孟德超，宋玉錫，曹浩，張桐寧，趙暢，白云龍，夏成

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院/黑龍江省牛病防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大慶 163319）

同期排卵-定時(shí)輸精（簡(jiǎn)稱“同期發(fā)情”）技術(shù)已成為我國(guó)各大牛場(chǎng)繁殖管理中重要內(nèi)容。奶牛理想產(chǎn)犢間隔為12 個(gè)月，但目前大多數(shù)牛場(chǎng)很難達(dá)到這一標(biāo)準(zhǔn)[1]。奶牛產(chǎn)犢間隔通常在285～581 d。我國(guó)目前大部分牛場(chǎng)的產(chǎn)犢間隔平均為400 多天，且有逐年上升的趨勢(shì)[2]。據(jù)調(diào)查顯示，2013 年我國(guó)荷斯坦奶牛平均產(chǎn)犢間隔在415 d 以上，產(chǎn)后受孕天數(shù)110.3 d，產(chǎn)后第一次發(fā)情配種天數(shù)為77.6 d[3]。由于同期發(fā)情技術(shù)能夠有效的縮短奶牛產(chǎn)犢間隔，科學(xué)合理制定繁育工作計(jì)劃減輕工作量，還能治療部分繁殖疾病。該技術(shù)的應(yīng)用為牛場(chǎng)創(chuàng)造了巨大的經(jīng)濟(jì)效益。同期發(fā)情技術(shù)主要是通過(guò)對(duì)奶牛使用激素類(lèi)藥物，影響母牛發(fā)情周期，根據(jù)生產(chǎn)實(shí)際的需要，使同一批次的奶牛在規(guī)定的時(shí)間內(nèi)發(fā)情、排卵并進(jìn)行輸精[4]。同期發(fā)情技術(shù)是大型牛場(chǎng)繁育的重要環(huán)節(jié)，也是縮短產(chǎn)犢間隔的重要手段，對(duì)提高奶牛繁殖效率具有重要意義[5-6]。

目前，Presynch-Ovsynch（PO）程序作為牧場(chǎng)最廣泛使用的同期發(fā)情技術(shù)之一，實(shí)際生產(chǎn)中能有效提高奶牛的發(fā)情率和妊娠率。該技術(shù)極大地減輕了人工觀察發(fā)情的工作量，且具有效果可靠、使用面廣、可控性強(qiáng)、效率更高等優(yōu)點(diǎn)[7]。但不同牧場(chǎng)的奶牛對(duì)PO 程序的效果反映差異較大。隨著預(yù)警體系在奶牛生產(chǎn)中的應(yīng)用，許多能量狀態(tài)的生物標(biāo)志物如BHBA、NEFA 已被用于奶牛的健康監(jiān)測(cè)[8]。在個(gè)體奶牛水平上建立了BHBA、NEFA 的閾值來(lái)表明患病的高風(fēng)險(xiǎn)，篩選出有價(jià)值的生物標(biāo)志物并根據(jù)其閾值水平實(shí)施適當(dāng)?shù)母深A(yù)措施，以減少疾病發(fā)生。然而關(guān)于奶牛卵巢疾病的預(yù)警和評(píng)估卻知之甚少。因此，研究利用PO 程序處理前奶牛血漿生化指標(biāo)對(duì)奶牛輸精21 d 后妊娠陰性的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警，為牧場(chǎng)同期發(fā)情技術(shù)的高效應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

試驗(yàn)選擇56 頭產(chǎn)后40 d 高產(chǎn)荷斯坦奶牛，奶牛均來(lái)自于黑龍江省某集約化牛場(chǎng)，按照中國(guó)泌乳奶牛飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)飼喂全混合日糧（TMR），自由飲水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與給藥

