宋樂樂 紀萌 王鈞平 唐昊 吳金生

【摘要】 目的：探討微小染色體維持蛋白6（MCM6）在腎透明細胞癌（ccRCC）早期診斷及預(yù)后判斷中的意義。方法：應(yīng)用TCGA數(shù)據(jù)庫中533例ccRCC患者的RNA測序（RNAseq）數(shù)據(jù)，從RNA水平初步分析MCM6的mRNA表達與ccRCC早期診斷及預(yù)后的關(guān)系。應(yīng)用免疫組化（IHC）實驗方法從蛋白質(zhì)層面分析MCM6蛋白在373例ccRCC患者的表達與ccRCC早期診斷與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果：分析TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，ccRCC患者的MCM6高表達與腫瘤進展和生存率低均有關(guān)（P<0.001）。對373例ccRCC組織的免疫組化分析表明MCM6蛋白在ccRCC的癌旁正常組織中幾乎不表達，而在ccRCC的腫瘤細胞中明顯表達。Kaplan-Meier生存分析顯示MCM6蛋白是ccRCC患者生存的不利因素，高表達MCM6的ccRCC患者預(yù)后差（P<0.001）。Cox回歸分析結(jié)果顯示，MCM6是ccRCC的獨立預(yù)測因子（P<0.001）。MCM6受試者工作特征曲線下面積（AUC）值為0.604（P=0.001）。結(jié)論：MCM6是ccRCC患者生存的不利因素，MCM6是一種潛在的ccRCC早期診斷及判斷預(yù)后的新型標志物。

【關(guān)鍵詞】 腎透明細胞癌 MCM6 早期診斷 預(yù)后

[Abstract] Objective： To investigate the significance of microchromosome maintenance protein 6 （MCM6） in early diagnosis and prognosis of clear cell renal cell carcinoma （ccRCC）. Method： Using the RNA sequencing （RNAseq） data of 533 ccRCC patients in the TCGA database， the relationship between the mRNA expression of MCM6 and the early diagnosis and prognosis of ccRCC from the RNA level was analyzed. Then immunohistochemical （IHC） method was used to analyze the relationship between the expression of MCM6 protein and the early diagnosis and prognosis of ccRCC in 373 patients with ccRCC. Result： Analysis of the TCGA database showed that the high expression of MCM6 in patients with ccRCC was associated with low tumor progression and low survival rate （P<0.001）. The immunohistochemical analysis of 373 cases of ccRCC tissues proved that MCM6 protein was almost not expressed in the adjacent normal tissues of ccRCC， but was expressed in tumor cells of ccRCC. Kaplan-Meier survival analysis showed that MCM6 protein was an unfavorable factor for the survival of ccRCC patients， and the prognosis of ccRCC patients with high expression of MCM6 was poor （P<0.001）. Cox regression analysis showed that MCM6 was an independent predictor of ccRCC （P<0.001）. The area under receiver operating characteristic curve （AUC） of MCM6 was 0.604 （P=0.001）. Conclusion： MCM6 is an unfavorable factor for the survival of patients with ccRCC， MCM6 is a potential marker for early diagnosis and prognosis of ccRCC.

[Key words] ccRCC MCM6 Early diagnosis Prognosis

First-authors address： Affiliated Hospital of Weifang Medical University， Weifang 261000， China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2021.09.006

腎細胞癌（renal cell carcinoma，RCC）標準化年齡發(fā)病率排在全球第16位，死亡率在第17位，男女發(fā)病比例約為1.7︰1[1]，且近年來發(fā)病率和死亡率均呈上漲趨勢[2]。腎透明細胞癌（ccRCC）是臨床中最常見的腎癌類型，大約占腎癌比例的75%[3]。ccRCC起源于腎單位的近曲小管，其特征是細胞質(zhì)透明的惡性上皮細胞[4]。在大部分慢性腎細胞癌中，Von Hippel-Lindau（VHL）基因丟失與缺氧信號的失調(diào)導致了多種基因激活[5]。其中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）及其受體和雷帕霉素靶蛋白（mTOR）仍然是系統(tǒng)治療的主要靶點[6]。針對VEGF或mTOR信號轉(zhuǎn)導的治療藥物，如索拉非尼、替西羅莫司、依維莫司、卡波替尼和樂伐替尼等先后成功開發(fā)并用于臨床[7]。然而，這些藥物僅能部分改善慢性腎細胞癌的預(yù)后，對晚期腎細胞癌的療效仍然有限[8]。然而，在臨床實踐中幾乎沒有ccRCC的預(yù)后標記物[9]。因此，為了更好地治療這種疾病，需要積極尋找新的預(yù)后標記物和指導個體化治療的新靶點，以便使患者獲得早期治療和更精確的進一步治療，從而延長生存期。

