尹壽新 趙靜 亓麟 周童 楊廷廷 黃加國(guó)

原發(fā)性肝癌(primary liver cancer，PHC)是一種常見的肝臟惡性腫瘤，侵襲能力極強(qiáng)，是死亡率最高的惡性腫瘤之一[1]。PHC在全球的發(fā)病率排名第6位，死亡率排名第3位[2]。>50%的PHC發(fā)病原因與乙肝病毒感染相關(guān)，每年新增的PHC患者超過(guò)50萬(wàn)例[3]。目前，臨床上對(duì)PHC的早期診斷仍很困難，生物學(xué)標(biāo)記物的靈敏性和特異度均不高，導(dǎo)致對(duì)肝癌的診斷價(jià)值欠佳，因此急需找到對(duì)肝癌早期診斷的標(biāo)志性物質(zhì)。近年來(lái)，微小RNA(miRNA)的異常表達(dá)可影響腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。miRNAs是一種高度保守的非編碼的單鏈RNA，其在機(jī)體內(nèi)通過(guò)在RNA轉(zhuǎn)錄水平上結(jié)合特異性的靶基因，從而達(dá)到基因沉默的效果，充當(dāng)“基因海綿”的作用，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[4,5]。相關(guān)報(bào)道證明，miR-146a在肺癌、乳腺癌和肝癌中表達(dá)異常增高，通過(guò)高表達(dá)來(lái)抑制其靶基因的表達(dá)，從而影響腫瘤的增殖[6]。另有報(bào)道，miR-202在胃癌中表達(dá)降低，可抑制胃癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其凋亡，發(fā)揮類似抑癌基因的作用[7]。而miR-148b的相關(guān)報(bào)道較少，Nie等[8]發(fā)現(xiàn)miR-148b的表達(dá)與肝癌患者的預(yù)后相關(guān)。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)多種miRNAs在人類肝癌細(xì)胞中異常表達(dá)[9]。本研究通過(guò)對(duì)原發(fā)性肝癌患者中miR-146a、miR-202和miR-148b的表達(dá)研究，分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，分析它們之間表達(dá)水平的相關(guān)性，為肺癌的診斷、治療及預(yù)后提供理論基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2018年2月至2019年2月首次治療并經(jīng)病理確診為原發(fā)性肝癌的78例患者作為研究對(duì)象。其中男48例，女30例；平均年齡(46.8±6.8)歲；其中具有乙肝病史61例，臨床TNM分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期33例，Ⅲ期18例。另外選取同期體檢正常者58例作為對(duì)照組，其中男35例，女23例；平均年齡(44.9±6.4)歲。2組資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，所有研究過(guò)程均符合為院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的相關(guān)規(guī)定。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有患者經(jīng)由病理組織學(xué)確診；(2)患者的臨床資料均完整性高，且順從性好；(3)經(jīng)患者及其家屬同意，簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)伴有高血壓、長(zhǎng)期酗酒等患者；(2)伴有心血管、腎臟病變等患者；(3)伴有其他惡性腫瘤的患者；(4)伴有精神病患者。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料與儀器 Trizol試劑由美國(guó)Invitrogen公司提供，cDNA第一鏈合成試劑盒和SYBR Green Master Mix試劑盒均由Vazyme公司提供，酶聯(lián)免疫試劑盒由ebioscience公司提供，miR-146a、miR-202和miR-148b引物由南京金唯智生物技術(shù)有限公司合成。主要儀器為Thermo公司生產(chǎn)的紫外分光光度計(jì)和TCA5020的普通PCR儀，美國(guó)ABI公司的7500-實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，日本SANYO公司提供的凝膠成像分析系統(tǒng)，美國(guó)Bio-Rad公司提供的電泳儀和電泳槽，多功能酶標(biāo)儀由美國(guó)Thermo公司提供。見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.4 方法 抽取清晨空腹靜脈血5 ml進(jìn)行檢測(cè)，2 000 r/min離心10 min，分離出血清，應(yīng)用RT-PCR法檢測(cè)miR-146a、miR-202和miR-148b的表達(dá)水平。用Trizol試劑提取血清中RNA，整個(gè)過(guò)程嚴(yán)格按照操作說(shuō)明書進(jìn)行。提取肝癌患者血清和正常人血清的RNA。miR-146a、miR-202和miR-148b莖環(huán)結(jié)構(gòu)逆轉(zhuǎn)錄引物序列為5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACATGGTT-3’。具體的逆轉(zhuǎn)錄條件為16℃(30 min)、42℃(30 min)和75℃(15 min)，在進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)，先使用95℃變性10 min，溫度維持15 s，而后用60℃反應(yīng)1 min，連續(xù)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，每個(gè)反應(yīng)平均進(jìn)行3次。對(duì)反應(yīng)管中熒光信號(hào)達(dá)到指定區(qū)域經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，即Ct值，采用U6為內(nèi)參，使用相對(duì)定量法計(jì)算腫瘤組織目的基因表達(dá)水平與配對(duì)的正常組織相差的倍數(shù)，即2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(腫瘤CtmiRNA-CtU6)-(正常CtmiRNA-CtU6)。

