鄧 威，孟 穎，王晨星，金齊堯，毛廣艷，李懷奇，葉金海

南京醫(yī)科大學(xué)口腔疾病研究江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，江蘇 南京 210029

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是人體最常見的6大惡性腫瘤之一，時(shí)至今日其發(fā)病率仍在上升［1-2］。OSCC具有侵襲性生長、局部浸潤及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、術(shù)后復(fù)發(fā)率高、預(yù)后差的特點(diǎn)，并且通常在中晚期才被診斷［3-4］。OSCC預(yù)后較差主要是腫瘤耐藥、術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移所引起的，OSCC的診治對臨床醫(yī)生提出了巨大挑戰(zhàn)［5］。

微小RNA（miRNA）是一種18～25個(gè)核苷酸長度的非編碼RNA，miRNA可以通過互補(bǔ)相互作用結(jié)合其靶mRNA的3′非翻譯區(qū)（UTR），從而調(diào)節(jié)基因表達(dá)［6］。在人類癌癥研究中發(fā)現(xiàn)miRNA的失調(diào)［7］，且miRNA的表達(dá)水平與癌癥的發(fā)展和進(jìn)程密切相關(guān)，因此被認(rèn)為是診斷癌癥的預(yù)測性生物標(biāo)志物之一［8］。外泌體是直徑40～150 nm的細(xì)胞外囊泡，具有雙層脂質(zhì)的膜結(jié)構(gòu)［9］，外泌體可以由多種體細(xì)胞分泌并廣泛存在于各種體液中，如尿液、血清、唾液等［10］，外泌體可以介導(dǎo)細(xì)胞間mRNA和miRNA的傳遞，并且在受體細(xì)胞中產(chǎn)生相應(yīng)的作用［11］。研究表明，外泌體中的miRNA與其起源細(xì)胞中的miRNA類似，且外泌體可以保護(hù)其包含的miRNA免受RNase降解，使其穩(wěn)定存在于循環(huán)中，表明它們可能具有作為疾病診斷標(biāo)志物及預(yù)后評價(jià)的潛在價(jià)值［12-13］。因此，本實(shí)驗(yàn)通過檢測OSCC患者血清外泌體中miRNA的表達(dá)水平，期望找到與OSCC疾病進(jìn)展有關(guān)的外泌體miRNA，為抑制OSCC轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)提供新途徑，以改善OSCC患者的生存率。

1 材料和方法

1.1 材料

新鮮的OSCC患者血清樣本來源于南京醫(yī)科大學(xué)附屬口腔醫(yī)院口腔頜面外科，常規(guī)病理結(jié)果均為OSCC，且手術(shù)前均未接受任何特殊的抗腫瘤治療。對照組血清樣本均從沒有腫瘤疾病的個(gè)體獲得。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有參與研究者均知情同意。

HN6、CAL27、HEK293及HOEC細(xì)胞株均購自ATCC細(xì)胞庫，DMEM/F-12培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、青/鏈霉素雙抗、0.25%胰蛋白酶、1×PBS緩沖液（Gibco公司，美國），胎牛血清（Sciencell公司，美國），miDETECT A TrackTMmiRNA qRT-PCR Starter Kit、cel-miR-39-3p標(biāo)準(zhǔn)品及引物、hsa-miR-182-5p引物、U6引物（廣州市銳博生物科技有限公司），TRIzol（Invitrogen公司，美國），無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇（上?；瘜W(xué)試劑有限公司），Dr.GenTLE?Precipitation Carrier（北京寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司），ExoQuick Exosome Precipitation Kit（SBI公司，美國），PKH67綠色熒光染料（Sigma公司，美國），超敏ECL發(fā)光液（江蘇新賽美生物科技有限公司），鼠抗人CD9單克隆抗體、兔抗人鈣聯(lián)蛋白（Calnexin）多克隆抗體（Abcam公司，美國），兔抗人腫瘤易感基因101蛋白（TSG101）單克隆抗體（GeneTex公司，美國），CCK-8檢測試劑盒（上海東仁化學(xué)科技有限公司），Cy3標(biāo)記的miR-182 antagomir（上海吉瑪基因公司）。

