沈淑嫻，何旭昭，董靈慶，程 逵，翁文劍

(浙江大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，浙江杭州 310027)

1 前 言

生物電廣泛存在于人體之中，內(nèi)源性電場(chǎng)在調(diào)節(jié)諸如胚胎發(fā)生、傷口愈合、組織修復(fù)與重塑等許多生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[1-4]。受骨骼自然壓電特性的啟發(fā)[5]，通過(guò)采用外源的電刺激并提供適當(dāng)?shù)纳憝h(huán)境來(lái)模仿內(nèi)源性電場(chǎng)已被用于調(diào)節(jié)成骨類(lèi)細(xì)胞和干細(xì)胞的成骨分化并促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)。

McCullen等[6]使用叉指型金電極提供交變電場(chǎng)刺激，結(jié)果表明1 V/cm 強(qiáng)度的電場(chǎng)明顯增強(qiáng)了h ASCs的成骨分化能力。Park等[7]用平行電極在限定的納米管TiO2基底表面附近產(chǎn)生電場(chǎng)，并證明強(qiáng)度為200或400 m V/cm 的恒定電場(chǎng)誘導(dǎo)了MSCs的成骨分化。Thrivikraman 等[8]使用細(xì)胞外基質(zhì)涂覆的導(dǎo)電聚苯胺模擬骨組織微環(huán)境，將細(xì)胞間歇性暴露在耦合產(chǎn)生的電場(chǎng)中，結(jié)果顯示h MSCs的成骨分化潛能顯著增強(qiáng)。Hu等[9]證明了導(dǎo)電的聚吡咯薄膜可支持350 m V/cm 的電場(chǎng)刺激，并且恒定電場(chǎng)促進(jìn)了r BMSCs細(xì)胞外基質(zhì)中的鈣沉積。

在這些研究中，電場(chǎng)的產(chǎn)生主要通過(guò)平行電極、平面電極、電容耦合或電感耦合來(lái)施加電信號(hào)[10]。與其他傳統(tǒng)的裝置相比，具有叉指型陳列的平面微電極在電極上方、下方和垂直于電極方向均能產(chǎn)生電場(chǎng)；極小的電極間隔類(lèi)似生理特征尺寸，僅需要較小的電壓即可產(chǎn)生生理所需的電場(chǎng)強(qiáng)度，不易產(chǎn)生電化學(xué)效應(yīng)；電場(chǎng)被定位在電極緊鄰處且近似于平行，細(xì)胞所處的電場(chǎng)刺激是恒定的[6，11-13]。但是，平面電極在產(chǎn)生電場(chǎng)的同時(shí)必然伴隨著微電流，而且由于叉指型的設(shè)計(jì)電極的表面成分必然不均勻，而表面覆膜的方式恰恰可以消除由此帶來(lái)的影響。

聚偏氟乙烯三氟乙烯P(VDF-Tr FE)作為一種重要的鐵電聚合物，具有優(yōu)良的生物相容性、耐腐蝕性等特性，P(VDF-Tr FE)基材料被廣泛應(yīng)用于骨組織修復(fù)[14-15]。Tang等[16]在Ti表面制備了一層P(VDFTr FE)薄膜，證明極化后的P(VDF-Tr FE)顯著提高了MC3T3-E1細(xì)胞的成骨分化能力。Lopes等[17]發(fā)現(xiàn)BTO/P(VDF-Tr FE)復(fù)合膜能夠顯著促進(jìn)骨缺陷中的新骨形成，同時(shí)骨組織與P(VDF-Tr FE)之間形成了一層連接組織，這表明P(VDF-Tr FE)與骨組織之間的界面結(jié)合十分緊密。另外，P(VDF-Tr FE)具有獨(dú)特的電響應(yīng)活性，包括鐵電性、壓電性、熱釋電性，是一種非常具有研發(fā)潛力的材料[18-21]。

因此，本研究采用平面微電極覆膜的方式，通過(guò)旋涂法在ITO 電極上涂覆P(VDF-Tr FE)薄膜。通過(guò)改變不同的工藝參數(shù)來(lái)調(diào)控薄膜的致密度、厚度和絕緣性能，進(jìn)而篩選出在電刺激時(shí)只顯示純電場(chǎng)作用的樣品。然后對(duì)純電場(chǎng)刺激影響MSCs生長(zhǎng)行為進(jìn)行簡(jiǎn)單的生物學(xué)評(píng)價(jià)。