微小染色體維持基因（MCM）在DNA復制中起重要作用，包括六個高度相關(guān)的同源亞基（MCM2-7），構(gòu)成了真核生物DNA復制解旋酶的催化核心[10]。研究表明，MCM基因在各種癌癥中發(fā)揮重要作用，尤其是在癌癥診斷和預(yù)后預(yù)測方面[11]。多項研究表明，MCM6在多種惡性腫瘤中表達增強，且與患者的診斷和預(yù)后密切相關(guān)，如乳腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤等[12-14]。本研究主要檢測了MCM6在ccRCC組織中的表達情況以及分析了MCM6在ccRCC中的早期診斷意義和預(yù)后意義，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料及標本來源 從RNA和蛋白質(zhì)兩個方面綜合分析MCM6在ccRCC中的表達意義。RNA水平的研究，從TCGA數(shù)據(jù)庫獲取了533例ccRCC患者的RNAseq數(shù)據(jù);蛋白質(zhì)水平的研究，選取373例ccRCC患者的免疫組化實驗。標本來源：隨機選取2008-2018年中國醫(yī)學科學院北京腫瘤醫(yī)院收治的術(shù)后病理結(jié)果證實為ccRCC的手術(shù)標本373例。標本包括腫瘤組織和癌旁正常腎組織，并以癌旁正常腎組織為對照。本研究腎癌臨床分期采用了2010年AJCC第七版標準，其中為方便研究，Ⅰ期和Ⅱ期歸為低分期，Ⅲ期和Ⅳ期歸為高分期。采用1992年Fuhrman核分級的標準，對其進行組織學分級，其中為方便研究，G1和G2歸為低級別，G3和G4歸類為高級別。

1.2 主要試劑與儀器 MCM6兔抗人多克隆抗體（13347-2-AP）購自美國Proteintech公司，通用二步法檢測試劑盒（PV9000）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，顯微鏡DM2000購自德國萊卡公司。

1.3 組織芯片的構(gòu)建和IHC實驗

1.3.1 組織芯片的構(gòu)建 首先根據(jù)標本數(shù)量設(shè)計合適的芯片微陣列，對組織標本進行固定、包埋等制作供體蠟塊。供體蠟塊切片做HE染色，根據(jù)HE染色標記供體蠟塊。在供體蠟塊上標記處打孔采集組織芯（每個病例包含3個癌組織芯和2個癌旁正常腎組織芯作為對照），將組織芯填充到受體模塊，經(jīng)壓實、包埋固定制成組織芯片模塊。對組織芯片模塊進行連續(xù)性切片，再將切片轉(zhuǎn)移到防脫載玻片上制成組織芯片，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 IHC實驗步驟 采用通用二步法免疫組化檢測方法。組織芯片經(jīng)組織固定、脫蠟、水化、PBS浸洗后置入95 ℃的枸櫞酸鈉緩沖液（pH值6.0）中，微波加熱進行抗原修復。PBS浸洗后滴加PV-9000試劑1（內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑），室溫孵育10 min進行滅活。PBS浸洗后滴加一抗（MCM6兔抗人多克隆抗體1︰100稀釋），對照組僅滴加等量抗體稀釋液，然后4 ℃過夜孵育。PBS浸洗芯片后滴加PV-9000試劑2（反應(yīng)增強液）室溫孵育20 min，PBS浸洗后滴加試劑3（增強酶標山羊抗小鼠/兔IgG聚合物）即二抗室溫孵育20 min，然后經(jīng)洗滌、DAB顯色、蘇木精復染、脫水、透明、封片。