1.2 方法

1.2.1 差異miRNA篩選

登陸TCGA網(wǎng)站https：//cancergenome.nih.gov/，下載頭頸鱗癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）的569份miRNA-seq三級數(shù)據(jù)，其中包括44例癌旁組織及525例癌組織。打開R軟件，edgeR包進(jìn)行差異分析，得到包括差異基因異常表達(dá)倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）及錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）值的列表文件“diffmiSig.xls”，差異篩選的標(biāo)準(zhǔn)為|log2FC|＞1、FDR=0.05。

1.2.2 血清樣本收集

采集空腹靜脈血液5 mL于血清分離膠試管中，然后在室溫下以3 000 r/min離心10 min。吸取上層血清，轉(zhuǎn)移分裝至滅菌EP管中，于-80 ℃冰箱中保存。其中OSCC患者組17例，男9例，女8例，年齡（59.5±10.4）歲；對照組18例，男8例，女10例，年齡（58.3±13.1）歲。兩組在年齡、性別組成上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

OSCC細(xì)胞株HN6與CAL27使用含10%胎牛血清及1%青鏈霉素雙抗的DMEM/F-12培養(yǎng)基培養(yǎng)，HEK293與正常人口腔上皮細(xì)胞HOEC使用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，均培養(yǎng)于含5%CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中。

1.2.4 外泌體提取

血清外泌體的提取采用美國SBI公司生產(chǎn)的ExoQuick試劑盒進(jìn)行提取，根據(jù)說明書，4 ℃解凍300 μL血清樣本，然后將血清樣本于4 ℃條件下3 000g離心15 min，棄去沉淀，吸取250 μL血清，加入63 μL ExoQuick試劑，上下顛倒EP管混勻，于4 ℃冰箱中靜置40 min后4 ℃條件下1 500g離心30 min，棄上清然后同等條件下離心5 min，移除殘留試劑，最后加入100 μL PBS緩沖液溶解沉淀。

HEK293細(xì)胞外泌體提取：將HEK293細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期，更換培養(yǎng)基（包含不含外泌體的10%胎牛血清，將胎牛血清以200 000g離心18 h以耗盡外泌體），繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集上清液，參考Thery等［14］的方法進(jìn)行外泌體的提取，將上清液在4 ℃下以1 000g離心30 min，然后以10 000g離心60 min，去除死細(xì)胞和碎屑，然后使用L-80XP超速離心機(jī)（貝克曼）在4 ℃下以140 000g離心90 min。將沉淀重懸于PBS后，再以140 000g離心90 min。最后將外泌體沉淀物重懸于PBS中，使用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量。

1.2.5 透射電鏡及納米粒子追蹤分析（nanoparticle tracking analyzer，NTA）

外泌體樣品用1%戊二醛固定，并用1%磷鎢酸染色，于透射電子顯微鏡下觀察外泌體并拍攝圖片。使用ZetaView系統(tǒng)（Particle Metrix）進(jìn)行NTA，追蹤懸浮在PBS中外泌體的布朗運(yùn)動，并且通過Stokes-Einstein方程生成尺寸分布數(shù)據(jù)。

1.2.6 Western blot實(shí)驗(yàn)

用RIPA裂解液提取細(xì)胞及外泌體總蛋白，將等量的蛋白質(zhì)樣品加樣并在十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳（血清外泌體上樣量為70 μg，HEK293外泌體上樣量為20 μg），然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。用5%的脫脂奶粉溶液封閉1 h，將膜與CD9抗體、TSG101抗體、Calnexin抗體一起在4 ℃下過夜，次日用TBST溶液洗滌3次，將膜在室溫下與二抗孵育1 h，再用TBST溶液洗滌3次。最后使用ECL發(fā)光試劑盒將蛋白條帶可視化。