產(chǎn)后40 d 奶牛進(jìn)行PO 程序處理，期間發(fā)情奶牛進(jìn)行輸精，輸精21 d 后根據(jù)B 超妊檢結(jié)果分為P 組（妊檢陽(yáng)性，N=26）、N 組（妊檢陰性，N=30）。PO 程序：在產(chǎn)后40 d 注射PG（氯前列醇鈉注射液0.2 mg·支-1，2 支），在產(chǎn)后54 d 注射PG（氯前列醇鈉注射液100 μg·支-1，2 支），在產(chǎn)后66 d 注射GnRH（戈那瑞林100 μg·支-1，1 支），在產(chǎn)后73 d 注射PG（氯前列醇鈉注射液0.2 mg·支-1，2 支），在產(chǎn)后75 d 注射GnRH（戈那瑞林100 μg·支-1，1 支）。如果PO 程序期間試驗(yàn)?zāi)膛０l(fā)情即可停藥，輸精。

1.2.2 試驗(yàn)動(dòng)物的日糧組成

日糧配比為青貯49.35%、濃縮料18.62%、全棉籽2.02%、玉米10.99%、進(jìn)口苜蓿5.38%、糖蜜3.36%、玉米蛋白粉2.24%、碳酸鉀0.18%、水7.85%。營(yíng)養(yǎng)水平為鈣0.36%、磷0.36%、鈉0.36%、鎂0.40%、鉀0.81%、鋅0.028%。

1.2.3 體況及血液的采集與生化檢測(cè)

根據(jù)奶牛體況評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（5 分制） 利用BCS Cowdition 軟件對(duì)產(chǎn)后40 d 奶牛進(jìn)行體況評(píng)分，并在清晨對(duì)試驗(yàn)?zāi)膛Ｎ哺o脈采血20 mL，注入肝素抗凝管。使用低轉(zhuǎn)速離心機(jī)以3 000 r·min-1離心10 min，取上層清液，再用高速離心機(jī)12 000 r·min-1離心5 min，分裝血清，-80 ℃下保存至生化檢測(cè)。礦物質(zhì)元素檢測(cè)項(xiàng)目及方法：鈣（Ca）、鎂（Mg）使用偶氮胂Ⅲ比色法；磷（P）采用紫外線終點(diǎn)法；硒（Se）使用原子吸收法。肝功指標(biāo)檢測(cè)：谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、堿性磷酸酶（ALP）均采用速率法。能量代謝檢測(cè)項(xiàng)目及方法：甘油三酯（TG）采用酶法檢測(cè)；總膽固醇（TC）、β-羥丁酸（BHBA）采用化學(xué)法檢測(cè)；葡萄糖（Glu）以葡萄糖氧化酶法檢測(cè)、游離脂肪酸（NEFA）通過(guò)比色法檢測(cè)。激素檢測(cè)項(xiàng)目及方法：雌二醇（E2）、孕酮（P4）采用化學(xué)發(fā)光法；胰島素（INS）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1（IGF-1）利用ELISA 檢測(cè)。其他指標(biāo)：維生素E（VE）、牛結(jié)合珠蛋白（HP）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）、活性氧（ROS）、牛組胺（HIS）均以ELISA 檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

使用IBM SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。先采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)兩組檢測(cè)指標(biāo)進(jìn)行顯著性分析，再使用斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)對(duì)存在顯著性差異指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析。建立二元Logistic 回歸來(lái)模擬各項(xiàng)指標(biāo)對(duì)PO 程序奶牛妊檢結(jié)果的預(yù)測(cè)性，采用受試者工作曲（ROC）分析風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警效果及最佳預(yù)警值。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 試驗(yàn)?zāi)膛５呐R床背景資料

由表1 可知，兩組的年齡、胎次、體況和上一年泌乳量均無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表1 試驗(yàn)?zāi)膛５呐R床背景資料Table 1 Clinical background data of all experimental cows

