許雅茹，蘇明俊，孫東波

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)，大慶 163319）

豬博卡病毒（Porcine bocavirus，PBoV）是細(xì)小病毒科的博卡病毒屬下的一種病毒，屬于DNA 病毒的一種[1]。可引發(fā)豬的呼吸道與消化道感染，使患豬出現(xiàn)與傳染性胃腸炎類似的癥狀，例如豬支氣管炎、肺炎、慢性腸胃炎等[1]，母豬在懷孕期間感染該病毒后，會出現(xiàn)流產(chǎn)、胎兒死亡等情況[2]。感染該病毒的哺乳仔豬大部分在出生三天左右出現(xiàn)嘔吐并嚴(yán)重腹瀉、排水樣便的癥狀。成年豬與仔豬在受病毒感染后癥狀不同，哺乳仔豬主要表現(xiàn)為腹瀉，死亡率高達(dá)80%左右，成年豬的死亡率較低，但感染率較高[3]。給養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的影響。根據(jù)已經(jīng)有的報道可以了解，PBoV 大量存在于豬糞便中，部分豬的血液、肺及淋巴組織中可能少量存在，而對于有腹瀉、呼吸困難等癥狀的豬，檢查出PBoV 陽性的概率相對較高。PBoV在病豬中的感染率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康豬，斷奶后的仔豬常常同時感染PCV2、PRRSV 和PTTV2[4]。從2009 年以后[5]，此病毒廣泛地存在于中國和韓國等多個國家和地區(qū)，瑞典的研究人員第一次發(fā)現(xiàn)了這種病毒。PBoV1 型最開始是在患有PMWS 的仔豬體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的，研究人員從仔豬的淋巴組織中提取出了該病毒[6]，PBoV2 型最早是在美國發(fā)現(xiàn)的，北卡羅來納州的研究者在病豬的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)并提取出了該病毒。從那時起，多種PBoVs 在亞洲、歐洲和美國被發(fā)現(xiàn)和研究。自2010 年以來PBoV 在江蘇、上海、山東等多個地區(qū)被檢測到[7-8]，并且相關(guān)研究人員對這種病毒的全基因組進(jìn)行測序。在之后的兩三年里，越來越多的PBoVs 被發(fā)現(xiàn)。Cheng 等[9]在中國發(fā)現(xiàn)了PBoV1 型和PBoV2 型的存在，另外兩種PBoV3 型和PBoV4 型則由香港學(xué)者Lau 等[10]發(fā)現(xiàn)并命名，幾乎同時北愛爾蘭研究人員McKillen 等[11]也分離出該病毒并命名。最近幾年在中國豬中發(fā)現(xiàn)了一種新型PBoV 并命名為PBoV5。鄧波等[12]對于該病毒傳播進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同部位的傳染率有很大的不同，其中肺部感染的概率最大。且隨著研究的深入，鄧波等人發(fā)現(xiàn)，從感染的豬的血液和糞便中發(fā)現(xiàn)該病毒的概率越來越高。根據(jù)研究得到不同種類的帶毒豬體內(nèi)含有的病毒量是不同的，不同基因型的PBoV 感染的組織也不完全相同。如PBoV SX 型毒株在組織糞便和血清中均有報道，而另一基因型的毒株在糞便的檢出率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于肺組織中[13]。該病毒自2010 年在國內(nèi)初次被發(fā)現(xiàn)以來，PBoV 感染豬群的數(shù)量越來越多，并且傳播范圍廣泛。Shan 等[8]檢測了多地區(qū)樣品，共搜集300 多份，分析后發(fā)現(xiàn)PBoV 陽性概率在45%～75%之間。Liu 等[14]對從五個地區(qū)采集的403 份樣品進(jìn)行檢測，豬博卡病毒平均陽性感染概率約為12%，其中山東的陽性率最高，其次是河北，遼寧和河南部分地區(qū)的感染率較低，天津的感染率最低。Zhai 等[4]對北京、江蘇、河北、上海等九個城市的組織樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，有呼吸道癥狀的斷奶仔豬較其他樣本更容易被PBoV 所感染。結(jié)合上述調(diào)查結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，PBoV 在國內(nèi)豬場流行較為廣泛，陽性率比較高，并且存在幾種基因型的混合感染。Zhang 等[15]研究發(fā)現(xiàn)豬博卡病毒與PRRSV、PCV2 和CSFV 的共同感染情況廣泛存在，這表明PBoV 與多種疾病的發(fā)生有一定的聯(lián)系。因此，通過對PBoV 流行情況的調(diào)查可為該病的進(jìn)一步深入研究提供基礎(chǔ)。

