陳杰

膽管癌(cholangiocarcinoma，CCA)是一種起源于膽管上皮細(xì)胞的高度惡性腫瘤。近年來，全球CCA發(fā)病率和死亡率不斷上升[1]。早期侵襲轉(zhuǎn)移是CCA的主要特征，確診后平均生存期低于24個(gè)月[2]。盡管化療在一定程度上改善了CCA治療現(xiàn)狀，但CCA患者5年存活率僅為30%左右[3]。因此，迫切需要了解CCA發(fā)生和轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋求新的診斷和治療方法。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一類缺乏編碼功能性蛋白功能的RNA分子，雖然最初被認(rèn)為是轉(zhuǎn)錄噪聲，但有研究表明LncRNA在細(xì)胞中呈高度特異性表達(dá)，具有改變惡性腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力的強(qiáng)大功能[4]。ZFPM2反義RNA1(ZFPM2 antisense RNA1，ZFPM2-AS1)是由ZFPM2基因座DNA反義鏈衍生而來的lncRNA，ZFPM2-AS1高表達(dá)與肺癌[5]、胃癌[6]、肝癌[7]的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有關(guān)，是一種潛在的診斷和預(yù)后生物標(biāo)志物以及治療靶點(diǎn)。然而，ZFPM2-AS1在CCA中的表達(dá)模式和潛在功能作用尚不清楚。本研究揭示ZFPM2-AS1在膽管癌中的表達(dá)模式，并探討了其作為CCA治療靶點(diǎn)的可行性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株 人膽管上皮細(xì)胞HIBEpic、人膽管癌細(xì)胞HuCCT1、人膽管癌細(xì)胞RBE購于上海通派生物科技有限公司；人膽管癌細(xì)胞TFK1細(xì)胞購自上海雅吉生物科技有限公司。

1.2 主要試劑 DMEM培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清購于美國Hyclone公司；LipofectamineTM 2000購于北京宜科思源科技有限公司；青鏈霉素溶液、Trizol試劑、四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)試劑、二甲基亞砜均購自北京索萊寶生物技術(shù)有限公司；Transwell小室和基質(zhì)膠購于北京優(yōu)尼康生物科技有限公司；兔源細(xì)胞周期素D1(CyclinD1)抗體、兔源基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)抗體、兔源MMP-9抗體、兔源β-actin抗體、山羊抗兔IgG二抗購自武漢愛博泰克生物科技有限公司；實(shí)驗(yàn)中所用載體、模擬物、抑制物及對照均在上海生工生物科技有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng):HIBEpic細(xì)胞、HuCCT1細(xì)胞、TFK1細(xì)胞分別培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，RBE細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中，所有培養(yǎng)基添加10%胎牛血清和1%的青鏈霉素雙抗。置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和實(shí)驗(yàn)分組:將對數(shù)期RBE細(xì)胞接種到96孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度為50%時(shí)，隨機(jī)分為si-NC組(轉(zhuǎn)染小干擾RNA銀杏對照)、si-ZFPM2-AS1(轉(zhuǎn)染ZFPM2-AS1小干擾RNA)、miR-NC(轉(zhuǎn)染miRNA mimics陰性對照)、miR-515-5p組(轉(zhuǎn)染miR-515-5p mimics)、si-ZFPM2-AS1+anti-miR-NC組(共轉(zhuǎn)染si-ZFPM2-AS1和miRNA抑制物陰性對照)、si-ZFPM2-AS1+anti-miR-515-5p組(共轉(zhuǎn)染si-ZFPM2-AS1和miR-515-5p抑制物)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照LipofectamineTM 2000轉(zhuǎn)染試劑說明操作步驟進(jìn)行，轉(zhuǎn)染48 h檢測轉(zhuǎn)染效果。