2.2 試驗(yàn)?zāi)膛Ｑ獫{礦物質(zhì)元素水平

由表2 可知，N 組的血漿Se、Mg 含量極顯著的低于P 組（P＜0.01）；N 組的血漿P 含量極顯著的高于P 組（P＜0.01）；Ca 含量無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表2 試驗(yàn)?zāi)膛Ｑ獫{礦物質(zhì)元素水平Table 2 Plasma levels of mineral elements in all experimental cows

2.3 試驗(yàn)?zāi)膛P、ROS、BDNF、HIS 及VE 水平

由表3 可知，兩組試驗(yàn)?zāi)膛IS 指標(biāo)存在極顯著差異（P＜0.01）；其他指標(biāo)組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表3 試驗(yàn)?zāi)膛Ｑ獫{HP、ROS、BDNF、HIS 及VE 的水平Table 3 Plasma levels of HP，ROS，BDNF，HIS and VE in all experimental cows

2.4 試驗(yàn)?zāi)膛Ｑ獫{激素水平

由表4 可知，N 組的血漿E2含量極顯著的低于P組（P＜0.01）；其他指標(biāo)組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表4 試驗(yàn)?zāi)膛Ｑ獫{激素的水平Table 4 Plasma levels of hormones in all experimental cows

2.5 試驗(yàn)?zāi)膛８喂湍芰看x的狀況

由表5 可知，N 組的血漿Glu 含量極顯著低于P組（P＜0.01），血漿BHBA、TG 含量極顯著高于P 組（P＜0.01），血漿AST 含量顯著高于P 組（P＜0.05），其他指標(biāo)組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05）。

表5 試驗(yàn)?zāi)膛Ｑ獫{肝功和能量代謝的水平Table 5 Plasma levels of liver function and energy metabolism in all experimental cows

2.6 奶牛PO 程序同期發(fā)情效果預(yù)警評(píng)估

表6 列出了與奶牛妊檢陰性相關(guān)的指標(biāo)。血漿BHBA、HIS、AST、TG、P 與21d 妊檢陰性呈顯著正相關(guān)（P＜0.05）；血漿E2、Glu、Se、Mg 與21d 妊檢陰性呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。

表6 PO 程序奶牛血液檢測(cè)指標(biāo)與N 組的相關(guān)性Table 6 Correlation between presynch ovsynch treatment of dairy cows pregnancy negative and biochemical traits in plasma

使用二元Logistic 回歸模型模擬以上指標(biāo)對(duì)PO程序奶牛妊檢陰性的預(yù)測(cè)性。分析得出，血漿E2、Glu和Se 水平可預(yù)測(cè)PO 程序奶牛的妊檢結(jié)果。

表7 妊檢陰性診斷的E2、Glu、Se 的分界值、敏感度、特異性、標(biāo)準(zhǔn)誤及ROC 曲線下面積Table 7 The cutoff point，sensitivity，specificity，standard error，and area under the ROC（receiver operating characteristic）curve of E2，Glu and Se diagnosed by pregnancy negative

表7 和圖1 可知，通過(guò)Youden 指數(shù)確定PO 程序奶牛妊檢陰性相關(guān)指標(biāo)的最佳預(yù)警值為血漿E2＜46.49 pmol·L-1、敏感度為84.6%、特異度為90%；血漿Glu＜3.59 mmol·L-1、敏感度為69.2%、特異度為100%；血漿Se＜0.58 μg·L-1、敏感度為100%、特異度為70%。E2、Glu 和Se 的ROC 曲線下面積分別為0.808、0.854 和0.854，具有一定的診斷意義。E2、Glu和Se 的聯(lián)合ROC 曲線下面積為0.938，具有較高的診斷意義。

圖1 妊檢陰性奶牛血漿E2、Glu 和Se 診斷的曲線下面積Fig.1 Area under the ROC of E2，Glu and Se diagnosed by pregnancy negative