1.2.7 RNA提取和RT-qPCR

采用TRIzol法提取細(xì)胞及外泌體總RNA，在提取血清外泌體總RNA時(shí)加入線蟲cel-miR-39-3p標(biāo)準(zhǔn)品作為外參，加入Dr.GenTLETMPrecipitation Carrier提高RNA的回收效率。使用Nanodrop2000檢測RNA純度和濃度。線蟲cel-miR-39-3p引物、hsamiR-182-5p引物、U6引物均購自廣州市銳博生物科技有限公司。采用加尾法試劑盒miDETECT A TrackTMmiRNA qRT-PCR Starter Kit進(jìn)行RT-qPCR檢測。檢測細(xì)胞中miR-182表達(dá)水平時(shí)以U6作為內(nèi)參，檢測血清外泌體miR-182表達(dá)水平時(shí)以cel-miR-39-3p作為參照基因，采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-182的相對表達(dá)量。ΔCT（細(xì)胞）=CTmiRNA-CTU6，ΔCT（外泌體）=CTmiRNA-CTcel-miR-39。

1.2.8 HEK293細(xì)胞外泌體加載miR-182 antagomir

miR-182 antagomir是miR-182的拮抗劑，在3′末端膽固醇基修飾，5′端使用紅色熒光Cy3標(biāo)記，并用2′Ome修飾。miR-182 antagomir上的膽固醇基可以與外泌體膜相結(jié)合從而加載到外泌體中。參考Zhang等［15］的研究，將100 nmol/L膽固醇綴合的miR-182 antagomir與200 μL PBS中的100 μg外泌體在37 ℃下孵育1 h，用PBS重懸外泌體在140 000g的條件下離心90 min后，將外泌體重懸并在使用前保存在-80 ℃。

1.2.9 熒光顯微鏡下觀察外泌體加載miR-182 antagomir

用250 μL的DiluentC液稀釋100 μL外泌體，加入1 μL的綠色熒光染料PKH67，室溫孵育4 min；然后加入500 μL含有1%牛血清白蛋白的PBS溶液防止過度染色，加入PBS稀釋外泌體，再通過140 000g離心90 min，收集外泌體并用PBS重懸，避光保存。在倒置熒光顯微鏡下觀察miR-182 antagomir是否加載到外泌體中。

1.2.10 CCK-8實(shí)驗(yàn)

將CAL27細(xì)胞接種于6孔板中（每孔2×105個(gè)細(xì)胞），待細(xì)胞貼壁后更換為含有加載miR-182 antagomir外泌體的培養(yǎng)基，對照組的外泌體加載NC（negative control，NC），培養(yǎng)48 h。將細(xì)胞消化離心計(jì)數(shù)，接種于96孔板中，每孔2 000個(gè)細(xì)胞，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，分別在24、48、72 h時(shí)，向每孔加入10 μL CCK-8溶液孵育2 h，用酶標(biāo)儀測定波長450 nm處的吸光度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-182在HNSCC癌組織中上調(diào)

對TCGA數(shù)據(jù)庫中HNSCC樣本的miRNA測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，有155個(gè)miRNA在HNSCC癌組織中高表達(dá)，107個(gè)在癌組織中低表達(dá)（圖1A）。Langevin等［16］培養(yǎng)了4種HNSCC細(xì)胞系和原代人牙齦上皮細(xì)胞，通過超速離心法分離出所培養(yǎng)的細(xì)胞上清液中的外泌體，并應(yīng)用miRNA測序來全面表征其miRNA含量，發(fā)現(xiàn)與正常的口腔上皮細(xì)胞外泌體相比，HNSCC細(xì)胞的外泌體miRNA含量存在巨大差異。我們將篩選出的差異miRNA與Langevin等的研究結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)miR-182與miR-93在HNSCC組織及4種HNSCC細(xì)胞系外泌體中均呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)（表1）。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)miR-182在OSCC癌組織中顯著高表達(dá)（P＜0.05），而miR-93在OSCC癌組織與癌旁組織中的表達(dá)水平無顯著性差異。因此我們選擇miR-182進(jìn)一步研究。

圖1 差異表達(dá)miRNA的篩選Figure 1 Screening of differentially expressed miRNAs

2.2 miR-182在OSCC細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)