1.3.3 RT-qPCR檢測膽管癌細(xì)胞中ZFPM2-AS1和miR-515-5p的表達(dá):細(xì)胞總RNA抽提使用Trizol試劑，檢測RNA樣品純度和完整性均符合實(shí)驗(yàn)要求，采用Takara逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA，利用SYBR Green qPCR Master Mix進(jìn)行qPCR反應(yīng)。分別以β-actin和U6為內(nèi)參基因，運(yùn)用2-ΔΔCt法分析ZFPM2-AS1和miR-515-5p的相對表達(dá)量。ZFPM2-AS1上游引物5’-TTTCCTACAATGAATCCACCAG-3’，下游引物5’-TTTGAGCCACTCTTTGAGG-3’；β-actin上游引物5’-GAGCCTCGCCTTTGCCGATCC-3’，下游引物5’-CGATGCCGTGCTCGATGGGG-3’；miR-515-5p上游引物TTCTCCAAAAGAAAGCACTTTCTG，下游為通用引物；U6上游引物5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’，下游引物5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’。

1.3.4 MTT實(shí)驗(yàn)檢測膽管癌細(xì)胞的增殖活力:將對數(shù)期RBE細(xì)胞接種于96孔板，按照上述分組進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，每孔加入20 μl的MTT試劑(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 mg/ml)，培養(yǎng)箱孵育4 h，吸除各孔上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜反應(yīng)10 min。酶標(biāo)儀下檢測490 nm波長處每孔的光密度值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組OD值/空白組OD值。

1.3.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測膽管癌細(xì)胞遷移和侵襲能力:細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h，收獲細(xì)胞，采用無血清細(xì)胞培養(yǎng)基調(diào)整為細(xì)胞濃度為1×106cells/ml的單細(xì)胞懸液。侵襲實(shí)驗(yàn)時(shí)取50 μl稀釋的Matrigel基質(zhì)膠小心包被于Transwell小室上室膜，風(fēng)干后備用。遷移實(shí)驗(yàn)采用未包被基質(zhì)膠的小室。向Transwell小室上室加入300 μl細(xì)胞懸液，24孔板下室加入600 μl含20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。取出小室棄去上室細(xì)胞懸液，無菌棉簽輕輕擦去上室表面細(xì)胞，PBS液沖洗2次。5%戊二醛固定下室膜20 min，結(jié)晶紫染色0.1%結(jié)晶紫染色30 min。顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，取均值表示細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目。

1.3.6 Western Blot檢測CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá):細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h分別進(jìn)行細(xì)胞裂解收集細(xì)胞蛋白，檢測蛋白濃度和純度符合實(shí)驗(yàn)要求。取適量蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并常規(guī)濕法轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，封閉膜后分別進(jìn)行一抗孵育和二抗孵育，最后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色。采用ImageJ軟件分析，以目的條帶的灰度值和內(nèi)參蛋白β-actin灰度值比值表示目的蛋白的相對表達(dá)水平。

1.3.7 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證ZFPM2-AS1對miR-515-5p的靶向調(diào)控:Starbase分析顯示ZFPM2-AS1與miR-515-5p之間存在部分特性性互補(bǔ)的核苷酸序列。為驗(yàn)證ZFPM2-AS1對miR-515-5p的靶向作用，將含有miR-515-5p結(jié)合位點(diǎn)的野生型(WT-ZFPM2-AS1)以及含有miR-515-5p結(jié)合位點(diǎn)突變序列的突變型(MUT-ZFPM2-AS1)熒光素酶報(bào)告基因載體分別與miR-NC、miR-515-5p mimics分別共轉(zhuǎn)染RBE細(xì)胞，48 h后收獲各組細(xì)胞，采用熒光素酶活性檢測試劑盒測定各組RBE細(xì)胞中熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 膽管癌細(xì)胞系中ZFPM2-AS1和miR-515-5p表達(dá)情況 與人膽管上皮細(xì)胞HIBEpic比較，3種膽管癌細(xì)胞(RBE、HuCCT1、TFK1)中ZFPM2-AS1的表達(dá)顯著升高，miR-515-5p的表達(dá)顯著降低(P<0.05)。選擇ZFPM2-AS1上調(diào)和miR-515-5p下調(diào)最顯著的膽管癌細(xì)胞RBE進(jìn)行后續(xù)研究。見表1。

