fù)性等都有較大提高空間。

本研究參考了Dong等[18]的工作。采用甲磺酸(MSA)作為反應(yīng)的溶劑與催化劑，將CS質(zhì)子化，使得丙烯酰氯的取代發(fā)生在對位的羥基上，通過一步法就能得到接枝率很高的水溶性丙烯?；鶜ぞ厶?CS-AC)。之后首次將其應(yīng)用于巰基-烯點擊化學(xué)水凝膠的制備中，以帶有端巰基的二硫蘇糖醇(DTT)為交聯(lián)劑，在紫外光(UV)光照下快速交聯(lián)形成水凝膠。分析對比不同雙鍵/巰基投料比水凝膠的凝膠時間、流變行為、溶脹率等性質(zhì)。此外進行了細胞毒性實驗及抗菌實驗，探索水凝膠在載藥抗菌材料方面的潛在應(yīng)用。

2 實 驗

2.1 原料

試驗用原材料主要為殼聚糖(CS，DD=90%+)、甲磺酸(MSA)、丙烯酰氯、DL-二硫蘇糖醇(DTT)、2-羥基-2-甲基-1-[4-(2-羥基乙氧基)苯]-1-丙酮(I2959)、小鼠胚胎成纖維細胞(NIH-3T3)。

2.2 丙烯?；鶜ぞ厶?CS-AC)的制備

稱取2 g CS溶于15 m L MSA 中，在25～35℃下攪拌至完全溶解。使用恒溫低溫反應(yīng)鍋在0 ℃攪拌2 h后，緩慢滴入8 m L 丙烯酰氯，充分混合后繼續(xù)在0 ℃攪拌6～8 h，使CS與丙烯酰氯充分反應(yīng)。將反應(yīng)液用500 m L 丙酮與乙醚的混合溶液(體積比1∶1)沉降，離心分離。得到的沉淀物用40 m L 甲醇溶解，之后用丙酮與乙醚的混合溶液進行再沉降。沉淀物用乙醚清洗2～3次，離心分離，在室溫下抽真空干燥8～12 h 得到白色干燥粉末狀產(chǎn)物CS-AC，置于冰箱保存。

由于丙烯酰氯十分不穩(wěn)定，在高溫或遇水情況下極易分解，故投入摩爾量為CS糖單元10倍左右的量進行反應(yīng)，設(shè)計接枝度為100%，即每個糖單元上都接枝上一個雙鍵。具體反應(yīng)式如圖1所示。

圖1 CS-AC的合成反應(yīng)式Fig.1 Synthesis route of CS-AC

2.3 巰基-烯點擊化學(xué)水凝膠(CS-AC/DTT)的制備

首先稱取6組0.1 g CS-AC分別溶于2 m L H2O中。之后每組分別加入10 mg光引發(fā)劑I2969，以及不同質(zhì)量的DTT 配成不同雙鍵/巰基投料比的前驅(qū)體溶液，置于玻璃培養(yǎng)皿中，用365 nm 的紫外光照射進行巰基-烯點擊化學(xué)交聯(lián)，并記錄比較各組凝膠時間(溶液不流動，形成可以倒置的凝膠狀)。重復(fù)上述實驗5次，各組水凝膠凝膠時間取平均值。

UV 光照交聯(lián)結(jié)束后，將水凝膠取出，置于MWCO=14 k Da的透析袋中進行透析操作，以除去未反應(yīng)的I2959及DTT。透析24 h后，冷凍干燥。共成功制備得到對照組自交聯(lián)水凝膠CS-CC-CS以及三組不同雙鍵/巰基投料比的點擊化學(xué)水凝膠CS-AC/DTT-0.25、CS-AC/DTT-0.5和CS-AC/DTT-1(其中0.25、0.5和1分別為各組水凝膠前驅(qū)體溶液中巰基與雙鍵投料比理論值)。

