金 秋，石永利，林 波，王海嘯，張 曉，季潤(rùn)元*

（1江蘇護(hù)理職業(yè)學(xué)院醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)部，江蘇 淮安 223005；2南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院病理科，3胃腸外科，江蘇 淮安 223300；4南京醫(yī)科大學(xué)國(guó)家衛(wèi)生健康委抗體技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 211166）

結(jié)腸癌是全球第三常見(jiàn)的惡性腫瘤，2018年新增病例109.6萬(wàn)并導(dǎo)致50萬(wàn)患者死亡［1］。手術(shù)切除和放化療是早期結(jié)腸癌的有效治療手段，但對(duì)晚期結(jié)腸癌患者效果不佳，由于發(fā)病隱匿，超過(guò)半數(shù)的患者確診時(shí)已為中晚期［2］。因此，應(yīng)加大對(duì)結(jié)腸癌癌變關(guān)鍵調(diào)控因子的識(shí)別，確定新的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，最終提高結(jié)腸癌的治療效果。

核孔蛋白（nucleoporin，Nup）是核孔復(fù)合物（nuclear porecomplexes，NPC）的主要成分，它能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核之間的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)［3］。Nup在許多類型的癌癥，如乳腺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌中過(guò)表達(dá)，這表明它們可能參與了腫瘤的發(fā)生［4］。Nup107是Nup107亞復(fù)合物的關(guān)鍵組成部分，位于NPC的中心支架上，是NPC組裝和mRNA輸出的關(guān)鍵。目前關(guān)于Nup107在結(jié)腸癌中表達(dá)與預(yù)后的研究較少。

本研究檢測(cè)Nup107在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)，并證明其與結(jié)腸癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，為結(jié)腸癌的診斷、預(yù)后和靶向治療提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

所有參與研究的結(jié)腸癌患者于2012年12月—2016年5月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院接受活檢或手術(shù)，共226例。患者年齡32～76歲，平均年齡53歲。手術(shù)前患者均未接受化療或放療。另選取38例正常結(jié)腸組織作為對(duì)照。納入研究的患者臨床病理資料包括性別、年齡、腫瘤位置、組織學(xué)類型、分化、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、美國(guó)癌癥協(xié)會(huì)（American Joint Committee on Cancer，AJCC）分期、Ki67表達(dá)。本研究獲得了南京醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)和患者的知情同意。

1.2 方法

1.2.1 Ualcan檢索

Ualcan（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html）是一個(gè)有效的癌癥數(shù)據(jù)在線分析和挖掘的網(wǎng)站，主要是基于TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)癌癥數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。本研究分析比較了41例正常結(jié)腸組織和286例結(jié)腸癌組織的mRNA表達(dá)情況。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime PCR，qRT-PCR）

使用TRIzol Plus RNA純化試劑盒（Invitrogen公司，美國(guó)）從19對(duì)新鮮結(jié)腸癌和癌旁正常組織中提取總RNA。使用High-Capacity cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Thermo公司，美國(guó)）將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Power SYBR Green PCR預(yù)混液（Applied Biosystems公司，美國(guó)）在QuantStudio 5實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)中使用的引物序列如下：Nup107上游5′-CACGGACTGCACGGAAACA-3，下游5′-GAGTTCGAGGGATAACCTGGT-3′；GAPDH上游5′-CTGGGCTACACTGAGCACC-3′，下游5′-AAGTGGTCGTT GAGGGCAATG-3′。以GAPDH為內(nèi)參照基因分析Nup107 mRNA表達(dá)，以2-ΔΔCt計(jì)算Nup107相對(duì)表達(dá)量。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

1.2.3 組織芯片（tissue microarray，TMA）制作

所有組織標(biāo)本均在4%多聚甲醛固定24 h，常規(guī)石蠟包埋。提前觀察結(jié)腸組織蠟塊，確定典型組織位置。利用TMAGrand Master（3DHISTECH，匈牙利）從供體蠟塊中鉆取核心組織柱，直徑1.5 mm，然后包埋于受體塊中。將受體塊切成厚度為3 μm的切片，置于含聚賴氨酸涂層的玻片上。

1.2.4 免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry，IHC）染色

采用SP法對(duì)結(jié)腸TMA樣本進(jìn)行IHC染色，具體步驟見(jiàn)Histostain SP免疫組化染色試劑盒說(shuō)明書。一抗為兔抗人Nup107多克隆抗體（Abcam公司，英國(guó)），稀釋比例1∶200。IHC結(jié)果由2名病理醫(yī)師在雙盲情況下進(jìn)行評(píng)估。結(jié)腸組織中細(xì)胞的Nup107染色強(qiáng)度被評(píng)為0分（陰性）、1分（弱陽(yáng)性）、2分（中陽(yáng)性）、3分（強(qiáng)陽(yáng)性）。組織最終染色得分=（3×強(qiáng)染色細(xì)胞百分比+2×中度染色細(xì)胞百分比+1×弱染色細(xì)胞百分比）×100，最終染色評(píng)分范圍0～300。根據(jù)結(jié)腸癌患者的生存預(yù)后情況，使用X-tile軟件將Nup107表達(dá)情況分為高表達(dá)和低或無(wú)表達(dá)，計(jì)算出截?cái)嘀禐?15。

