李紅 楊昊 鞠海濤

腦膠質(zhì)瘤是起源于大腦和中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)細(xì)胞或前體細(xì)胞的最常見的原發(fā)性惡性腫瘤，包括星形細(xì)胞瘤和少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤等病理類型[1]。目前手術(shù)聯(lián)合放、化療是腦膠質(zhì)瘤的主要治療手段[2]，然而高度侵襲性膠質(zhì)瘤患者中位生存期僅為12～14個(gè)月，放射抵抗是導(dǎo)致其預(yù)后不良的重要原因[3]。因此，探討腦膠質(zhì)瘤放射抵抗的分子機(jī)制，提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放射敏感性迫在眉睫。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(Long non-coding rna，lncRNA)是長(zhǎng)度超過200個(gè)核苷酸的非蛋白編碼轉(zhuǎn)錄本，通過與基因組DNA、微小RNA(microRNA，miRNA)、mRNA和蛋白相互作用，發(fā)揮其生理和病理功能[3]。大量研究表明除參與正常發(fā)育外，lncRNA與腫瘤發(fā)生的密切相關(guān)，其可作為癌基因或抑癌基因，參與腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、放療耐藥和預(yù)后[4,5]。研究顯示，LINC00963在黑色素瘤[6]、肝癌[7]等多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)發(fā)揮癌基因作用，沉默LINC00963還可提高乳腺癌細(xì)胞的放射敏感性[8]。miRNA是一種抑癌基因，miR-144-5p過表達(dá)可增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的放射敏感性[9]。生物信息學(xué)分析顯示LINC00963和miR-144-5p之間可能存在相互作用，于是本研究推測(cè)LINC00963可能通過靶向miR-144-5p參與調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡及放射敏感性。因此，本研究通過體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)旨在探討LINC009631和miR-144-5p對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射射敏感性的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 收集2016年1月至2018年1月于內(nèi)蒙古腫瘤醫(yī)院和內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院接受神經(jīng)外科手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本20例，其中男14例，平均年齡47.2歲；女6例，平均年齡45.5歲。應(yīng)用冰凍組織切片法和免疫組化方法病理科對(duì)采集的膠質(zhì)瘤樣本按照WHO 2007年分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)鑒定，其中Ⅰ～Ⅱ級(jí)8例，Ⅲ～Ⅳ級(jí)12例。收集同期于我院因顱腦手術(shù)切除的正常人腦組織20例。腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；Trizol試劑、RIPA裂解液、LipofectamineTM 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；TLINC00963小干擾RNA陰性對(duì)照(si-NC)、TLINC00963小干擾RNA(si-TLINC00963)、miR-144-5p模擬物陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-144-5p模擬物(miR-144-5p mimics)、miR-144-5p抑制物陰性對(duì)照(anti-miR-NC)、miR-144-5p抑制物(anti-miR-144-5p)、空載體(pcDNA)、LINC00963過表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA-LINC00963)購(gòu)自上海吉瑪制藥有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR green qPCR Super Mix購(gòu)于大連Takara公司；兔抗B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)和活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved-caspase 3)以及GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 U251細(xì)胞采用體積分?jǐn)?shù)為10%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱進(jìn)行常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)狀況良好的U251細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞分組如下。si-NC組：轉(zhuǎn)染si-NC；si-LINC00963組(轉(zhuǎn)染si-LINC00963)、miR-NC組(轉(zhuǎn)染miR-NC)、miR-144-5p組(轉(zhuǎn)染miR-144-5p mimics)。為驗(yàn)證LINC00963是通過調(diào)控miR-144-5p進(jìn)而影響U251細(xì)胞凋亡和其放射敏感性，將U251細(xì)胞分為以下兩組：si-LINC00963+anti-miR-NC組(共轉(zhuǎn)染si-LINC00963和anti-miR-NC)、si-LINC00963+anti-miR-144-5p組(共轉(zhuǎn)染si-LINC00963和anti-miR-144-5p)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照脂質(zhì)體LipofectamineTM 2000使用說明書步驟進(jìn)行。

