沙博文，王 曾，周錦仁，饒建華，成 峰

南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽中心，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院肝移植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210029

肝癌是一種常見消化系統(tǒng)來源腫瘤，其病死率居全球惡性腫瘤病死率的第4位［1］，中國惡性腫瘤病死率的第2位［2］。肝癌惡性程度極高，病情進(jìn)展快，大部分發(fā)展隱匿，確診時(shí)已屬晚期，能接受根治性手術(shù)治療的患者僅為20%～30%［3］。積極探索綜合治療手段對肝癌治療尤為重要。有研究顯示，肝動(dòng)脈化療栓塞（transhepatic arterial chem otherapy and embolization，TACE）聯(lián)合索拉菲尼相比單純介入治療能明顯提高患者1年生存率［4］，奧沙利鉑等系統(tǒng)性化療方案也被用于治療不適合手術(shù)切除或有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肝癌患者［5-6］。傳統(tǒng)大劑量化療在取得一定療效的同時(shí)，不良反應(yīng)及耐藥性也隨之增加，從而限制了洛鉑等鉑類細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物在臨床的長期和廣泛應(yīng)用。有研究認(rèn)為，肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)歸與機(jī)體免疫功能狀態(tài)密切相關(guān)，鉑類細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物可通過上調(diào)主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類（major histocompatibility complex Ⅰ，MHC-Ⅰ）和抗原加工機(jī)制的其他成分來增強(qiáng)宿主免疫力，并增加腫瘤微環(huán)境中免疫效應(yīng)細(xì)胞與免疫抑制細(xì)胞的比例［7-8］。免疫檢查點(diǎn)是抑制腫瘤免疫系統(tǒng)激活的重要環(huán)節(jié)，腫瘤組織中其表達(dá)通常上調(diào)，促使腫瘤細(xì)胞逃避宿主的免疫檢測，程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PD-1）以及程序性死亡配體1（programmed cell death 1 ligand，PD-L1）等免疫檢查點(diǎn)抑制劑（immune checkpoint inhibitor，ICI）可以阻斷腫瘤免疫逃避相關(guān)途徑，增強(qiáng)宿主對腫瘤的免疫反應(yīng)及對腫瘤細(xì)胞的殺傷作用［9］。近年來已成為包括黑色素瘤和肺癌等惡性腫瘤的主要治療手段［10］。腫瘤組織PD-L1表達(dá)量與療效顯著相關(guān)［11-12］，是最早被認(rèn)為可以預(yù)測PD-1/PD-L1抑制劑療效的臨床生物標(biāo)志物。有研究顯示，在肺癌、頭頸部鱗癌中，鉑類抗腫瘤藥物可以上調(diào)腫瘤細(xì)胞抗原遞呈及PD-L1表達(dá)，增強(qiáng)宿主免疫系統(tǒng)對腫瘤的殺傷作用以及提高ICI療效［13-14］，但在肝癌中未見相關(guān)報(bào)道。因此，本文通過研究洛鉑對肝癌細(xì)胞抗原遞呈及PD-L1表達(dá)的影響，為肝癌治療提供新思路。

1 對象和方法

1.1 對象

此研究為前瞻性、單盲、隨機(jī)研究，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意。選取南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽中心2019年1—12月接受肝癌切除手術(shù)83例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前經(jīng)病理活檢、臨床檢驗(yàn)及影像學(xué)檢查考慮肝細(xì)胞肝癌，術(shù)后病理確診；②術(shù)前檢查血常規(guī)、肝腎功能、降鈣素原、凝血功能等指標(biāo)未見明顯異常，Child-Pugh分級為A/B級；③術(shù)前未接受放化療、靶向藥物、免疫治療；④術(shù)中能完整將腫瘤切除；⑤手術(shù)前后未出現(xiàn)嚴(yán)重感染、敗血癥、感染性休克、多器官功能損傷。排除標(biāo)準(zhǔn)：①對洛鉑藥物過敏者；②患有嚴(yán)重心肺疾病等重要臟器功能不全者；③患有造血系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病或免疫缺陷病、中重度營養(yǎng)不良、糖尿病者。采用隨機(jī)數(shù)法將患者分為洛鉑組42例，對照組41例。所有患者都簽署了知情同意書，其中洛鉑組患者術(shù)后出現(xiàn)腹腔感染2例，對照組患者術(shù)后出現(xiàn)腹腔感染3例，肝腎綜合征1例，術(shù)后大出血1例，死亡1例，失訪2例，排除出組后洛鉑組40例，對照組33例。