2 實(shí) 驗(yàn)

2.1 原材料

P(VDF-Tr FE)(70/30)粉末，純度≥99.0%；ITO基板，尺寸為10 mm×10 mm×1mm，電極寬度和間隔為500μm；N，N-二甲基-甲酰胺(DMF)，純度≥99.5%；丙酮，純度≥99.7%；無(wú)水乙醇，純度≥99.7%。

2.2 儀器設(shè)備

分析天平，TG-382-A；磁力攪拌器，C-MAG HS4；鼓風(fēng)干燥箱，DHG-9070AS；勻膠機(jī)，KW-4A；馬弗爐，KSL-1200X-J；超凈臺(tái)，HCW-HS；三氣培養(yǎng)箱，HF100；離心機(jī)，TDZ5-WS；滅菌鍋，GI54T；高速離心機(jī)，Neofuge 13R。

2.3 ITO 上涂覆P(VDF-Tr FE)薄膜的制備

按照?qǐng)D1所示的流程，先稱(chēng)取一定量的P(VDFTr FE)粉末溶于DMF 中，磁力攪拌2 h 直至完全溶解。再用移液槍量取100μL 溶液滴于清洗干凈的ITO 基板中心，以4000 rpm 的轉(zhuǎn)速高速旋轉(zhuǎn)60 s使其分散均勻。然后將基板置于烘箱干燥2 h 直至DMF完全蒸發(fā)，最后經(jīng)過(guò)退火處理即可。

圖1 旋涂法制備P(VDF-Tr FE)薄膜的流程圖Fig.1 Illustration for preparation of P(VDF-Tr FE)films on ITO by spin-coating

2.4 薄膜的材料學(xué)表征

將潔凈的樣品進(jìn)行噴金預(yù)處理。通過(guò)場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM，SU-70)觀(guān)察薄膜的表面形貌。測(cè)試電壓為3 k V。

將ITO 基板上的薄膜刮凈一部分，自制一個(gè)臺(tái)階，均勻選取若干個(gè)點(diǎn)，通過(guò)表面輪廓儀(DEKTAKXT)對(duì)涂膜進(jìn)行接觸式測(cè)量，測(cè)得臺(tái)階的高度差即為薄膜的厚度。

采用由計(jì)算機(jī)控制的電化學(xué)工作站(CHI660D)，將ITO 基板的一側(cè)用作工作電極，另一側(cè)用作參比電極，在電解液中進(jìn)行電化學(xué)分析。在不同電壓的雙相脈沖信號(hào)下收集充放電曲線(xiàn)。在施加某一電壓時(shí)，曲線(xiàn)的某一充電周期內(nèi)電流對(duì)時(shí)間的積分即為在該脈沖信號(hào)下通過(guò)薄膜的電荷量。

通過(guò)掃描開(kāi)爾文探針顯微鏡(NTEGRA Spectra C)測(cè)量正負(fù)電極在薄膜表面處的電壓差。使用的探針是市售的涂Pt的硅懸臂(HA_FM/Pt)，頻率為49 k Hz，振幅為0.5 V(峰值峰)。

2.5 電刺激流程

將覆膜的ITO 電極置于由聚四氟乙烯(PTFE)制成的細(xì)胞培養(yǎng)裝置中，如圖2所示。將帶有Pt絲的兩個(gè)壓塊用塑料螺釘分別固定在電極導(dǎo)帶兩端，使Pt線(xiàn)與導(dǎo)電條帶緊密接觸，然后將兩端的鉑絲分別引出連接到信號(hào)發(fā)生器(DG1022)，對(duì)被測(cè)樣品施加不同電壓的電刺激。

圖2 電刺激細(xì)胞培養(yǎng)裝置示意圖Fig.2 Device for electrical stimulation and culturing of cells

2.6 細(xì)胞行為評(píng)價(jià)

2.6.1 細(xì)胞培養(yǎng) 本研究使用的是大鼠股骨和脛骨中的第3～4 代間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)。將MSCs培養(yǎng)在溫度為37 ℃、CO2含量為5%的濕潤(rùn)氣氛中，使用的培養(yǎng)基含有α-改性的MEM 必需培養(yǎng)基和10%胎牛血清，并添加1%丙酮酸鈉、1%MEM 非必需氨基酸和含有1×104單位/m L 青霉素和10 mg/m L鏈霉素的1%抗生素溶液。在細(xì)胞培養(yǎng)期間，每?jī)商旄鼡Q培養(yǎng)基。在進(jìn)行電刺激前，細(xì)胞均需預(yù)先培養(yǎng)1天，使細(xì)胞在電極上充分粘附和鋪展[22]。