通過培養(yǎng)OSCC細(xì)胞株HN6、CAL27及人正?？谇簧掀ぜ?xì)胞株HOEC，運(yùn)用qPCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-182在OSCC細(xì)胞株HN6、CAL27中表達(dá)顯著上調(diào)（圖2）。

表1 miR-182與miR-93在頭頸鱗癌癌組織相對于癌旁組織的表達(dá)量Table 1 The expression levels of miR-182 and miR-93 in head and neck squamous cell carcinoma tissues relative to paracancer

圖2 miR-182在CAL27、HN6以及HOEC中的表達(dá)情況Figure 2 Expression of miR-182 in CAL27，HN6，and HOEC

2.3 血清外泌體鑒定

運(yùn)用ExoQuick試劑盒從OSCC患者及正常人血清中提取外泌體，使用Western blot實(shí)驗(yàn)、透射電子顯微鏡和NTA表征外泌體。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示血清外泌體組檢測到外泌體標(biāo)志性蛋白TSG101和CD9的表達(dá)，而血清上清液中沒有檢測到兩者的表達(dá)（圖3A）。透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)有40～150 nm大小的囊泡樣結(jié)構(gòu)（圖3B）。NTA顯示外泌體樣本中顆粒物大小分布的峰值是105 nm，符合外泌體的粒徑分布特點(diǎn)（圖3C）。

2.4 miR-182在OSCC患者血清外泌體中的表達(dá)

圖3 血清外泌體鑒定Figure 3 Characterization of exosomes

使用ExoQuick試劑盒提取17例OSCC患者及18例正常人的血清外泌體。通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)，OSCC患者血清外泌體內(nèi)miR-182的表達(dá)水平有升高趨勢，但與對照組無顯著性差異（P＞0.05，圖4A），這可能與樣本量較少有關(guān)，在病理上腫瘤浸潤深度＞5 mm的患者血清外泌體內(nèi)miR-182含量相對于對照組有明顯升高（P＜0.05，圖4B）。

2.5 HEK293細(xì)胞外泌體鑒定

運(yùn)用超速離心法從HEK293細(xì)胞上清液中提取外泌體。Western blot實(shí)驗(yàn)顯示外泌體組檢測到外泌體標(biāo)志性蛋白CD9和TSG101的表達(dá)，而沒有檢測到胞漿蛋白Calnexin的表達(dá)（圖5A）。透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)有40～150 nm大小的囊泡樣結(jié)構(gòu)（圖5B）。NTA顯示外泌體樣本中顆粒物大小分布的峰值是98 nm，符合外泌體的粒徑分布特點(diǎn)（圖5C）。

2.6 HEK293細(xì)胞外泌體加載miR-182 antagomir

圖4 miR-182在血清外泌體中的表達(dá)情況Figure 4 Expression of miR-182 in serum exosomes

使用共孵育的方法將Cy3標(biāo)記的miR-182 antagomir加載到外泌體中，倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，紅色熒光Cy3標(biāo)記的miR-182 antagomir（圖6A）與綠色熒光PKH67標(biāo)記的外泌體（圖6B）兩者存在共標(biāo)記，呈黃色（圖6C），表明miR-182 antagomir加載到了外泌體中。

圖5 HEK293細(xì)胞外泌體鑒定Figure 5 Characterization of exosomes in HEK293

圖6 miR-182 antagomir有效加載到外泌體中（×400）Figure 6 Efficient loading of exosomes with miR-182 antagomir（×400）

2.7 加載miR-182 antagomir的外泌體抑制CAL27細(xì)胞的增殖

將加載miR-182 antagomir的外泌體與CAL27細(xì)胞共培養(yǎng)，通過CCK-8檢測發(fā)現(xiàn)，48、72 h時(shí)CAL27細(xì)胞的增殖能力受到了明顯抑制（P＜0.05，圖7）。