圖2 為CS-AC/DTT 點擊化學(xué)水凝膠的合成示意圖。

圖2 CS-AC/DTT 水凝膠合成示意圖Fig.2 Synthesis diagram of CS-AC/DTT hydrogel

2.4 表征與測試

使用Nicolet 6700型紅外光譜儀對CS-AC 及CSAC/DTT進行FTIR測試，掃描波長為4000～500 cm-1，采用KBr壓片法制備測試樣品。

使用Bruker Avarice 400 型核磁共振波譜儀在400 MHz，室溫下進行CS-AC 的1H-NMR 測試，樣品溶于D2O 中。

使用MARS III旋轉(zhuǎn)流變儀(Thermo)對四組水凝膠進行流變行為測試，采用變頻掃描模式，頻率變化從0.1～10 Hz，固定量應(yīng)變1%，溫度分別為25 ℃和37 ℃。

分別稱取相同質(zhì)量的四組凍干水凝膠CS-CCCS、CS-AC/DTT-0.25、CS-AC/DTT-0.5 和CS-AC/DTT-1，浸泡在p H=7.4的PBS緩沖液中。在25 ℃水浴鍋中靜置過夜，待其達到溶脹平衡后取出稱重，利用式(1)計算四種水凝膠的溶脹率(Seq%)：

式中：Weq指的是溶脹平衡時凝膠的質(zhì)量，Wd指的是樣品凍干凝膠的質(zhì)量。于37 ℃水浴鍋中重復(fù)上述步驟對四組水凝膠樣品進行溶脹性實驗。

水凝膠的處理采用浸提液法。首先各稱取8 mg四組凍干水凝膠，在DMEM 培養(yǎng)液中充分浸潤后，各加入2 m L培養(yǎng)液，靜置24 h后得到浸提液。用各組浸提液于96孔板中培養(yǎng)小鼠胚胎成纖維細胞NIH-3T3(空白對照組與四組水凝膠浸提液，每組平行設(shè)5個孔，一共25個孔)24 h。對各孔細胞進行MTT 測試，使用酶標(biāo)儀測定490 nm 下細胞孔板中的OD 值，按照式(2)計算cell viability：

其中：ODsample指的是樣品組OD 值，ODcontrol為對照組OD 值。

采用物理負載的方式制備載有外用抗生素莫匹羅星(MUP)的水凝膠，用耐甲氧西林金葡萄球菌(MRSA)進行水凝膠的抗菌性測試。共設(shè)置了四組樣品：不載藥水凝膠CS-CC-CS、CS-AC/DTT 和載藥水凝膠CS-CC-CS-MUP、CS-AC/DTT-MUP，分別記為a、b、c、d，每組設(shè)置3個平行實驗。

每個瓊脂培養(yǎng)基上涂布的細菌濃度為106cfu/mL的MRSA 懸液100μL。將各樣品水凝膠用打孔器裁剪成相同大小(厚度3 mm，直徑10 mm)的圓片，放置于各培養(yǎng)基中心位置。置于37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后觀察比較四組水凝膠周圍的抑菌圈的大小并按式(3)進行計算：

其中：D2為抑菌圈外圍總直徑，D1為樣品原始直徑。

3 結(jié)果與討論

3.1 丙烯酰基殼聚糖(CS-AC)的結(jié)構(gòu)分析

圖3分別為CS、CS-AC 以及CS-AC/DTT 的紅外吸收光譜圖。對比CS和CS-AC 可以看出，接枝產(chǎn)物CS-AC在1731及806、778 cm-1處的位置增加了C=O伸縮振動峰和碳碳雙鍵中=CH 的面外彎曲振動峰，分別在1634和1412 cm-1處出現(xiàn)了明顯的C=C伸縮振動峰和面內(nèi)彎曲振動峰。這表明CS成功接枝了雙鍵。對比CS-AC和CS-AC/DTT 可以看出，交聯(lián)后的水凝膠樣品的C=C 的吸收峰均有明顯減少，由此可以說明在UV 照射下，CS-AC 與DTT 發(fā)生了巰基-烯點擊化學(xué)反應(yīng)，體系交聯(lián)形成水凝膠。

圖4 為CS-AC 的1H-NMR 譜圖?？梢钥闯鲈讦?6.5～6.0處有明顯的CH2=CH-中三個質(zhì)子的信號峰，進一步證明了CS-AC 中碳碳雙鍵的成功接枝。同時根據(jù)譜圖，通過式(4)計算出CS-AC的雙鍵接枝度：