1.2 方法

1.2.1 治療方案及觀察指標(biāo)

洛鉑組在常規(guī)手術(shù)操作結(jié)束后，將50 mg洛鉑溶解于100 mL滅菌注射用水行腹腔灌注，術(shù)后留置腹腔引流管，6～7 h開放。對照組僅用滅菌注射用水沖洗腹腔，術(shù)后常規(guī)放置引流管。兩組均在術(shù)后常規(guī)給予抗炎、保肝、營養(yǎng)支持等對癥治療。兩組均于術(shù)前1 d及術(shù)后第30天采血取血清，淋巴細(xì)胞及其亞群表面抗原表達(dá)采用直接免疫熒光標(biāo)記全血溶血法，采用流式細(xì)胞儀對樣品進(jìn)行檢測，計(jì)算出其中陽性細(xì)胞的百分比。包括CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值、自然殺傷（NK）細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）細(xì)胞。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組

人類肝癌細(xì)胞系HepG2、SMCC-7721、Hep3B均購自上海中國科學(xué)院，在37 ℃、5%CO2條件下，以含有10%胎牛血清和青鏈霉素（Gibco公司，美國）的DMEM培養(yǎng)基（Life Technologise公司，美國）培養(yǎng)。2 d傳代1次，根據(jù)不同濃度洛鉑（海南長安國際制藥有限公司）處理，對照組加入PBS，處理24 h。AKT抑制劑組為洛鉑16 μmol/L+MK2206（MCE公司，美國）1 μmol/L。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）

細(xì)胞的總RNA采用TRIzol法提取，測定RNA的濃度及純度。PD-L1、GAPDH的mRNA按照常規(guī)方法采用PrimeScriptRT Reagent試劑盒（TaKaRa公司，日本）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，使用SYBR Green Master Mix試劑盒（TaKaRa公司，日本）以qPCR法檢測PD-L1及GAPDH的相對表達(dá)量，PD-L1、GAPDH引物設(shè)計(jì)合成由南京Realgene公司完成。PD-L1正向引物：5′-TGGCATTTGCTGAACGCATTT-3′，反向引物：5′-TGCAGCCAGGTCTAATTGTTTT-3′；GAPDH正向引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，反向引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。定量反應(yīng)在ABI 7900 Fast Real-Time PCR system上進(jìn)行，反應(yīng)條件：預(yù)熱變性95 ℃30 s；PCR反應(yīng)95 ℃5 s，60 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果按照2-ΔΔCt法來計(jì)算PD-L1的相對表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 Western blot實(shí)驗(yàn)

使用含1%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑RIPA裂解緩沖液（上海碧云天公司）裂解細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白。BCA定量蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液（1∶4）后于100 ℃金屬浴10 min。使用SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白后，轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上。將膜封閉30 min，然后在4 ℃與特定的一抗孵育12～14 h。此步驟中使用了PD-L1抗體、AKT抗體和p-AKT抗體（CST公司，美國），GAPDH作為內(nèi)參。TBST溶液洗膜后室溫孵育兔抗人IgG二抗（CST公司，美國）1 h，PBST溶液洗膜后加曝光液后曝光分析。以上實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測

將Hep3B肝癌細(xì)胞分洛鉑組（16 μmol/L），對照組（PBS），24 h后收集培養(yǎng)皿中的細(xì)胞，制作單細(xì)胞懸液。根據(jù)規(guī)程使用熒光染料標(biāo)記的HLA-Ⅰ、TAP-1、TAP-2流式細(xì)胞抗體（eBioscience公司，美國）。FACS緩沖液洗滌2次后用流式細(xì)胞儀分析各組肝癌細(xì)胞中HLA-I、TAP-1、TAP-2表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)在相同條件下重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS21.0和Graphpad8.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。定量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以頻數(shù)（百分比）表示，兩組間比較采用卡方檢驗(yàn)，理論頻數(shù)較低組采用Fisher’s確切概率法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 洛鉑術(shù)中腹腔灌注能夠調(diào)節(jié)患者抗腫瘤免疫