3 討論

外泌體是由細(xì)胞分泌的小囊泡，目前其主要的分離方法有差速超速離心法、超濾法、聚合物沉淀法、微流控芯片分離法和免疫親和法等［17］，ExoQuick試劑盒是由美國SBI公司生產(chǎn)的基于聚合物沉淀法的外泌體提取試劑盒，具有操作簡單、回收效率高和設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)，適合小體積樣本的外泌體提取。超速離心法是外泌體分離使用最廣泛的方法，但是外泌體的回收效率相對較低［18-19］，適用于體積較大外泌體含量較為豐富樣本的外泌體分離，我們采用這兩種方法分別對血清和HEK293細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的外泌體進(jìn)行提取，并通過蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)、TEM和NTA證明成功提取到了外泌體。

圖7 exo-miR-182 antagomir對CAL27細(xì)胞增殖的影響Figure 7 Effects of exo-miR-182 antagomir on the proliferation of CAL27 cells

有研究表明miR-182與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如miR-182-5p上調(diào)作為前列腺癌、膀胱癌、胃癌和乳腺癌相關(guān)的致癌基因［20-24］。Guo等［25］研究發(fā)現(xiàn)miR-182-5p通過靶向MTSS1基因調(diào)節(jié)OSCC遷移和侵襲，當(dāng)OSCC分化程度較低，T和N分期較高時(shí)miR-182-5p表達(dá)的增加更為顯著。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)OSCC患者腫瘤浸潤深度＞5 mm時(shí)，患者血清外泌體內(nèi)miR-182含量相對于正常人有明顯升高（P＜0.05），表明OSCC患者血清外泌體miR-182含量與OSCC的疾病進(jìn)展密切相關(guān)。OSCC的浸潤深度與生存率密切相關(guān)，當(dāng)腫瘤厚度超過2 mm時(shí)，常觀察到頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［26］，OSCC細(xì)胞的血管和神經(jīng)周圍浸潤是導(dǎo)致局部復(fù)發(fā)以及區(qū)域和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的預(yù)后因素［27］，因此血清外泌體miR-182可能成為OSCC的預(yù)后標(biāo)志物之一，但是其作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

研究表明miR-182可以促進(jìn)OSCC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，通過轉(zhuǎn)染抗miR-182寡核苷酸可以顯著抑制OSCC的增殖、遷移和侵襲［25，28］，但缺乏安全有效的遞送系統(tǒng)阻礙了其臨床應(yīng)用。外泌體作為天然的納米材料，具有免疫原性小，細(xì)胞毒性低，可以穿過血-腦屏障，能夠在血液中穩(wěn)定存在等特點(diǎn)［29-30］，是一種理想的藥物遞送載體，因此我們采用外泌體遞送miR-182的拮抗劑用于觀察OSCC細(xì)胞的增殖實(shí)驗(yàn)。通過共孵育的方法將親脂性修飾的miR-182 antagomir加載到HEK293細(xì)胞外泌體中，在熒光顯微鏡下觀察到藥物加載到外泌體中，加載miR-182 antagomir的外泌體可以顯著抑制CAL27細(xì)胞的增殖，這與Wang等［28］研究一致，為口腔癌治療提供了一種新的途徑。Zhang等［15］的研究發(fā)現(xiàn)通過共孵育的方法可以將膽固醇基修飾的miR-210加載到外泌體中，并且加載miR-210的外泌體可以穿過血腦屏障從而改善小鼠腦缺血損傷，Didiot等［31］研究發(fā)現(xiàn)外泌體介導(dǎo)的寡核苷酸遞送可以降低沉默Huntingtin（Htt）mRNA所需的寡核苷酸有效濃度，在最近的一項(xiàng)研究中，需要注入700 μg反義寡核苷酸才能有效沉默Htt mRNA，而Didiot等［31］研究表明，在1周內(nèi)（1 μg/d）僅注入3.5～7.0 μg hsiRNAHTT就足以降低Htt mRNA的水平約35%。上述研究表明，共孵育法是一種簡單高效的外泌體加載核酸類藥物的方法，也表現(xiàn)出外泌體在疾病治療領(lǐng)域的巨大潛力。

綜上所述，miR-182在OSCC中以及腫瘤浸潤深度大于5 mm的患者的血清外泌體中表達(dá)水平均升高，這為OSCC的診斷及預(yù)后評估提供了新的標(biāo)志物。外泌體加載miR-182的抑制劑也為口腔癌提供了潛在的治療方法。