圖3 CS-AC/DTT 的紅外吸收光譜圖Fig.3 FTIR spectra of CS-AC/DTT

其中：A 為信號峰的面積。計算得到CS-AC的雙鍵接枝度大約為100%，即CS的每個糖單元上都接枝了一個雙鍵。

圖4 CS-AC的核磁共振氫譜Fig.4 1 H-NMR spectra of CS-AC

3.2 水凝膠性能分析

3.2.1 凝膠時間分析 共設(shè)計了六組不同雙鍵/巰基投料比的水凝膠，表1為每組投料比和凝膠時間。分析交聯(lián)現(xiàn)象發(fā)現(xiàn)，當(dāng)巰基多于雙鍵時，無法交聯(lián)成凝膠。推測是由于體系中過量的巰基會發(fā)生副反應(yīng)，阻礙巰基-烯點擊化學(xué)反應(yīng)的進行，破壞交聯(lián)體系。其中，雙鍵/巰基比為1∶0.5時交聯(lián)速度最快，10 min以內(nèi)就能完全交聯(lián)成凝膠。雙鍵/巰基比為1∶1時稍慢，可能是由于體系中實際的活性雙鍵小于活性巰基導(dǎo)致過量巰基破壞交聯(lián)體系。總體而言隨著巰基投料量減少，交聯(lián)時間變長，基本能在20 min內(nèi)交聯(lián)完全。而對照組自交聯(lián)水凝膠CS-CC-CS需在40 min以上才能自交聯(lián)形成凝膠，由此可以看出CS-AC/DTT 水凝膠能大大縮短CS水凝膠的交聯(lián)時間。

表1 水凝膠配比及凝膠時間Table 1 Feed ratio and gelation time of hydrogels

3.2.2 水凝膠流變行為分析 圖5(a)～(h)展示了25℃和37℃下各組水凝膠樣品在變頻掃描模式下的流變行為。從圖可見，各組水凝膠的儲能模量G'均大于損耗模量G″，展現(xiàn)出很好的凝膠特性。各組水凝膠的G'max在不同溫度下都展現(xiàn)出類似的變化趨勢，具體如表2 所示。對于CS-CC-CS、CS-AC/DTT-0.25和CS-AC/DTT-0.5，凝膠時間越短，水凝膠的G'max變小，這是由于體系快速交聯(lián)成凝膠態(tài)時，仍有較多雙鍵沒有反應(yīng)，交聯(lián)點不夠多，導(dǎo)致水凝膠強度不是很大。而對于CS-AC/DTT-1水凝膠，如之前分析的由于體系內(nèi)交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)被破壞，故呈現(xiàn)出的G'max大大減小。另外，隨著測試溫度升高，各組水凝膠的強度都有所提高。推測這是由于隨著溫度上升，水凝膠內(nèi)的水分有所減少，同時殘留的雙鍵略有打開增加了交聯(lián)點，使得整個凝膠的形態(tài)由原來的剛而脆逐漸變得增加了一定的韌性，使得凝膠強度增大?？傮w而言，除去巰基過量的CS-AC/DTT-1水凝膠，其它各組水凝膠都展現(xiàn)出5～10 k Pa左右的比較優(yōu)異強度。

表2 水凝膠在25 ℃和37 ℃下的最大儲能模量Table 2 G'max of hydrogels at 25 ℃and 37 ℃

3.2.3 水凝膠的溶脹性能分析 圖6展示了四組凍干水凝膠分別在25 ℃和37 ℃下在p H=7.4 的PBS溶液中的溶脹率。從圖可見，CS-AC/DTT-0.5水凝膠的溶脹率最大，在37 ℃下高達1415%。這是由于該組水凝膠具有最短的交聯(lián)時間，體系中的交聯(lián)點少，交聯(lián)度低，因此體系可以吸收較多的水分。而CS-CC-CS自交聯(lián)水凝膠由于具有較高的交聯(lián)度，故溶脹率較低。另外，CS-AC/DTT-1 水凝膠由于體系中過量巰基破壞了部分交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)，使得溶脹率有所下降。隨著溫度從25 ℃升至37 ℃，四組水凝膠的溶脹率都有一定的上升。