1.4 IHC染色結(jié)果判定 由三名有資質(zhì)的病理醫(yī)生分別進行閱片，閱片人員對組織芯片排列順序及患者詳細信息并不知情，評分有差異的再由三人以少數(shù)服從多數(shù)原則共同判定。評定標準：IHC染色分數(shù)是通過將染色面積分數(shù)（0=無細胞陽性，1=1%～25%，2=26%～50%和3=51%～100%）乘以染色強度分數(shù)（0=無染色，1=弱染色，2=中度染色和3=強染色）。根據(jù)組織芯片的染色評分結(jié)果，將ccRCC病例分為MCM6低表達組：MCM6低/無表達（≤6分）和MCM6低表達組：MCM6高表達（>6分）。

1.5 隨訪 隨訪信息包含患者門診隨訪及電話隨訪，起止時間2008年3月-2019年12月，中位隨訪時間40個月，死亡70例，生存303例。

1.6 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用Medcalc軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料采用字2檢驗;應(yīng)用Kaplan-Meier法繪制生存曲線、對數(shù)秩檢驗（Log-rank test）進行生存曲線比較;采用單因素和多因素Cox回歸分析來評估MCM6蛋白與ccRCC臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系;通過繪制受試者工作特征曲線（ROC）及曲線下面積（AUC）來評價MCM6表達對ccRCC早期診斷的價值。檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 MCM6 RNAseq數(shù)據(jù)分析 首先分析了TCGA數(shù)據(jù)庫（http：//cancergenome.nih.gov）中公布的533例ccRCC患者MCM6的RNAseq數(shù)據(jù)，應(yīng)用Medcalc軟件繪制ROC曲線，并獲取最佳截斷值對MCM6的RNAseq數(shù)據(jù)進行分組，將其分為MCM6高表達組175例（32.83%）和MCM6低表達組358例（67.17%）。應(yīng)用Kaplan-Meier生存曲線從RNA水平分析MCM6的表達與ccRCC患者生存和預(yù)后的影響，MCM6為ccRCC患者預(yù)后的不利因素，高表達MCM6的患者生存率低（P<0.001），見圖1。

2.2 MCM6表達與臨床病理特征的關(guān)系 MCM6低表達組性別、年齡與MCM6高表達組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;MCM6低表達組臨床分期、組織學分級及術(shù)后復發(fā)進展情況與MCM6高表達組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。見表1。

2.3 MCM6蛋白的表達 MCM6蛋白在ccRCC組織中的陽性表達并且主要表現(xiàn)在細胞核中，而在細胞質(zhì)極少表達。在正常組織中近曲小管幾乎沒有陽性表達，遠曲小管有少量表達，由于遠曲小管不屬于ccRCC來源細胞，故可忽略不計。對照組結(jié)果均為陰性。經(jīng)統(tǒng)計，373例ccRCC組織的免疫組化實驗中MCM6蛋白的陽性率及高表達率分別為60.1%（224/373）和30.3%（113/373），見圖2。

2.4 生存分析

2.4.1 MCM6蛋白表達對患者預(yù)后的影響 采用Medcalc軟件將MCM6蛋白在ccRCC中的表達繪制生存曲線，觀察MCM6對ccRCC患者生存的影響，結(jié)果表明：MCM6蛋白的過表達是ccRCC患者生存的不利因素（P<0.001）。這里的結(jié)果與TCGA數(shù)據(jù)庫中MCM6 RNAseq數(shù)據(jù)結(jié)果一致。見圖3。

2.4.2 單因素Cox回歸分析 采用單因素Cox比例風險模型分析MCM6蛋白的表達與各項臨床、病理參數(shù)對ccRCC患者的生存影響，結(jié)果顯示：較大腫瘤（直徑>4 cm）、發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移、高級別TNM臨床分期（Ⅲ期和Ⅳ期）、高級別組織學分級（G3期和G4期）以及MCM6蛋白高表達等因素均是ccRCC患者的生存的危險性因素。見表2。