1.2.5 基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）

檢索TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)，獲取結(jié)腸癌患者轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)。使用GSEA v2.2.2軟件進(jìn)行分析。根據(jù)Nup107 mRNA中位表達(dá)水平將樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組進(jìn)行比較，根據(jù)分子標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)中的KEGG基因集定義功能基因集。P＜0.05且FDR＞0.25為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均在SPSS 18.0軟件上進(jìn)行分析。計(jì)量資料以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用成組t檢驗(yàn)比較兩獨(dú)立研究組間均數(shù)。對(duì)例數(shù)和率的比較采用Pearsonχ2檢驗(yàn)，計(jì)算Nup107與臨床病理特征的相關(guān)性。采用Kaplan-Meier法分析累計(jì)生存率。建立Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型，先進(jìn)行單因素分析，對(duì)P＜0.01的組別再進(jìn)行多因素分析，確定預(yù)后因素。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Nup107 mRNA在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)

通過(guò)檢索Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)，比較了41例正常結(jié)腸組織和286例結(jié)腸癌組織中Nup107 mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)Nup107 mRNA在結(jié)腸癌中的表達(dá)顯著高于正常腸黏膜組織（P＜0.05，圖1A）。通過(guò)qRTPCR檢測(cè)17對(duì)結(jié)腸癌組織和正常結(jié)腸組織的Nup107表達(dá)，驗(yàn)證了Nup107在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)（P＜0.05，圖1B）。

2.2 Nup107蛋白在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)

IHC結(jié)果顯示，Nup107蛋白定位于細(xì)胞核膜，在結(jié)腸癌細(xì)胞中高表達(dá)（圖2）。在結(jié)腸癌組織中，Nup107高表達(dá)率為65.93%（149/226），高于正常結(jié)腸黏膜組織（42.11%，16/38），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.3 結(jié)腸癌中Nup107表達(dá)水平與臨床病理特征的關(guān)系

圖1 Nup107 mRNA在結(jié)腸組織中的表達(dá)情況Figure 1 Expression of Nup107 mRNA in colon tissue

圖2 結(jié)腸組織中Nup107表達(dá)的免疫組化染色Figure 2 IHC staining for Nup107 expression in colon samples

表1 Nup107蛋白在結(jié)腸組織中的表達(dá)Table 1 Expression of Nup107 protein in colon tissues

通過(guò)收集226例結(jié)腸癌患者的臨床資料，分析Nup107表達(dá)水平和患者臨床病理特征之間的關(guān)系（表2）。結(jié)果表明，Nup107表達(dá)與腫瘤大?。é?=13.188，P=0.004）、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（χ2=12.080，P=0.002）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（χ2=7.167，P=0.007）、AJCC分期（χ2=14.135，P=0.003）和Ki67表達(dá)（χ2=10.683，P=0.001）顯著相關(guān)，而與性別、年齡、組織學(xué)類型或分化程度無(wú)相關(guān)性。

2.4 結(jié)腸癌中Nup107表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系

使用單因素和多因素Cox回歸分析確定結(jié)腸癌的預(yù)后因素。單因素分析中Nup107表達(dá)（HR：1.891，95%CI：1.627～2.250，P＜0.001）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（HR：2.124，95%CI：1.942～2.307，P＜0.001）、AJCC分期（HR：1.227，95%CI：1.112～1.436，P＜0.001）和Ki67表達(dá)（HR：0.673，95%CI：0.582～0.706，P＜0.001）與總生存期相關(guān)（表3）。多因素分析中，Nup107表達(dá)（HR：1.492，95%CI：1.179～1.845，P＜0.001）、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（HR：2.283，95%CI：1.679～2.872，P＜0.001）和AJCC分期（HR：1.201，95%CI：1.145～1.384，P＜0.001）是結(jié)腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素（表3）。Kaplan-Meier生存分析證實(shí)，Nup107高表達(dá)結(jié)腸癌患者的生存時(shí)間明顯短于Nup107低表達(dá)患者（圖3）。

表2 Nup107表達(dá)與結(jié)腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系Table 2 Relationships between Nup107 expression level and clinicopathological characteristics of patients with colon cancer

2.5 基于Nup107高表達(dá)的基因富集分析

自TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)下載結(jié)腸癌患者的RNA-seq數(shù)據(jù)，并分析Nup107高表達(dá)結(jié)腸癌患者組織中基因富集的通路。結(jié)果顯示，Nup107高表達(dá)的結(jié)腸癌組織中基因富集于基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、錯(cuò)配修復(fù)、同源重組、核糖體、剪接體、RNA降解等途徑（表4）。