1.3 RT-qPCR檢測(cè)LINC00963和miR-144-5p的表達(dá) 采用Trizol法分別提取正常腦組織、腦膠質(zhì)瘤組織以及各組U251細(xì)胞的總RNA，紫外分光光度法檢測(cè)總RNA濃度后，取適量RNA將其逆轉(zhuǎn)為cDNA，以cDNA為模板按照SYBR green qPCR Super Mix試劑盒說明書步驟利用ABI prism 7500進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。引物由上海生工生物工程有限公司，序列如下。LINC00963-F：5’-GCCAAGGAGGGAGTTGTGGCTGC-3’，LINC00963-R：5’-CTGTTGCCACACCATGCAC-CACTCC-3’；miR-144-5p-F：5’-GGGGGGGGATATCATCATATAC-3’，miR-144-5p-R：5’-GTGCGTGTCGTGGAGTCG-3’；U6-F：5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，U6-R：5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’，GAPDH-F：5’-TGAAGGTCGGAGTCAACGGATTTG-GT-3’，GAPDH-R：5’-CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC-3’。按照2-ΔΔCt法獲得LINC00963(以GAPDH為內(nèi)參)和miR-144-5p(以U6為內(nèi)參)的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 用starBase v2.0網(wǎng)站在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)LINC00963與miR-144-5p之間部分互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，推測(cè)LINC00963可靶向調(diào)控miR-144-5p表達(dá)并進(jìn)行驗(yàn)證。含miR-144-5p結(jié)合位點(diǎn)的野生型熒光素酶報(bào)告基因載體(WT-LINC00963)、突變型熒光素酶報(bào)告基因載體(MUT-LINC00963)由上海吉瑪制藥有限公司提供。利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將WT-LINC00963和miR-144-5p mimics或miR-NC共轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞，再將MUT-LINC00963與miR-144-5p mimics或miR-NC共轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，收集各組細(xì)胞并測(cè)定其熒光素酶活性。為驗(yàn)證LINC00963對(duì)miR-144-5p細(xì)胞的調(diào)控作用，分別將si-NC、si-LINC00963、pcDNA以及pcDNA-LINC00963轉(zhuǎn)染至U251細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h，RT-qPCR檢測(cè)miR-144-5p的表達(dá)水平。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集轉(zhuǎn)染48 h時(shí)的各組細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液洗滌細(xì)胞后，加入適量的結(jié)合緩沖液調(diào)整細(xì)胞濃度，取100 μl的細(xì)胞懸液(約1×104cells)加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl的PI溶液，混勻后置于暗處孵育10 min，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活分?jǐn)?shù) 分別以不同劑量(0、2、4、6、8 Gy)射線照射各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞2 h，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后更換新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)肉眼看見克隆形成時(shí)，棄去培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，經(jīng)甲醇固定和結(jié)晶紫染色后，顯微鏡下計(jì)算≥50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。克隆形成率=為克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)=實(shí)驗(yàn)組克隆形成率/對(duì)照組克隆形成率，放射增敏比=沉默(過表達(dá))前細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)/抑制(過表達(dá))后細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)。利用GraphPadPrism 7軟件擬合單擊多靶模型曲線，計(jì)算準(zhǔn)閾劑量(Dq)、平均致死劑量(D0)、存活分?jǐn)?shù)(SF2)、放射增敏比(SER)。

1.7 Western blot檢測(cè)Bcl-2、Bax和cleaved-caspase3的表達(dá) 采用RIPA裂解液分別提取各組細(xì)胞的總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。按照配膠、上樣、凝膠電泳、濕法轉(zhuǎn)膜等步驟將已分離的細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，采用5%的脫脂牛奶中室溫條件下封閉膜2 h，洗膜后，采用稀釋的兔抗Bcl-2、Bax和cleaved-caspase3以及GAPDH抗體室溫孵育膜2 h，洗膜后，加入稀釋的山羊抗兔IgG室溫條件孵育膜1 h，洗膜后，采用化學(xué)發(fā)光試劑于暗室顯色，凝膠系統(tǒng)拍照，以GAPDH為內(nèi)參，用Quantity One軟件分析目的條帶的吸光度值。所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)或復(fù)孔，并重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 LINC00963和miR-144-5p在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) 采用RT-qPCR檢測(cè)，相較于正常腦組織，腦膠質(zhì)瘤組織中LINC00963的表達(dá)水平顯著升高，miR-144-5p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 LINC00963和miR-144-5p在腦膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá)