3 討論

3.1 血漿礦物質(zhì)元素對(duì)試驗(yàn)?zāi)膛Ｈ焉锏挠绊?/h3>

硒（Se）是機(jī)體必須的微量元素。已有研究表明，缺Se 與奶牛受胎率降低，流產(chǎn)、死胎、產(chǎn)后停滯以及胎衣不下有關(guān)，使雌性動(dòng)物的子宮活動(dòng)力降低，排卵數(shù)減少，精子在生殖道內(nèi)的活力下降[9]。并且低硒奶牛有更低的首配受胎率[10]。這與試驗(yàn)中N 組奶牛血漿Se含量極顯著的低于P 組的結(jié)果相一致，奶牛血漿中Se含量較低會(huì)對(duì)PO 程序奶牛的妊娠有不良影響。

奶牛機(jī)體中Ca、P 比例是維持相對(duì)恒定的，Ca、P比例失衡會(huì)影響奶牛繁殖性能，增加奶?；疾辉邪Y的風(fēng)險(xiǎn)。研究發(fā)現(xiàn)患有繁殖障礙的奶牛血漿P 含量顯著提高，Ca 含量顯著降低，Mg 含量顯著降低，并且鈣磷平衡可以作為奶牛不孕癥的預(yù)測(cè)指標(biāo)[11-12]。實(shí)驗(yàn)中N 組奶牛血漿中P 濃度顯著高于P 組，結(jié)果與其相符。低血鈣奶牛的圍產(chǎn)期并發(fā)癥的發(fā)生率更高，導(dǎo)致產(chǎn)犢間隔時(shí)間延長(zhǎng)，對(duì)繁殖性能造成不利的影響[13]。經(jīng)調(diào)查了解到牧場(chǎng)會(huì)定期對(duì)奶牛進(jìn)行補(bǔ)Ca 措施，預(yù)防疾病發(fā)生。由此可見(jiàn)牧場(chǎng)也需注意Mg 的補(bǔ)充，要注意產(chǎn)后奶牛飼料中礦物質(zhì)元素的合理調(diào)節(jié)，預(yù)防礦物質(zhì)元素的缺乏或過(guò)剩對(duì)奶牛妊娠造成影響。

3.2 血漿炎性因子對(duì)試驗(yàn)?zāi)膛Ｈ焉锏挠绊?/h3>

牛組胺（HIS）是重要的炎性標(biāo)記物，存在于肥大細(xì)胞（MC）內(nèi)。研究表明，MC 與女性胚胎植入、流產(chǎn)、不孕癥有關(guān)[14]。一項(xiàng)研究報(bào)告了免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)在妊娠中的作用，Yuan 等[15]的研究表明子宮神經(jīng)與MC 之間存在相互作用。他們報(bào)告說(shuō)，截肢子宮的自主神經(jīng)后，子宮MC 數(shù)顯著增加。而且，這種作用導(dǎo)致組胺存儲(chǔ)減少和組胺釋放增加。過(guò)量的組胺水平會(huì)增強(qiáng)Th1 反應(yīng)，同時(shí)抑制胚胎植入前的Th2 反應(yīng)，這導(dǎo)致植入的免疫學(xué)失敗。翟明勝等[16]發(fā)現(xiàn)HIS 能影響子宮，卵巢等器官的生理機(jī)能，與生殖系統(tǒng)密切聯(lián)系。研究中N 組血漿HIS 含量極顯著的高于P 組，在輸精前奶牛組胺含量較低時(shí)更有利于奶牛妊娠。因此，在奶牛生殖系統(tǒng)的周期變化和生殖器官的生理機(jī)能等方面，HIS 的作用值得關(guān)注。