3 討論

NPC由約30種不同的Nup組成，是細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間大分子交換的唯一通道［5］。NPC由Nup93復(fù)合物、Nup107/Nup160復(fù)合物和Nup62復(fù)合物3部分組成［6］。越來(lái)越多的證據(jù)表明，NPC與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。Tpr是第1個(gè)被確認(rèn)參與腫瘤發(fā)生的Nup，其在人類結(jié)直腸腫瘤中表達(dá)降低［7］。Nup98在小鼠和人肝癌中表達(dá)下降，并通過(guò)調(diào)控p53靶基因發(fā)揮潛在的抑癌作用［8］。Nup88在結(jié)直腸癌、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等腫瘤中過(guò)表達(dá)［9］。在鱗狀細(xì)胞癌中，Nup62高表達(dá)且升高，通過(guò)調(diào)控p63核轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控細(xì)胞活動(dòng)［10］。POM121在結(jié)腸癌中高表達(dá)，并能促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的侵襲性和耐藥性［11-12］。由此可見(jiàn)，不同Nup在腫瘤中發(fā)揮著促癌或抑癌的作用。

Nup107是Nup160/Nup107亞復(fù)合結(jié)構(gòu)的重要組成部分，是NPC組裝的關(guān)鍵，并參與信號(hào)調(diào)節(jié)分子的易位［13］。在DNA損傷誘導(dǎo)的基因毒性應(yīng)激中，Nup107能夠介導(dǎo)凋亡蛋白酶激活因子1的核轉(zhuǎn)位［14］。Nup107的缺失導(dǎo)致真核細(xì)胞凋亡，且干擾Nup107表達(dá)可使衰老細(xì)胞的生長(zhǎng)因子信號(hào)通路減弱［13，15］。Nup107與鼻咽癌細(xì)胞間期和有絲分裂期的NPC生成有關(guān)，并調(diào)控著絲點(diǎn)處的微管聚合［16-17］。Nup107單核苷酸變異極可能與卵巢癌患者化療敏感性有關(guān)［18］。這些發(fā)現(xiàn)提示Nup107在腫瘤組織中是一個(gè)重要的調(diào)節(jié)因子。

本研究首先通過(guò)Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)和qRT-PCR證明了Nup107在結(jié)腸癌組織中的mRNA水平高于正常腸黏膜組織，隨后對(duì)38例正常結(jié)腸組織和226例結(jié)腸癌組織進(jìn)行IHC染色，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌組織的Nup107高表達(dá)率（65.93%）高于正常結(jié)腸組織（42.11%），與其在宮頸癌組織中的表達(dá)趨勢(shì)一致［19］。分析Nup107表達(dá)水平和結(jié)腸癌患者臨床病例特征的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)Nup107高表達(dá)與較大腫瘤體積、發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、較差A(yù)JCC分期和Ki67表達(dá)陽(yáng)性有關(guān)，表明Nup107可能促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。單因素和多因素Cox回歸分析證明Nup107表達(dá)是結(jié)腸癌患者預(yù)后的風(fēng)險(xiǎn)因素，Kaplan-Meier生存曲線也顯示Nup107高表達(dá)結(jié)腸癌患者總體生存率低于Nup107低表達(dá)患者。以上結(jié)果表明，Nup107可能成為結(jié)腸癌新的預(yù)后標(biāo)志物。

目前Nup107在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制尚不清楚，本研究通過(guò)對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)腸癌患者RNA-seq信息進(jìn)行GSEA，發(fā)現(xiàn)相較于Nup107低表達(dá)結(jié)腸癌組織，Nup107高表達(dá)的結(jié)腸癌組織中基因富集于基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄因子、錯(cuò)配修復(fù)、同源重組、剪接體、RNA降解、核苷酸切除修復(fù)、細(xì)胞周期、DNA復(fù)制等途徑。轉(zhuǎn)錄因子參與了大量的人類疾病，約占目前為止發(fā)現(xiàn)的所有致癌基因的20%［20］。Nup107對(duì)腫瘤相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)可能是腫瘤發(fā)生的一大誘因。Nup107對(duì)錯(cuò)配修復(fù)、同源重組、核苷酸切除修復(fù)、DNA復(fù)制的影響表明Nup107可能通過(guò)調(diào)控DNA損傷修復(fù)促進(jìn)結(jié)腸癌的發(fā)生［21］。此外，GSEA結(jié)果表明Nup107可能通過(guò)干預(yù)細(xì)胞周期調(diào)控結(jié)腸腫瘤的生長(zhǎng)增殖。

表3 單因素和多因素Cox回歸分析結(jié)腸癌患者總生存期的預(yù)后因素Table 3 Univariate and multivariable Cox regression analysis of prognostic factors for overall survival in patients with colon cancer

圖3 結(jié)腸癌患者的Kaplan-Meier生存曲線Figure 3 Survival curves of patients with colon cancer using the Kaplan-Meier plots

表4 Nup107高表達(dá)的結(jié)腸癌患者的基因通路富集分析Table 4 GSEA of colon cancer patients with high Nup107 expression

綜上所述，Nup107在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)，且Nup107高表達(dá)與結(jié)腸癌患者預(yù)后不良相關(guān)。Nup107有可能成為結(jié)腸癌患者新的預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)，但其在結(jié)腸癌中的作用和機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。