2.2 LINC00963靶向調(diào)控miR-144-5p的表達(dá) 利用StarBase在線進(jìn)行靶基因預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)LINC00963與miR-144-5p之間存在互補(bǔ)結(jié)合的核苷酸序列，雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，相較于miR-NC和WT-LINC00963共轉(zhuǎn)染組，miR-144-5p mimics和WT-LINC00963共轉(zhuǎn)染組U251細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)；相較于miR-NC和MUT-LINC00963共轉(zhuǎn)染組，miR-144-5p mimics和MUT-LINC00963共轉(zhuǎn)染組U251細(xì)胞的熒光素酶活性變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)顯示，相較于si-NC組，si-LINC00963組U251細(xì)胞miR-144-5p的表達(dá)水平顯著升高；相較于pcDNA組，pcDNA-LINC00963組U251細(xì)胞miR-144-5p的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。見圖1，表2、3。

圖1 LINC00963的序列中含有與miR-144-5p互補(bǔ)的核苷酸序列

表2 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

表3 LINC00963調(diào)控miR-144-5p的表達(dá)

2.3 干擾LINC00963表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡和放射敏感性的影響 相較于si-NC組，si-LINC00963組U251細(xì)胞LINC00963的表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，Bax和cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。采用不同劑量(0、2、4、6、8 Gy)射線分別照射si-NC組和si-LINC00963組U251細(xì)胞，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)呈劑量依賴性降低，且si-LINC00963組細(xì)胞存活率顯著低于si-NC組(P<0.05)。見圖2，表4、5。

圖2 干擾LINC00963表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡和放射敏感性的影響；A 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B 細(xì)胞凋亡流式圖；C 不同劑量照射后U251細(xì)胞的存活曲線

表4 干擾LINC00963表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡的影響

表5 單擊多靶模型參數(shù)

2.4 miR-144-5p過表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡和放射敏感性的影響 相較于miR-NC組，miR-144-5p組U251細(xì)胞miR-144-5p的表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，Bax和cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著增加(P<0.05)。采用不同劑量(0、2、4、6、8 Gy)射線分別照射miR-NC組和miR-144-5p組U251細(xì)胞，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)呈劑量依賴性降低，且miR-144-5p組細(xì)胞存活率顯著低于miR-NC組(P<0.05)。見圖3，表6、7。

圖3 miR-144-5p過表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡和放射敏感性的影響；A 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)；B 細(xì)胞凋亡流式圖；C 不同劑量照射后U251細(xì)胞的存活曲線

表6 miR-144-5p過表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡的影響

表7 單擊多靶模型參數(shù)

2.5 抑制miR-144-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾LINC00963表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡和放射敏感性的作用 相較于si-NC組，si-LINC00963組U251細(xì)胞miR-144-5p的表達(dá)水平顯著升高，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著降低，Bax和cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著增加；相較于si-LINC00963+anti-miR-NC組，si-LINC00963+anti-miR-144-5p組U251細(xì)胞miR-144-5p的表達(dá)水平顯著降低，Bcl-2蛋白的表達(dá)水平顯著升高，Bax和cleaved-caspase3蛋白的表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。采用不同劑量(0、2、4、6、8 Gy)射線分別照射si-NC組、si-LINC00963組、si-LINC00963+anti-miR-NC組、si-LINC00963+anti-miR-144-5p組U251細(xì)胞，細(xì)胞存活分?jǐn)?shù)呈劑量依賴性降低，且si-LINC00963組細(xì)胞存活率顯著低于si-NC組，si-LINC00963+anti-miR-NC組細(xì)胞存活率顯著低于si-LINC00963+anti-miR-144-5p組(P<0.05)。見圖4～6，表8、9。