PBoV 作為一種不含囊膜的單股線狀DNA 病毒，從顯微鏡下可以看到，該病毒的形狀為24 面對稱體，其直徑一般在25～30 nm 之間，單個基因組大小約為5 kb，并且有類似于回文序列所形成的像發(fā)夾的構(gòu)造，存在序列的左右兩端[16]。在病毒中，能夠進(jìn)行編碼的基因存在于三個開放式的閱讀框中，分別是ORF1、ORF2 和ORF3，這三個閱讀框分別對病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行編碼，PBoV 病毒中的ORF1 和ORF3 分別對NS1 和NP1 非結(jié)構(gòu)蛋白進(jìn)行編碼，而ORF2 則對結(jié)構(gòu)蛋白VP1 和VP2 進(jìn)行編碼[18]。在研究中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)機體中出現(xiàn)NS1 蛋白的缺失，機體中人博卡和犬博卡病毒的復(fù)制能力會表現(xiàn)為顯著低下，甚至造成病毒的復(fù)制能力喪失。NP1 基因的功能尚未明確，有報道說明，犬博卡病毒被NP1 蛋白影響了復(fù)制能力，其中主要的抗原基因有VP1、VP2 基因，由于VP1 在N 端比VP2 多出一段氨基酸組成的區(qū)域，所以VP2 成為截短蛋白[11]。就當(dāng)前的報道來看，隨著病毒基因組與日俱增的被擴增特定基因、測序，發(fā)現(xiàn)豬博卡病毒的基因序列間有較大不同，而且基因型類別很多，到現(xiàn)今為止尚未有公認(rèn)或統(tǒng)一的基因分型方式。最開始，經(jīng)過氨基酸和核苷酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹詳細(xì)分析，將豬博卡病毒分為三個支系。之后有關(guān)研究以VP1 基因作為病毒分類的標(biāo)準(zhǔn)，將PBoV 分為四個基因型。之所以是用VP1 基因作為分類標(biāo)準(zhǔn)是因為VP1 基因編碼的病毒蛋白對病毒的組織嗜性起決定作用并且對病毒的致病性產(chǎn)生了影響。這種分類辦法曾經(jīng)得到了一致同意。近幾年，根據(jù)國際病毒分類委員會依據(jù)NS1 核苷酸同源性的研究發(fā)現(xiàn)，可以將PBoV 的類型進(jìn)行重新劃分，共可以分成5 個基因型[19-21]。我國國內(nèi)也有很多學(xué)者對PBoV 的類型進(jìn)行研究，根據(jù)其全基因組序列的遺傳演化情況，將其劃分為7 個基因型[22]。

研究通過普通PCR 方法，對2015—2016 年華東地區(qū)采集的仔豬腹瀉樣品進(jìn)行PBoV 檢測，并對該病毒在華東地區(qū)流行情況及基因型進(jìn)行分析，為PBoV的流行情況和遺傳進(jìn)化情況提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，也為該病毒在我國的預(yù)防提供了可參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

樣品是從我國6 個地區(qū)（山東、江蘇、福建、上海、安徽、江西）的腹瀉病豬糞便樣品共計89 份。標(biāo)記采集地點、時間，放置于-80 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.1.2 儀器設(shè)備