3.2.4 水凝膠的細胞毒性分析 圖7為四組水凝膠樣品浸提培養(yǎng)NIH-3T3 細胞的細胞存活率結(jié)果。從圖可見，四組細胞存活率均大于90%，根據(jù)GB/T 14233.2-2005標(biāo)準可以判斷四組水凝膠材料的細胞毒性保持在1級，即材料對細胞增殖無明顯抑制作用。其中，CS-CC-CS 自身就具有較好的細胞相容性，而CS-AC/DTT 中引入的巰基以及巰基-烯交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)也未對材料的細胞相容性有影響。

圖5 水凝膠流變行為：CS-CC-CS(a)25 ℃，(e)37 ℃；CS-VE/DTT-0.25(b)25 ℃，(f)37 ℃；CS-VE/DTT-0.5(c)25 ℃，(g)37 ℃；CS-VE/DTT-1(d)25 ℃，(h)37 ℃Fig.5 Hydrogel rheological behavior：CS-CC-CS (a)25 ℃，(e)37 ℃；CS-VE/DTT-0.25(b)25 ℃，(f)37 ℃；CS-VE/DTT-0.5(c)25 ℃，(g)37 ℃；CS-VE/DTT-1(d)25 ℃，(h)37 ℃

圖6 水凝膠的溶脹率Fig.6 Swelling rate of hydrogels

圖7 水凝膠的細胞毒性Fig.7 Cytotoxicity of hydrogels

3.2.5 水凝膠的抗菌性能分析 圖8 為水凝膠的抗菌實驗結(jié)果，抑菌圈寬度見表3。對比圖8(a)和(b)可以看出，無論是CS-CC-CS還是CS-AC/DTT，未載藥時就具有一定的抗菌性，這是由CS本身的抗菌性決定的，接枝雙鍵以及與巰基交聯(lián)都沒有消除其抗菌性。對比不載藥組圖8(a)、(b)和載藥組(c)、(d)可以看出，載有莫匹羅星的兩組水凝膠表現(xiàn)出了十分明顯的抗菌性，說明通過物理負載的方式，水凝膠成功負載了莫匹羅星并且能夠通過擴散法產(chǎn)生抑菌效果。

圖8 水凝膠的抑菌效果(a)CS-CC-CS；(b)CS-AC/DTT；(c)CS-CC-CS-MUP；(d)CS-AC/DTT-MUP(黑色圈表示樣品水凝膠圓片原本大小，紅色圈表示培養(yǎng)12 h后抑菌圈外圍大小)Fig.8 Antibacterial effect of hydrogels (a)CS-CC-CS；(b)CS-AC/DTT；(c)CS-CC-CS-MUP；(d)CS-AC/DTT-MUP(black circle represents orginal size of hydrogel wafer sample，red circle represents size of inhibition zone after 12 h cultivation

表3 水凝膠的抑菌圈大小Table 3 Inhibition zone width of hydrogels

4 結(jié) 論

通過一步法可以將丙烯酰氯成功地接枝到CS上，合成帶有雙鍵側(cè)基的可溶性丙烯酰基殼聚糖CSAC。通過1H-NMR 結(jié)果計算得到雙鍵接枝率大約為100%，即每個糖單元上都帶有一個碳碳雙鍵。該改性操作為CS糖單元引入了新的反應(yīng)位點，可供其進一步與其它官能化化合物進行交聯(lián)反應(yīng)。

CS-AC與DTT 在紫外光照射和I2959引發(fā)下進行巰基-烯點擊化學(xué)反應(yīng)，交聯(lián)得到CS-AC/DTT 水凝膠。其最短在10 min之內(nèi)就能凝膠完全，相較于自交聯(lián)水凝膠CS-CC-CS大大縮短了凝膠時間。水凝膠具有5～10 k Pa左右的儲能模量以及高達1415%的優(yōu)異的溶脹率。各組水凝膠對小鼠胚胎成纖維細胞NIH-3T3無明顯細胞毒性。

通過物理法負載了莫匹羅星的水凝膠對于MRSA具有很好的擴散抑菌效果。表明該CS-AC/DTT 水凝膠在制備載藥及抗菌材料方面具有潛在應(yīng)用。