1.5 觀察指標(biāo) 對(duì)比肝癌患者和正常人的血清miR-146a、miR-202和miR-148b的表達(dá)差異，同時(shí)分析其與臨床病理參數(shù)的聯(lián)系；對(duì)miR-210-3p和p21、p53、Ki67和HIF-1α表達(dá)水平的相關(guān)性進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 2組受試者miR-146a、miR-202和miR-148b表達(dá)水平比較 與對(duì)照組比較，觀察組肝癌血清中miR-146a的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，miR-202和miR-148b的表達(dá)水平顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.2 肝癌患者血清中miR-146a、miR-202和miR-148b的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)特征的關(guān)系 肝癌血清中miR-146a、miR-202和miR-148b的表達(dá)水平均與患者的性別、年齡、分化程度、TNM分期、轉(zhuǎn)移與否、是否發(fā)生肝硬化、HBV是否有感染、血清AFP水平、包膜是否浸潤(rùn)、腫瘤直徑和腫瘤部位均無(wú)關(guān)(P>0.05)，而與患者的腫瘤數(shù)目間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表2 2組受試者miR-146a、miR-202和miR-148b表達(dá)水平比較

表3 肝癌患者血清中miR-146a、miR-202和miR-148b的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)特征的關(guān)系

2.3 2組miR-146a、miR-202和miR-148b的表達(dá)水平比較 與非乙肝組比較，乙肝組肝癌血清中miR-146a的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)，miR-202和miR-148b的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表4。

2.4 肝癌患者中miR-146a、miR-202和miR-148b的表達(dá)量間的相關(guān)性分析 應(yīng)用Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，肝癌患者中miR-146a的表達(dá)水平與miR-202和miR-148b的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.825，P=0.001；r=-0.768，P=0.012)，而腫瘤患者中miR-202的表達(dá)水平與miR-148b的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r=-0.705，P=0.010)。見圖1～3。

表4 乙肝患者和非乙肝患者miR-146a、miR-202和miR-148b的表達(dá)水平比較

3 討論

原發(fā)性肝癌的發(fā)生與發(fā)展涉及了很多生物學(xué)和化學(xué)的致癌因素，其發(fā)病隱匿，預(yù)后不良，極少數(shù)在初期進(jìn)行手術(shù)治療，其腫瘤癌變的機(jī)制并不明確。目前，臨床上常用甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)用于早期原發(fā)性肝癌的診斷，其檢測(cè)靈敏方便；然而，相關(guān)研究顯示仍有30%的原發(fā)性肝癌患者檢測(cè)呈現(xiàn)陰性，陽(yáng)性表達(dá)也有很多[10]，因此，大幅度限制了AFP在肝癌早期檢測(cè)的應(yīng)用。另外臨床上常用活檢和影像學(xué)來(lái)檢測(cè)早期的原發(fā)性肝癌，但均由于其靈敏度和特異性的局限性，導(dǎo)致診斷價(jià)值欠佳[11]。近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，miRNAs是近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)并成為研究熱點(diǎn)的一類小分子編碼RNA。大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNAa在腫瘤中有表達(dá)譜的改變，大部分采集的組織樣本，限制了臨床的應(yīng)用，但miRNA在血清中穩(wěn)定存在，不會(huì)輕易被RNA酶降解，且水平在組織中具有特異性[12]，因此，miRNA可成為潛在的腫瘤診斷的生物學(xué)標(biāo)記。