2.6.2 細(xì)胞粘附與增殖 將MSCs以2×104個(gè)/cm2的密度接種在PTFE 培養(yǎng)裝置中的樣品上。分別在培養(yǎng)1天和3 天后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)測(cè)定樣品上細(xì)胞的粘附和增殖。先將樣品轉(zhuǎn)移到新的24孔板中，然后將500μL 新鮮的培養(yǎng)基和50μL CCK-8溶液添加到每個(gè)孔中。在37℃下孵育3 h后，將溶液分配到新的96孔板中，并用酶標(biāo)儀(MK3)測(cè)量在450 nm處的吸光度。

2.6.3 細(xì)胞ALP活性 堿性磷酸酶(ALP)活性代表了細(xì)胞的初始成骨分化程度。將MSCs 以2×104個(gè)/cm2的密度接種在PTFE 培養(yǎng)裝置中的樣品上。培養(yǎng)7天后，先將樣品轉(zhuǎn)移至新的24孔板中，并用PBS洗滌3次。再用Cel Lytic緩沖液將樣品上的細(xì)胞裂解，并把獲得的細(xì)胞裂解液在4 ℃下高速離心15 min。然后收集上清液，用ALP試劑盒進(jìn)行反應(yīng)測(cè)試。最后用酶標(biāo)儀測(cè)量在405 nm 處的吸光度。單位細(xì)胞的ALP活性表示為總ALP 活性除以在BCA 蛋白質(zhì)分析中測(cè)試的總蛋白質(zhì)含量。

2.6.4 細(xì)胞的形態(tài) 將MSCs以2×103個(gè)/cm2的密度接種在PTFE培養(yǎng)裝置中的樣品上。分別在培養(yǎng)1天和3天后，將樣品轉(zhuǎn)移至新的24孔板中，并用PBS洗滌3次。然后加入用PBS稀釋的4μM Calcein-AM。在37℃下孵育30 min后，用倒置熒光顯微鏡(NIB900)在綠色熒光下觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)，并攝像。

3 結(jié)果與討論

3.1 ITO 電極上P(VDF-Tr FE)薄膜的制備

采用旋涂法在ITO 平面電極上制備P(VDFTr FE)薄膜，通過(guò)調(diào)節(jié)P(VDF-Tr FE)溶液濃度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))和旋涂層數(shù)來(lái)探究不同制備條件下薄膜的表面形貌、厚度和電化學(xué)特性，通過(guò)優(yōu)選得到致密絕緣且厚度足夠小的P(VDF-Tr FE)薄膜。

3.1.1 薄膜的表面形貌 圖3是在不同溶液濃度和旋涂層數(shù)條件下制備的P(VDF-Tr FE)薄膜的SEM照片。當(dāng)溶液濃度為3%，旋涂1 層時(shí)，P(VDFTr FE)在基板上仍大范圍空缺并未成膜；隨著旋涂層數(shù)的增加，空缺逐漸被填補(bǔ)；但即使增加至5層，表面仍存在著大量的不規(guī)則孔洞而難以成膜。當(dāng)溶液濃度為5%，旋涂1層時(shí)，孔洞與P(VDF-Tr FE)面積相當(dāng)；隨著旋涂層數(shù)的增加，孔洞面積逐漸減小，形狀趨于圓形，P(VDF-Tr FE)逐漸成膜；旋涂5層時(shí)薄膜基本致密。同樣的，當(dāng)溶液濃度為7%、旋涂至3層時(shí)微孔消失，薄膜基本致密；溶液濃度為9%的樣品旋涂1層即無(wú)明顯孔洞而顯示致密。P(VDF-Tr FE)薄膜中的晶須也均隨著孔洞的減少而逐漸增多加長(zhǎng)。