3.3 血漿激素對(duì)試驗(yàn)?zāi)膛Ｈ焉锏挠绊?/h3>

雌二醇（E2）作為主要的生殖激素對(duì)奶牛產(chǎn)后發(fā)情進(jìn)行調(diào)控。垂體由于GnRH 刺激分泌FSH，F(xiàn)SH 促使卵泡發(fā)育，在LH 的協(xié)同作用下產(chǎn)生E2，當(dāng)E2達(dá)到峰值又會(huì)刺激GnRH 釋放增多，LH 分泌增多直到達(dá)到分泌峰值，LH 與FSH 會(huì)協(xié)同作用，排出成熟卵泡[17]。低水平E2無(wú)法對(duì)下丘腦-腺垂體-卵巢軸進(jìn)行正反饋?zhàn)饔?，不能刺激GnRH 釋放，因此不能誘導(dǎo)排卵。并且孫書(shū)函等[18]已有研究表明子宮復(fù)舊不全的奶牛血漿中E2含量低。試驗(yàn)中N 組血漿E2含量極顯著的低于P 組，所以輸精前奶牛E2含量低不利于奶牛的妊娠。

3.4 血漿肝功和能量代謝指標(biāo)對(duì)試驗(yàn)?zāi)膛Ｈ焉锏挠绊?/h3>

高產(chǎn)奶牛泌乳早期所消耗能量超過(guò)其攝入的營(yíng)養(yǎng)，導(dǎo)致葡萄糖（Glu）不足，使得奶牛脂肪動(dòng)員以維持能量消耗，易發(fā)生能量負(fù)平衡（NEB）。NEB 奶牛更易發(fā)生代謝病和繁殖障礙，嚴(yán)重影響卵巢功能[19]。β-羥丁酸（BHBA）是肝臟在不完全脂肪酸氧化過(guò)程中產(chǎn)生的三種主要酮類(lèi)之一，奶牛血漿葡萄糖和血清BHBA 可以作為產(chǎn)后排卵和妊娠狀態(tài)的預(yù)測(cè)指標(biāo)[20]。試驗(yàn)中N 組血漿Glu 濃度顯著的低于P 組，說(shuō)明輸精前Glu 含量會(huì)影響奶牛的妊娠率，與Hill S L 等人實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。較低濃度的血清BHBA 會(huì)使奶牛有更好的繁殖性能，P 組奶牛的血漿BHBA 含量極顯著低于N 組，也證實(shí)了這一點(diǎn)。由此可見(jiàn)血漿中較低的Glu 含量和較高的BHBA 含量會(huì)影響奶牛繁殖性能。

研究發(fā)現(xiàn)脂肪肝會(huì)降低奶牛優(yōu)勢(shì)卵泡的成熟率，造成卵泡生長(zhǎng)發(fā)育延遲[21]。在奶牛產(chǎn)后7～14 d 期間血漿中甘油三酯（TG）的濃度會(huì)增加，這時(shí)如果不合理調(diào)整體況會(huì)導(dǎo)致脂肪肝發(fā)生，導(dǎo)致奶牛進(jìn)入NEB 狀態(tài)影響繁殖[22]。并且TG、AST 已經(jīng)可以作為脂肪肝檢測(cè)指標(biāo)[23]。在試驗(yàn)中N 組血漿TG 含量極顯著的高于P 組，血漿AST 含量顯著的高于P 組，并且N組部分奶牛有患脂肪肝的風(fēng)險(xiǎn)。分析認(rèn)為產(chǎn)后奶牛血漿中TG、AST 含量會(huì)對(duì)于奶牛的妊娠產(chǎn)生影響。后續(xù)還需大量樣本進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，一旦得到證實(shí)和完善，將對(duì)提高集約化牛場(chǎng)奶牛繁殖效率具有重要意義。

4 結(jié)論

試驗(yàn)中，血漿E2、Glu、Se 對(duì)PO 程序奶牛輸精21 d后妊檢陰性具有預(yù)警意義。當(dāng)奶牛實(shí)施同期發(fā)情PO程序前血漿中E2＜46.49 pmol·L-1、Glu＜3.59 mmol·L-1、Se＜0.58 μg·L-1時(shí)，奶牛在情期內(nèi)輸精21 d 后妊檢成陰性的風(fēng)險(xiǎn)加大。