表1 膽管癌細(xì)胞系中miR-515-5p和ZFPM2-AS1表達(dá)量

2.2 干擾ZFPM2-AS1表達(dá)對RBE膽管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與si-NC組比較，si-ZFPM2-AS1組RBE細(xì)胞ZFPM2-AS1的表達(dá)顯著降低，CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞增殖率、遷移和侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 干擾ZFPM2-AS1表達(dá)對RBE膽管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

圖1 Western Blot檢測CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)

2.3 過表達(dá)miR-515-5p對RBE膽管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與miR-NC組比較，miR-515-5p組RBE細(xì)胞miR-515-5p的表達(dá)顯著升高，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)顯著降低，細(xì)胞增殖率、遷移和侵襲數(shù)顯著降低(P<0.05)。見圖2，表3。

圖2 Western Blot檢測CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)

表3 過表達(dá)miR-515-5p對RBE膽管癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

2.4 ZFPM2-AS1靶向miR-515-5p 采用生物信息學(xué)分析工具starbase進(jìn)行靶基因預(yù)測顯示ZFPM2-AS1與miR-515-5p之間存在互補(bǔ)配對的核苷酸序列。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)顯示，miR-515-5p mimics和WT-ZFPM2-AS1共轉(zhuǎn)染組RBE細(xì)胞的熒光素酶活性與miR-NC和WT-ZFPM2-AS1共轉(zhuǎn)染組比較顯著降低(P<0.05)；而miR-515-5p mimics和MUT-ZFPM2-AS1共轉(zhuǎn)染組RBE細(xì)胞的熒光素酶活性與miR-NC和MUT-ZFPM2-AS1共轉(zhuǎn)染組比較無顯著變化(P>0.05)，RT-qPCR檢測ZFPM2-AS1對miR-515-5p的調(diào)控作用顯示，pcDNA-ZFPM2-AS1組RBE細(xì)胞miR-515-5p的表達(dá)較pcDNA-NC組顯著降低；si-ZFPM2-AS1組RBE細(xì)胞miR-515-5p的表達(dá)較si-NC組顯著升高(P<0.05)，提示，ZFPM2-AS1通過與miR-515-5p相互作用負(fù)性調(diào)控miR-515-5p表達(dá)。見圖3，表4、5。

圖3 starbase對miR-515-5p和ZFPM2-AS1結(jié)合進(jìn)行預(yù)測

表4 miR-NC或miR-515-5p與報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染RBE細(xì)胞后雙熒光素酶活性檢測

表5 RT-qPCR檢測miR-515-5p的表達(dá)

2.5 抑制miR-515-5p可減弱干擾ZFPM2-AS1表達(dá)對RBE增殖、遷移和侵襲的影響 與si-ZFPM2-AS1+anti-miR-NC組比較，si-ZFPM2-AS1+anti-miR-515-5p組RBE細(xì)胞miR-515-5p的表達(dá)顯著降低，CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)顯著升高，細(xì)胞增殖率、遷移和侵襲數(shù)顯著升高(P<0.05)。見表6，圖4。

表6 抑制miR-515-5p可減弱干擾ZFPM2-AS1表達(dá)對RBE增殖、遷移和侵襲的影響

圖4 Western Blot檢測CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白的表達(dá)

2.6 抑制miR-515-5p可減弱干擾ZFPM2-AS1表達(dá)對Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響 與si-NC組比較，si-ZFPM2-AS1組RBE細(xì)胞β-catenin蛋白的表達(dá)顯著降低；與si-ZFPM2-AS1+anti-miR-NC組比較，si-ZFPM2-AS1+anti-miR-515-5p組RBE細(xì)胞β-catenin蛋白的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見圖5，表7。