由此可見(jiàn)，旋涂法制備P(VDF-Tr FE)薄膜的合適成膜濃度在3%以上。當(dāng)溶液濃度相同時(shí)，薄膜的孔洞數(shù)量和面積會(huì)隨著旋涂層數(shù)的增加而減少；當(dāng)旋涂層數(shù)相同時(shí)，溶液濃度增加會(huì)明顯改善薄膜的孔隙率，因此溶液濃度的提高和旋涂層數(shù)的疊加均是消除微孔、提高薄膜致密度的有效手段。

3.1.2 薄膜的厚度 圖4是不同溶液濃度和旋涂層數(shù)條件下制備的P(VDF-Tr FE)薄膜的厚度圖。薄膜的厚度隨溶液濃度和旋涂層數(shù)的增加而增加，但它們對(duì)薄膜厚度的貢獻(xiàn)明顯不同。溶液濃度對(duì)于薄膜厚度的大小起主要決定作用，而旋涂層數(shù)則僅使薄膜厚度產(chǎn)生小范圍波動(dòng)，旋涂層數(shù)對(duì)厚度的影響程度也隨著濃度的增加而加大。這是由于當(dāng)濃度較小時(shí)，薄膜孔洞較多，旋涂時(shí)溶液會(huì)優(yōu)先去填補(bǔ)空缺處，所以層數(shù)的增加對(duì)厚度的影響較??；當(dāng)濃度較大時(shí)，薄膜趨于致密，旋涂層數(shù)的增加自然就促進(jìn)了厚度的增長(zhǎng)。

圖3 不同濃度和旋涂層數(shù)制備的P(VDF-Tr FE)薄膜的表面形貌照片F(xiàn)ig.3 Surface morphologies of P(VDF-Tr FE)films prepared with different concentrations and spin coating layers

圖4 不同濃度和旋涂層數(shù)條件下制備的P(VDF-Tr FE)薄膜的厚度Fig.4 Thickness of P(VDF-Tr FE)films prepared with different concentrations and spin coating layers

值得注意的是，由旋涂法制得的P(VDF-Tr FE)薄膜的厚度大多都不超過(guò)1μm。因此，旋涂法可以獲得納米級(jí)薄膜，通過(guò)對(duì)溶液濃度和旋涂層數(shù)的控制可實(shí)現(xiàn)對(duì)薄膜厚度“粗+細(xì)”的雙重調(diào)控。

3.1.3 覆有薄膜的ITO 電極的電化學(xué)響應(yīng)分析 如圖5所示，對(duì)覆有不同工藝條件下制備的P(VDFTr FE)薄膜的ITO 電極，施加不同電壓的雙脈沖信號(hào)，積分得到相應(yīng)電壓下周期內(nèi)通過(guò)的電荷量。可以看到，與未覆膜的ITO 電極相比，所有覆膜的ITO 電極上通過(guò)的電荷量均明顯減少。當(dāng)溶液濃度為3%時(shí)，旋涂層數(shù)即使增加至5層也明顯有電荷通過(guò)；當(dāng)濃度為5%時(shí)，旋涂層數(shù)增加至5層時(shí)通過(guò)的電荷量驟然減少，預(yù)計(jì)6層可達(dá)完全絕緣；當(dāng)濃度為7%和9%時(shí)，旋涂層數(shù)增加至3層時(shí)已基本無(wú)電荷通過(guò)，達(dá)到絕緣。

從圖5可見(jiàn)，平面微電極上的P(VDF-Tr FE)薄膜確實(shí)起到了一定的電流阻擋作用，其效果可由制備工藝調(diào)節(jié)，提高溶液濃度和增加旋涂層數(shù)都能有效增強(qiáng)薄膜的絕緣能力。然而，P(VDF-Tr FE)薄膜的絕緣能力并不與薄膜的厚度直接相關(guān)，其中可實(shí)現(xiàn)完全絕緣的薄膜的最小厚度為470 nm。

綜合考察薄膜的致密度、厚度和絕緣性三者的關(guān)聯(lián)性，由溶液濃度7%、旋涂3 層制備的P(VDFTr FE)薄膜即能均勻致密地覆蓋整個(gè)ITO 基板，并可消除因電極圖案化造成的對(duì)材料不均勻性的影響；該薄膜絕緣性好，可以完全阻擋電刺激時(shí)產(chǎn)生的微電流和可能存在的電化學(xué)產(chǎn)物；而且它在致密絕緣薄膜中厚度最小，僅為470 nm，不會(huì)過(guò)多阻隔電刺激時(shí)兩極間產(chǎn)生的電場(chǎng)。因此選取470 nm 薄膜作為本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)的樣品。