表1 儀器設(shè)備Table 1 The detail information of machines

1.1.3 主要試劑

表2 主要試劑Table 2 The detail information of reagents

1.1.4 引物設(shè)計

引物序列引用于已發(fā)表文獻(xiàn)[23]，提交至相關(guān)公司合成并使用。引物具體信息見表3。

表3 PBoV NS1 基因引物序列Table 3 Primers for the amplification of PBoV NS1 genes

1.2 方法

1.2.1 樣品處理及病毒DNA 的提取

（1）取糞便200 mg 左右放入2 mL 的EP 管中，并將管放置在冰上。（2）分別向管中加入500 μL SA、100 μL SC、15 μL Proteinase K。（3）將樣本試管放在渦旋儀中振蕩15 s，然后將離心機調(diào)到12 000 轉(zhuǎn)離心；將離心后的上清液取出加入到另一個EP 管中，向其中加入10 μL RNanase A，將EP 管置于室溫中靜置5 min。（4）加入適量SH，將上清液與SH 混合均勻后再次置于冰上靜置5 min，然后置于12 000 轉(zhuǎn)的離心機中離心3 min。（5）將再次得到的上清液取出加入EP 管中，然后加入與上清液體積相同的加入異丙醇的GFA。（6）將所得溶液放到柱內(nèi)，12 000 轉(zhuǎn)，短暫離心，棄掉廢液。（7）向GD 溶液中加入無水乙醇，然后將混合后的溶液與離心液混合，再次在12 000轉(zhuǎn)速下離心30 s，去除底部液體。（8）添加定量漂洗液體，短暫離心，去除底部離心出的液體。（9）將（8）反復(fù)一次。（10）重新放到管里，12 000 轉(zhuǎn)，瞬時離心，去掉底部液體，將吸附柱放置于規(guī)定溫度，約2 min左右。（11）把柱放到新樣品管中，往膜正中位置滴入20～30 μL 液體，使DNA 溶入液體方便洗脫下來，室溫擱置柱內(nèi)膜略干后，離心適當(dāng)時間，保存離心管中液體（-20 ℃）。

1.2.2 NS1 基因擴增

取出PCR 反應(yīng)所需試劑（試劑應(yīng)在-20 ℃環(huán)境中保存），放置于室溫待其自然融化。（25 μL PCR 反應(yīng)體系詳見表4，反應(yīng)條件見表5）。將表中各成份根據(jù)反應(yīng)體系依次混合均勻，加入PCR 管中，離心后放入PCR 儀。

表4 PCR 反應(yīng)體系Table 4 PCR reaction system

表5 PCR 反應(yīng)條件Table 5 PCR reaction condition

1.2.3 目的基因的克隆及測序

1.2.3.1 目的基因純化

（1）通過PCR 儀器處理后，將產(chǎn)物經(jīng)由電泳，得到所需瓊脂糖凝膠，通過紫外光線照射，去除多余凝膠后，切碎，塞入準(zhǔn)備好的離心管中，并記錄目的片段凝膠重量。（2）向吸附柱CB2 中添加溶液，適量BL，離心，去除管底部液體，將處理好的柱重新置于管內(nèi)。（3）稱重后的瓊脂凝膠放入離心管中，向其中加入與凝膠體系相同的PC，融合混合后置于50 ℃的環(huán)境中隔水加熱8 min，上下勻速搖晃，溶解膠塊。（4）將上步所得溶液放入平衡柱中，12 000 轉(zhuǎn)，短暫離心，除去液體。（5）添加定量PW（提前加入規(guī)定量無水乙醇），離心后將管中的雜物清除。（6）再次重復(fù)該操作。（7）將之前清除的液體再次加入管中，離心，盡量將漂洗液體清除干凈，把柱子放在合適溫度，直到完全晾干。（8）將柱子放在全新樣品搜集管中后，膜中央位置加入適量液體，進(jìn)行洗脫，適當(dāng)溫度放置液體與膜充分融合，放入離心機離心，收集產(chǎn)物，并且標(biāo)記地點、時間，妥當(dāng)保存（-20 ℃）。

1.2.3.2 NS1 基因片段克隆

將膠回收產(chǎn)物與T 載體進(jìn)行連接，根據(jù)連接體系（見表6），按順序滴加到管底部，放入接儀，連接16 h（16 ℃）。將10 μL 按順序添加好的連接產(chǎn)物中加入感受態(tài)細(xì)胞（50 μL DH-5α），混勻，放到含有冰水混合物的盒內(nèi)，放到4 ℃環(huán)境下，在冰水混合物中，約30 min；之后迅速隔水加熱約1 min（42 ℃），加熱后，再次放入冰水混合物中，約2 min；向其中添加1 mL 的SOB，搖晃均勻；溶液放置在搖床上，轉(zhuǎn)速190 r·min-1，溫度37 ℃，約45 min；將溶液取出，置于5 500×g 的轉(zhuǎn)速中離心5 min，將上清液去除；剩余溶液放置在操作臺中（超凈），去除200 μL 留存，其余溶液涂在瓊脂糖固體培養(yǎng)基上并將其放置在培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)置為37 ℃，培養(yǎng)12～16 h。從其中選擇適量的單菌落，在每個平板中放置約5 個左右的菌落，對這些菌落的PCR 進(jìn)行檢測，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行陽性或陰性鑒定；取出1 mL 的陽性菌落進(jìn)行測序，然后將剩余陽性菌落放在培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)由公司對菌液進(jìn)行處理，得出結(jié)果。剩余菌液按9∶1 加入甘油共1 mL，-80 ℃保存。