兩組患者一般臨床資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。洛鉑組患者手術(shù)前后外周血淋巴細(xì)胞亞群檢測顯示：CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+比值升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），Treg細(xì)胞下降（P＜0.05），CD8+、NK細(xì)胞無明顯變化（P＞0.05）。對照組患者手術(shù)前后CD4+、CD8+、NK、Treg細(xì)胞百分率及CD4+/CD8+比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表2）。說明洛鉑腹腔灌注后患者細(xì)胞免疫功能有所提高，同時(shí)降低Treg水平對抗腫瘤免疫逃逸。

2.2 洛鉑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞抗原遞呈組件表達(dá)升高

兩組Hep3B肝癌細(xì)胞用流式細(xì)胞技術(shù)檢測肝癌細(xì)胞表面HLA-Ⅰ、TAP-1、TAP-2。結(jié)果顯示，洛鉑組肝癌細(xì)胞表面HLA-Ⅰ表達(dá)升高，抗原轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TAP-1、TAP-2表達(dá)升高（圖1）。表明洛鉑可能通過增加肝癌細(xì)胞抗原遞呈組件表達(dá)，提高抗腫瘤免疫。

2.3 洛鉑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)升高

Western blot、RT-qPCR檢測顯示，洛鉑處理的Hep3B、HepG2、SMMC-7721肝癌細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。以上實(shí)驗(yàn)表明，洛鉑能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)增加，這可能增加其對宿主的免疫逃逸，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生。

2.4 洛鉑通過AKT通路調(diào)控肝癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)

Western blot檢測洛鉑組和對照組Hep3B、HepG2、SMMC-7721肝癌細(xì)胞AKT、p-AKT、PD-L1表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組AKT表達(dá)無明顯差異，洛鉑組p-AKT、PD-L1表達(dá)升高（圖3）。而加入AKT抑制劑后（MK2206 1 μmol/L）Western blot檢測發(fā)現(xiàn)Hep3B肝癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)相比于洛鉑組下降（圖4）。說明AKT通路可能參與調(diào)控洛鉑對肝癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響。

表2 肝癌切除術(shù)中洛鉑腹腔灌注治療患者外周血淋巴細(xì)胞表型的變化Table 2 Changes in the phenotype of peripheral blood lymphocytes in patients with intraperitoneal perfusion of lobaplatin during liver cancer resection （）

表2 肝癌切除術(shù)中洛鉑腹腔灌注治療患者外周血淋巴細(xì)胞表型的變化Table 2 Changes in the phenotype of peripheral blood lymphocytes in patients with intraperitoneal perfusion of lobaplatin during liver cancer resection （）

與術(shù)前比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01。

圖1 流式細(xì)胞分析顯示洛鉑組（LBP）相比對照組（PBS）Hep3B肝癌細(xì)胞HLA-Ⅰ、TAP-1、TAP-2表達(dá)升高Figure 1 Flow cytometry analysis showed that the expressions of HLA-Ⅰ，TAP-1，and TAP-2 increased in Hep3B cells in the lobaplatin group

圖2 Western blot、RT-qPCR檢測不同濃度洛鉑對Hep3B細(xì)胞PD-L1表達(dá)影響Figure 2 Effects of different concentrations of lobaplatin on the expression of PD-L1 in Hep3B detected by Western blot and RT-qPCR

3 討論

圖3 Western blot檢測Hep3B、HepG2、SMMC-7721細(xì)胞以洛鉑（16 μmol/L）處理24 h后PD-L1、AKT、p-AKT表達(dá)情況Figure 3 Effects of lobaplatin on expression of PD-L1，p-AKT and AKT in Hep3B，HepG2，SMMC-7721 cells detected by Western blot

圖4 Western blot檢測Hep3B細(xì)胞洛鉑組、AKT抑制組和對照組PD-L1表達(dá)情況Figure 4 Effects of lobaplatin and AKT -inhibitor（MK2206）on the expression of PD -L1 in Hep3B cells detected by Western blot