3.2 電極電場(chǎng)作用時(shí)薄膜表面的電場(chǎng)測(cè)試

給P(VDF-Tr FE)薄膜下面的ITO 電極施加一定的電信號(hào)，以在薄膜表面處產(chǎn)生電場(chǎng)。通過(guò)SKPM 分別測(cè)量正極、玻璃、負(fù)極的平均表面電勢(shì)，計(jì)算出不同脈沖電壓下相鄰電極之間的平均電勢(shì)差，結(jié)果見(jiàn)圖6所示。250、500、1000和1500 m V 的刺激電壓下薄膜表面處相鄰電極間的電勢(shì)差分別為87、205、453 和677 m V，證明電刺激時(shí)ITO電極上的P(VDF-Tr FE)薄膜表面確實(shí)有電場(chǎng)存在，且電場(chǎng)強(qiáng)度受刺激電壓調(diào)控。

3.3 覆有薄膜的電極對(duì)MSCs生長(zhǎng)行為的電刺激影響

將樣品置于自制的電刺激裝置中，滅菌后在上面接種MSCs，粘附24 h后，每天施加持續(xù)時(shí)間為1 h的雙脈沖電信號(hào)，探究不同強(qiáng)度的電場(chǎng)刺激對(duì)MSCs的增殖和成骨分化行為的影響。

圖5 不同濃度和旋涂層數(shù)條件下制備的P(VDF-Tr FE)薄膜的電荷-電壓曲線(xiàn)Fig.5 Charge-Voltage curves of P(VDF-TrFE)films prepared with different concentrations and spin coating layers

圖6 電刺激下ITO 正負(fù)電極在薄膜表面處的電壓差Fig.6 Voltage difference of ITO positive and negative electrodes at the film surface under electrical stimulation

如圖7A 所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間從1天增加至3天，細(xì)胞數(shù)量明顯增多，說(shuō)明P(VDF-Tr FE)薄膜具有良好的生物相容性。在細(xì)胞培養(yǎng)3天時(shí)，經(jīng)電場(chǎng)刺激的細(xì)胞均比未刺激的增殖得多，且隨著刺激電壓的增加，MSCs的增殖數(shù)量呈先升高后下降的趨勢(shì)，在電壓為250 m V 時(shí)的細(xì)胞增殖效果最好。圖7C 是相應(yīng)時(shí)間的細(xì)胞染色圖，可以直觀(guān)地看到，與未刺激組相比，250 m V刺激的MSCs顯示出更大的鋪展面積和更多的細(xì)胞數(shù)量。隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)至7天，如圖7B 所示，MSCs的ALP活性也呈現(xiàn)相同的類(lèi)拋物線(xiàn)趨勢(shì)，在電壓為250 m V 時(shí)達(dá)到了最高值。

圖7 電場(chǎng)刺激對(duì)MSCs的生長(zhǎng)行為的影響 (A)細(xì)胞增殖；(B)細(xì)胞ALP活性；(C)活細(xì)胞染色圖。Fig.7 Effects of electric field stimulation on the growth behaviors of MSCs(A)Proliferation；(B)ALP activity；(C)Cell staining images

綜上所述，電場(chǎng)刺激有利于MSCs的增殖和成骨分化。其中，250 m V 的刺激電壓是促進(jìn)MSCs增殖和成骨分化能力的最佳刺激條件。

4 結(jié) 論

采用旋涂法在ITO 平面微電極上制備了P(VDF-Tr FE)納米級(jí)薄膜，通過(guò)改變P(VDF-Tr FE)溶液濃度和旋涂層數(shù)來(lái)調(diào)控薄膜的致密度、厚度和絕緣能力，其中致密且絕緣的P(VDF-Tr FE)薄膜的最小厚度為470 nm。該薄膜可以有效地隔絕電刺激時(shí)電極上的微電流和可能存在的電化學(xué)產(chǎn)物，并消除因電極圖案化造成的材料不均勻性的影響。電刺激能使ITO 上的薄膜表面處產(chǎn)生電場(chǎng)，電場(chǎng)強(qiáng)度受刺激電壓調(diào)控。初步驗(yàn)證電場(chǎng)刺激能夠促進(jìn)MSCs的增殖和成骨分化，最佳刺激電壓為250 m V。