表6 連接反應(yīng)體系Table 6 Connection reaction system

1.2.4 同源性及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建分析

為了對PBoV 的遺傳演化有更清晰的認(rèn)識，研究將成功測序所得毒株與參考毒株用Lasergene DNASTARTM5.06 進(jìn)行比對，并對其同源性進(jìn)行分析。遺傳演化結(jié)果經(jīng)由NJ 法制作得到，利用MEGA 6.0，進(jìn)化樹的構(gòu)建采用p-distance 模型。

2 結(jié)果

2.1 PBoV NS1 基因擴增結(jié)果

通過PCR 方法對采集的89 份樣品進(jìn)行PBoV檢測，擴增得到大小約780 bp 的片段，與預(yù)期大小相符（見圖1）。

圖1 NS1 基因擴增結(jié)果Fig.1 The amplification of the PBoV NS1 genes

2.2 菌落PCR 擴增結(jié)果

將挑選出的單個菌群進(jìn)行PCR 驗證時，需要保證該菌落中含有NS1 基因的陽性質(zhì)粒（圖2）擴增片段與目的片段相符約為780 bp。

圖2 菌落PCR 結(jié)果Fig.2 The result of individual bacterial colonies PCR

2.3 中國部分地區(qū)PBoV 分布情況

根據(jù)PCR 檢測結(jié)果，所有的89 份檢測樣本中，檢測出PBoV 的樣本共42 分，約占比47.19%；在所有6 個地區(qū)的檢測為陽性樣本中，山東、江蘇、福建、上海、安徽、江西地區(qū)陽性數(shù)量分別為9、2、7、9、6、9，分別占當(dāng)?shù)貦z測總樣本數(shù)量的37.5%、40%、41.18%、56.25%、54.55%、56.25%（見圖3）。

圖3 中國部分地區(qū)PBoV 檢測結(jié)果Fig.3 The results of PBoV in parts of China

2.4 同源性及遺傳進(jìn)化分析

對鑒定為陽性的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行克隆和測序，并將所得結(jié)果經(jīng)過處理上傳至GenBank，具體信息（見表7）。

基因序列分析結(jié)果顯示，這5 株P(guān)BoV 的核苷酸同源性達(dá)到了80.0%～85.6%，因此，可以預(yù)測其氨基酸的同源性在82.9%至87.9%之間。且鑒定的5 株P(guān) BoV 均屬于PBoV 3 型，并且被進(jìn)一步劃分為了3 個分支（G3a、G3b、G3c）。與PBoV 1 型和2 型參考毒株相比，核苷酸同源性和氨基酸同源性較遠(yuǎn)（見圖4、5）。

通過MEGA 6.0 軟件對試驗鑒定的PBoV 毒株和GenBank 數(shù)據(jù)庫中選擇的15 個毒株進(jìn)行對比，利用NJ 法建立了遺傳基因樹進(jìn)行遺傳基因分析，分析結(jié)果顯示：試驗鑒定的PBoV 與PBoV 3 型參考毒株構(gòu)成一個大分支，基于系統(tǒng)演化分析，鑒定所得序列分布在PBoV 3 型的3 個亞型中：PBoV G3a、G3b 和G3c 中，其中MH822023、MH822025 屬于G3a 分支，MH822024、MH82022 屬于G3b 分支，MH82026 屬于G3c 分支（見圖6）。

表7 部分地區(qū)PBoV 流行毒株信息Table 7 PBoV isolates obtained in some areas

圖4 NS1 基因核苷酸同源性分析Fig.4 Nucleotide homology analysis of NS1 genes

圖5 NS1 基因氨基酸同源性分析Fig.5 Amino acid homology analysis of NS1 genes

圖6 NS1 基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.6 Phylogenetic tree of PBoV NS1 genes

3 討論

當(dāng)前，國內(nèi)PBoV 流行情況比較復(fù)雜。在不同省份，PBoV 感染率從7.3%到64%不等，具體取決于感染是發(fā)生在仔豬，成年豬還是健康或患病的豬上[24]。Shan 等[8]研究了從多地搜集的健康樣品，共有300 多份，發(fā)現(xiàn)該病毒感染率約在50%到80%之間。Liu 等[17]檢測了五個省區(qū)的所有樣品，發(fā)現(xiàn)總感染率在11%左右，其中山東的感染率最高，其次是河北，天津的感染率最低為。Zhai 等[4]檢測了九個城市所采集到的組織樣品，發(fā)現(xiàn)PBoV 的感染率大約在12%到90%之間。Zhang 等[25]根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)PBoV 的地理分布主要位于中國的東部和南部沿海地區(qū)以及美國的中部各州，江蘇省和明尼蘇達(dá)州是PBoV 高發(fā)頻率的中心。Meng 等[26]對新疆地區(qū)156 份仔豬進(jìn)行PCR 檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中約有5.77%的仔豬感染了PBoV 病毒，并且同時患有其他疾病的仔豬的感染率明顯較高。研究中PBoV 感染率與Shan 和Zhai 研究結(jié)果大致相符[4，8]。