肝癌因起病隱匿、早期診斷困難、病情進(jìn)展迅速、術(shù)后復(fù)發(fā)率高導(dǎo)致患者長期生存率較低［3］。治療手段包括手術(shù)治療（肝切除術(shù)和肝移植）、局部消融、TACE、放射治療以及全身治療（系統(tǒng)化療、分子靶向治療、免疫治療等），肝癌傳統(tǒng)化療雖在臨床取得一定療效，但患者獲益有限。既往研究表明肝癌與機(jī)體免疫功能狀態(tài)聯(lián)系緊密。Hodge等［7-8，14］提出，在卵巢癌、前列腺癌、頭頸部鱗癌中鉑類細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物可以上調(diào)宿主抗原呈遞組件表達(dá)，從而提高機(jī)體抗腫瘤免疫。但鉑類抗腫瘤藥物對肝癌免疫環(huán)境影響的研究尚未開展，因此我們設(shè)計(jì)了一項(xiàng)前瞻性臨床研究，通過在肝癌切除術(shù)中腹腔灌注洛鉑，對比手術(shù)前后患者淋巴細(xì)胞亞群變化探究洛鉑對機(jī)體免疫功能的影響。研究發(fā)現(xiàn)接受洛鉑腹腔灌注后的肝癌患者術(shù)后CD4+T細(xì)胞、CD4+/CD8+比值明顯升高，Treg細(xì)胞下調(diào)，說明洛鉑能夠提高機(jī)體細(xì)胞免疫功能，同時(shí)降低Treg細(xì)胞水平對抗腫瘤免疫逃逸。我們進(jìn)一步在體外實(shí)驗(yàn)中探究洛鉑對肝癌細(xì)胞的影響，用洛鉑刺激肝癌細(xì)胞，流式細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞抗原遞呈組件HLA-Ⅰ、TAP-1、TAP-2表達(dá)升高，提示洛鉑誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞免疫原性提高，從而可能加強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫，這與先前相關(guān)研究一致。

近年研究發(fā)現(xiàn)，PD-1/PD-L1等免疫檢查點(diǎn)抑制劑可以阻斷腫瘤免疫逃避相關(guān)途徑，增強(qiáng)宿主抗腫瘤免疫，在黑色素瘤及肺癌等惡性腫瘤治療中取得顯著成果。Fournel等［13］的一項(xiàng)研究中，非小細(xì)胞肺癌患者在經(jīng)過鉑類抗腫瘤藥物治療后，腫瘤組織中的PD-L1表達(dá)明顯升高，隨后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明鉑類抗腫瘤藥物相關(guān)聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑，與單用鉑類、PD-L1單抗相比，產(chǎn)生更明顯協(xié)同抑瘤作用，在胃腸道腫瘤及卵巢腫瘤中也發(fā)現(xiàn)類似抗腫瘤效果，這為臨床肝癌的治療提供了新思路［15-16］。

因此我們研究了洛鉑對肝癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)的影響，并檢測了可能參與調(diào)控的相關(guān)信號通路。結(jié)果顯示，用洛鉑刺激Hep3B、SMMC-7721、HepG2肝癌細(xì)胞后，通過Western blot、RT-qPCR檢測發(fā)現(xiàn)洛鉑處理組PD-L1表達(dá)明顯增加，證實(shí)了洛鉑能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)增高，這與鉑類藥物在其他腫瘤中的作用相一致。同時(shí)檢測了AKT通路對這一作用的影響，發(fā)現(xiàn)洛鉑組（16 μmol/L）與對照組相比，AKT無明顯變化，p-AKT、PD-L1表達(dá)增高，加入AKT阻斷劑MK2206后，PD-L1表達(dá)下降，從而證實(shí)了AKT通路參與洛鉑誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)洛鉑對肝癌具有雙重能力：洛鉑可能通過增加肝癌細(xì)胞抗原遞呈組件表達(dá)，提高抗腫瘤免疫，但同時(shí)上調(diào)PD-L1來改變腫瘤免疫逃逸。具體機(jī)制可能涉及到相關(guān)通路使腫瘤浸潤性T細(xì)胞表達(dá)升高，釋放干擾素-γ從而誘導(dǎo)PD-L1表達(dá)增加［17-18］。同時(shí)有研究指出，使用PD-L1阻斷劑能夠減少肝癌中干擾素-γ引起的CD8+T細(xì)胞凋亡［19］。但都需要進(jìn)一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

綜上所述，本研究顯示洛鉑可以提高肝癌患者抗腫瘤免疫，可能是通過上調(diào)肝癌細(xì)胞抗原遞呈組件表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤免疫原性導(dǎo)致。同時(shí)洛鉑能夠上調(diào)肝癌細(xì)胞PD-L1表達(dá)，其機(jī)制可能涉及AKT信號通路。為洛鉑等細(xì)胞毒性抗腫瘤藥物聯(lián)合PD-L1免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療肝癌提供了可能。