2.4.3 多因素Cox回歸分析 排除無關(guān)變量和無意義變量，將對患者預(yù)后有意義的單變量納入多因素分析。多因素分析結(jié)果顯示，高級別臨床分期、高級別組織學分級和MCM6蛋白高表達均是ccRCC患者預(yù)后的獨立危險因素，見表3。

2.5 MCM6蛋白表達對ccRCC的診斷意義 對373例

ccRCC患者的MCM6蛋白表達IHC結(jié)果進行二分類，陽性：高表達組113例（30.3%），陰性：低/無表達組260例（69.7%），采用Medcalc軟件繪制ROC曲線，對應(yīng)的曲線下面積AUC值為0.604（P=0.001），95%置信區(qū)間為（0.552，0.654），敏感度和特異度分別為47.14、73.60。AUC值大于0.5，說明MCM6蛋白表達對腎透明細胞癌患者具有潛在的診斷價值。見圖4。

3 討論

研究表明在MCM2-7復合物中，六個亞基具有相互作用并緊密相關(guān)。在各種癌癥的預(yù)后中也發(fā)現(xiàn)了MCM家族的相互關(guān)系。作為肝細胞癌預(yù)后預(yù)測的指標，MCM2-7、MCM8和MCM10彼此顯著相關(guān)[15]。生存分析和聯(lián)合效應(yīng)分析表明，Ki-67、MCM3和MCM7是鑒別良性和惡性腎上腺皮質(zhì)腫瘤的可靠增殖和診斷指標[16]。兩種或兩種以上上調(diào)的MCM的組合表明在腎細胞癌中有較短的無病生存時間[17]。眾多研究表明，MCM成員積極參與生理和腫瘤過程。調(diào)控失調(diào)的MCMs被認為是通過破壞基因組穩(wěn)定性和促進細胞周期進程來驅(qū)動癌癥的，這兩種因素都會顯著促進細胞的異常增殖，從而增加癌癥的風險[18]。因此，異常表達的MCMs可能成為早期診斷、預(yù)后甚至預(yù)測療效的敏感腫瘤生物標志物。然而，仍有幾個重要問題需要解決，首先對MCM在惡性腫瘤中的調(diào)控機制還缺乏深入的研究，如MCM成員在癌癥中的上游調(diào)控因子是什么，它們?nèi)绾瓮ㄟ^轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后機制調(diào)節(jié)MCM成員的表達？另外，目前還沒有能直接靶向MCM蛋白的有效藥物用于臨床。但是，隨著對MCMs的深入研究，可以期待未來將開發(fā)出有前途的抗癌策略，并為腫瘤患者提供益處。

在本研究中，筆者研究了MCM6在腫瘤組織中的定位和腫瘤進展中的意義，發(fā)現(xiàn)正常腎組織內(nèi)幾乎無MCM6蛋白表達，而在腎癌組織中明顯高表達。MCM6在ccRCC組織中的表達與性別、年齡無關(guān)，而與臨床分期、組織學分級以及是否復發(fā)和進展明顯相關(guān)。本研究證實在mRNA水平的533例ccRCC臨床樣品中和在蛋白質(zhì)水平的373例ccRCC組織中MCM6的上調(diào)并驗證了其與ccRCC患者的不良預(yù)后相關(guān)。本研究還證實MCM6對ccRCC具有一定的早期診斷意義。但是，本研究仍然存在一些不足：僅研究了RCC中最常見的類型，乳頭狀細胞癌、嫌色細胞癌等其他少見類型未納入研究;未統(tǒng)籌分析MCM2-7中的其他基因/蛋白與ccRCC的關(guān)系;由于目前隨訪時間的限制，未能獲得MCM6對ccRCC的更遠期的影響;MCM6與目前報道過的標志物之間有無相互關(guān)系以及有無協(xié)同作用等有待進一步研究。

綜上所述，MCM6的高表達對ccRCC患者生存是一個不友好的指標，MCM6是一種潛在的ccRCC患者預(yù)后不良的標志物，且對ccRCC具有一定的早期診斷價值。

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（收稿日期：2021-01-15） （本文編輯：程旭然）