3 討論

膠質(zhì)瘤是最常見的侵襲性腦腫瘤，更是癌癥相關(guān)死亡率高的原因之一[10]。放療作為腦膠質(zhì)瘤患者術(shù)后輔助治療的重要手段，然而由于放療抵抗的出現(xiàn)嚴(yán)重影響腦膠質(zhì)瘤患者的治療效果，甚至導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。lncRNA和miRNA作為腫瘤多種生物學(xué)過程的調(diào)控因子，是近年來腫瘤放療抵抗研究的熱點(diǎn)。本研究LINC00963和miR-144-5p對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和放療敏感性的影響和分子機(jī)制。

圖4 抑制miR-144-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾LINC00963表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

圖5 抑制miR-144-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾LINC00963表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的存活曲線

圖6 抑制miR-144-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾LINC00963表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡流式圖

表8 抑制miR-144-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾LINC00963表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡的作用

表9 單擊多靶模型參數(shù)

本研究結(jié)果顯示腦膠質(zhì)瘤組織中LINC00963的表達(dá)較正常腦組織顯著升高，miR-144-5p的表達(dá)較正常腦組織顯著降低。采用雙熒光素酶報(bào)告基因和RT-qPCR驗(yàn)證二者之間靶向調(diào)控關(guān)系顯示，miR-144-5p是LINC00963的靶基因，且LINC00963可負(fù)性調(diào)控miR-144-5p表達(dá)。LINC00963是一種癌基因，研究顯示LINC00963在前列腺癌[11]、骨肉瘤[12]和皮膚鱗狀細(xì)胞癌[13]中表達(dá)上調(diào)，下調(diào)LINC00963可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。此外，下調(diào)LINC00963還可提高乳腺癌細(xì)胞的放療敏感性[8]。本研究采用RNA干擾技術(shù)干擾LINC00963表達(dá)后發(fā)現(xiàn)U251細(xì)胞的凋亡率顯著升高。在分子水平上干擾LINC00963還可抑制Bcl-2表達(dá)，同時(shí)誘導(dǎo)Bax和cleaved-caspase3表達(dá)。Bcl-2主要位于線粒體膜的外側(cè)，是抗凋亡家族的主要成員，其通過阻斷線粒體中細(xì)胞色素c釋放，抑制cleaved-caspase3活化，在應(yīng)對(duì)各種刺激時(shí)發(fā)揮關(guān)鍵作用，然而Bax則發(fā)揮相反的作用[14]。進(jìn)一步研究顯示干擾LINC00963表達(dá)還可降低一定劑量輻射下U251細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)，提高U251細(xì)胞的放射敏感性。以上研究揭示了LINC00963在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞放射療抵抗中的重要作用。

miR-144-5p是miR-144/451簇的成員之一，研究顯示miR-144-5p低表達(dá)與腎細(xì)胞癌患者的不良預(yù)后顯著相關(guān)，過表達(dá)顯著降低了癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力[15]；miR-144-5p在膀胱癌組織中表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-144-5p抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖[16]；miR-144-5p還可抑制食管癌細(xì)胞的侵襲和遷移，引起細(xì)胞周期S-G2期和G2-M期阻滯[17]。與上述研究結(jié)論類似，miR-144-5p在腦膠質(zhì)瘤中也發(fā)揮抑癌基因作用。過表達(dá)miR-144-5p后U251細(xì)胞的凋亡率顯著增加，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)顯著降低，促凋亡蛋白Bax和cleaved-caspase3的表達(dá)顯著升高，并降低一定劑量輻射下U251細(xì)胞的存活分?jǐn)?shù)，提高U251細(xì)胞放射敏感性。進(jìn)一步研究顯示，抑制miR-144-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾LINC00963表達(dá)對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞凋亡和放射敏感性的影響。以上研究說明LINC00963通過靶向miR-144-5p在腦膠質(zhì)瘤放療中發(fā)揮中作用。

綜上所述，LINC00963在腦膠質(zhì)瘤中表達(dá)上調(diào)，miR-144-5p表達(dá)下調(diào)。干擾LINC00963通過上調(diào)miR-144-5p可誘導(dǎo)腦膠質(zhì)瘤凋亡并提高其放射敏感性。因此，LINC00963是腦膠質(zhì)瘤的潛在治療靶點(diǎn)，干擾LINC00963聯(lián)合放療可能是一種有效的腦膠質(zhì)瘤治療策略。