目前，大部分miRNA分子都是通過(guò)與靶基因的3’UTR區(qū)域結(jié)合而發(fā)揮細(xì)胞調(diào)節(jié)作用。miR-146a，我們通過(guò)Targetscan軟件預(yù)測(cè)其靶基因?yàn)镕OXO1，F(xiàn)OXO1是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，是一種抑癌基因，相關(guān)研究證明，miR-146a在非小細(xì)胞癌、乳腺癌等癌癥中均特異性表達(dá)，因其與靶基因FOXO1在mRNA水平特異性結(jié)合，從而抑制了抑癌基因FOXO1的表達(dá)，從而達(dá)到促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖的作用[13]。FOXO1在調(diào)控肝癌發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制可能是FOXO1表達(dá)下調(diào)后，腫瘤細(xì)胞周期停滯能力障礙有關(guān)。也有相關(guān)研究表示，miR-146a可作為癌基因促進(jìn)宮頸癌和結(jié)腸癌的發(fā)生與轉(zhuǎn)移[14,15]。本研究中，原發(fā)性肝癌患者中的miR-146a的表達(dá)水平是顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，說(shuō)明了miR-146a在原發(fā)性肝癌中是高表達(dá)水平狀態(tài)。

在靶基因預(yù)測(cè)軟件Targetscan中，miR-202的靶基因?yàn)镚il1。Gil1首次在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)，Gil1是腫瘤發(fā)生過(guò)程中Hh通路上的一個(gè)促癌基因，在很多腫瘤中發(fā)現(xiàn)高表達(dá)，且表達(dá)量與腫瘤的分化程度相關(guān)[16]，相關(guān)文獻(xiàn)證明，在胃癌細(xì)胞和組織中，miR-202的表達(dá)水平顯著低于正常組，其在體外實(shí)驗(yàn)也證明了miR-202是通過(guò)靶向抑制Gil1的表達(dá)功能，從而抑制了胃癌細(xì)胞的增殖及促進(jìn)其凋亡[17]。同樣的，miR-148b在報(bào)道中已被證實(shí)，其靶基因是葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF2H1)，相關(guān)研究證明，GTF2H的rs3802967位點(diǎn)的改變使得GTF2H1的蛋白表達(dá)發(fā)生變化，導(dǎo)致癌癥患病的風(fēng)險(xiǎn)增加，GTF2H與腫瘤的增殖及轉(zhuǎn)移具有相關(guān)性[18]，關(guān)于miR-148b與腫瘤的機(jī)制研究甚少。另有研究證實(shí)，miR-148b在肝轉(zhuǎn)移中表達(dá)水平顯著下降[19]，在本研究中，發(fā)性肝癌患者中的miR-202和miR-148b的表達(dá)水平低于正常對(duì)照組(P<0.05)。在研究miRNA與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，我們發(fā)現(xiàn)miR-146a、miR-202和miR-148b均與腫瘤數(shù)目具有相關(guān)性(P<0.05)，多發(fā)性腫瘤的miR-146a水平高于單發(fā)性腫瘤，miR-202和miR-148b的水平低于單發(fā)性腫瘤，說(shuō)明miR-146a、miR-202和miR-148b與肝腫瘤的增殖密切相關(guān)。且我們發(fā)現(xiàn)，乙肝組miR-146a顯著高于非乙肝患者組(P<0.05)，而miR-202和miR-148b低于非乙肝患者組(P<0.05)，說(shuō)明乙肝對(duì)miR-146a、miR-202和miR-148b的表達(dá)均有影響且可作為乙肝的特異性診斷指標(biāo)。

Pearson相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)miR-146a與miR-202和miR-148b的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，miR-202與miR-148b的表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)。其可能的作用機(jī)制均為miR-146a、miR-202和miR-148b通過(guò)“海綿效應(yīng)”，在mRNA水平與分別與FOXO1、Gil1和GTF2H靶基因相結(jié)合，而靶基因通過(guò)多種代謝途徑調(diào)節(jié)肝癌細(xì)胞的增殖與發(fā)展，從而達(dá)到miRNA影響了腫瘤細(xì)胞在患者體內(nèi)的變化的作用。但其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探索。

綜上所述，miR-146a、miR-202和miR-148b在原發(fā)性肝癌的發(fā)生與發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，不僅僅對(duì)于肝癌或乙肝早期的診斷和治療具有重要的臨床意義，對(duì)于肝癌或乙肝患者的預(yù)后提供了理論支持。