3 討論

ZFPM2-AS1在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)，其高表達(dá)與腫瘤浸潤深度、分化程度、腫瘤大小、TNM期呈正相關(guān)，ZFPM2-AS1表達(dá)水平較高的患者總體生存期和無病生存期較差，ZFPM2-AS1促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，并促進(jìn)腫瘤生長[6]。ZFPM2-AS1在腎細(xì)胞癌中也呈高表達(dá)，其表達(dá)水平與腎細(xì)胞癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期及生存時(shí)間有關(guān)，ZFPM2-AS1高表達(dá)顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和遷移，而對細(xì)胞凋亡有明顯的抑制作用[8]。此外，ZFPM2-AS1高表達(dá)還可促進(jìn)肺癌細(xì)胞的增殖[9]。與上述研究發(fā)現(xiàn)類似，本研究顯示3種CCA細(xì)胞中ZFPM2-AS1的表達(dá)顯著升高。隨后本研究通過檢測干擾ZFPM2-AS1表達(dá)后CCA細(xì)胞生物學(xué)行為的改變進(jìn)一步探索ZFPM2-AS1在CCA中的作用。功能分析表明干擾ZFPM2-AS1可抑制CCA細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。進(jìn)一步分析增殖、遷移侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)促增殖蛋白CyclinD1以及促轉(zhuǎn)移蛋白MMP2、MMP9的表達(dá)顯著降低，與功能分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。以上研究說明ZFPM2-AS1在CCA中發(fā)揮癌基因作用，干擾ZFPM2-AS1表達(dá)可抑制CCA進(jìn)展。

圖5 Western Blot檢測β-catenin蛋白的表達(dá)

表7 低表達(dá)miR-515-5p可以部分逆轉(zhuǎn)ZFPM2-AS1低表達(dá)對Wnt/β-catenin信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響

LncRNA通過多種機(jī)制參與癌癥進(jìn)展，其中一種是miRNA分子海綿效應(yīng)[10，11]。目前，miRNA分子海綿效應(yīng)已成為癌癥研究的重要工具。對CCA的相關(guān)研究顯示，LncRNA結(jié)腸癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄子1(Colon cancer associated transcript 1，CCAT1)通過吸附miR-152促進(jìn)肝內(nèi)膽管癌的遷移、侵襲和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[12]。LINC01296通過吸附miR-5095在人膽管癌中促進(jìn)腫瘤生長和進(jìn)展[13]。為探討ZFPM2-AS1在CCA中作用機(jī)制，采用starbase預(yù)測與ZFPM2-AS1特異性結(jié)合的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-515-5p與ZFPM2-AS1之間存在相互作用。miR-515-5p是一種抑癌基因，研究顯示miR-515-5p在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中表達(dá)較原發(fā)腫瘤患者顯著降低，miR-515-5p高表達(dá)可抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移、轉(zhuǎn)移以及小鼠轉(zhuǎn)移模型中腫瘤的擴(kuò)散，與乳腺癌患者的生存期延長有關(guān)[14，15]。此外，miR-515-5p可抑制胃癌[16]和非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞[17]的存活和轉(zhuǎn)移。本研究顯示3種CCA細(xì)胞中miR-515-5p的表達(dá)顯著降低，與CCA中ZFPM2-AS1表達(dá)模式相反。進(jìn)一步分析顯示過表達(dá)miR-515-5p抑制CCA細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，抑制CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)FPM2-AS1靶向結(jié)合miR-515-5p并負(fù)調(diào)控miR-515-5p表達(dá)。此外，恢復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示抑制miR-515-5p表達(dá)可減弱干擾FPM2-AS1對CCA細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在CCA中異常激活，抑制Wnt/β-catenin可抑制CCA進(jìn)展[18]。本研究顯示干擾FPM2-AS1表達(dá)后Wnt/β-catenin信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白β-catenin的表達(dá)顯著降低，且抑制miR-515-5p表達(dá)可減弱干擾FPM2-AS1對CCA細(xì)胞β-catenin表達(dá)的影響。以上結(jié)果提示，F(xiàn)PM2-AS1通過調(diào)節(jié)miR-515-5p表達(dá)參與CCA進(jìn)展，其機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，在膽管癌中FPM2-AS1呈高表達(dá)，miR-515-5p呈低表達(dá)。干擾FPM2-AS1通過上調(diào)miR-515-5p可抑制CCA細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，其機(jī)制可能與抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路有關(guān)。FPM2-AS1/miR-515-5p分子軸有望成為膽管癌診療的新靶點(diǎn)。