根據(jù)感染率結(jié)果發(fā)現(xiàn)，山東地區(qū)PBoV 感染率最低，而上海和江西兩個地區(qū)感染率最高。推測可能有以下原因：

（1）環(huán)境因素：PBoV 對生存環(huán)境的需求不同。據(jù)相關(guān)資料報道，PBoV 在冬季與春季氣溫驟變時節(jié)感染率較高[27]，其他季節(jié)感染率相對較低。

（2）樣品采集：研究采集的樣品較少，未能全面覆蓋搜集樣品的地區(qū)，且不同地區(qū)樣品采集數(shù)量和時間均不同，采集豬場規(guī)模差距較大，部分地區(qū)只在單一豬場采集樣品，導(dǎo)致不同地區(qū)結(jié)果差異較大。

隨著豬群感染數(shù)量的不斷增多，發(fā)現(xiàn)PBoV 的感染過程非常復(fù)雜，Xiong 等[28]研究表明鼠類嚙齒動物可以作為PBoV 的天然宿主，這一結(jié)果表明鼠類嚙齒動物在PBoV 傳播中具有潛在作用。因此，對防治普通鼠類中由嚙齒動物傳播所引起疾病的預(yù)防和控制應(yīng)該引起更多重視。當(dāng)前，對于PBoV 的傳播方式，發(fā)病原理沒有更深層次的了解。目前對豬博卡病毒的理解和分析依然在表面，個體感染通常沒有明顯的臨床癥狀，而PBoV 的共感染可以使臨床癥狀更加明顯[29]，因此很難區(qū)分PBoV 的獨特致病性以及與其他共同感染病毒的致病性。隨著源源不斷的全基因組序列被研究人員檢測、分析，發(fā)現(xiàn)PBoV 的遺傳呈現(xiàn)多種類型，由此推測可能與基因序列的改變有很大關(guān)系，現(xiàn)階段主要是通過研究病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)以及核苷酸序列的同源性比對和進(jìn)化樹的分析研究PBoV的遺傳演化。試驗測序所得的5 個毒株全部屬于PBoV G3 型，并且分布于G3a、G3b、G3c 分支中。將測序所得基因序列與參考毒株進(jìn)行比較，得出結(jié)果，PBoV G3a 毒株間的同源性在84.7%至96.1%之間，PBoV G3b 和PBoV G3c 的同源性分別為82.8%～95.3%和91.%～94.6%。PBoV G3 型毒株和G1、G2 型因為分支不同，因此具有較低的同源性，且和HBoV的同源性檢測顯示，兩類型毒株的同源性在45%至48%之間，同源性較低。在對MH822025 和KF025390對比發(fā)現(xiàn)，兩毒株的同源性高達(dá)86.6%，MH822023與KC473563 同源性高達(dá)96.1%；MH822022 與MH822024 雖然同屬于G3b 分支，但是與同源性較高的參考毒株分別獨立于小分支。由此推測豬博卡病毒的毒株隨著時間在不斷變化且變化差異較大，并且同一時期不同地區(qū)間毒株也具有明顯差異。表明PBoV 在遺傳演化過程中可能存在地域差異，可能與不同地區(qū)地理位置及氣候有關(guān)或者與豬場養(yǎng)殖和管理方式有密切關(guān)系。

4 結(jié)論

通過PCR 方法對我國部分地區(qū)89 份豬群糞便樣品進(jìn)行檢測以及測序，發(fā)現(xiàn)所采集樣品的地區(qū)均存在PBoV 的流行，根據(jù)不同地區(qū)間陽性率結(jié)果可以得出上海和江西陽性率最高。同時將測序所得5 個毒株與參考毒株經(jīng)遺傳進(jìn)化樹分析可知，5 個毒株被劃分為PBoV 3 型分支中，并且5 個毒株與參考毒株的同源性存在較大差異，分別與不同地區(qū)、不同年份的參考毒株具有較高的核苷酸、氨基酸同源性。表明PBoV 存在遺傳多樣性，可能與地區(qū)間的氣候差異或者豬場的飼養(yǎng)管理方式有關(guān)。