尹孝莉，周思敏，吳方雨，魏晴，王雷，2，3，4，5，陳衛(wèi)東，2，3，4，5*（.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，合肥 23002；2.中藥復(fù)方安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 23002；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，合肥 23002；4.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 23002；5.現(xiàn)代藥物制劑安徽省工程技術(shù)研究中心，合肥 23002）

癌癥是當(dāng)今世界的一個(gè)主要公共健康問(wèn)題，許多化學(xué)藥物均可引起不同的不良反應(yīng)[1-2]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，傳統(tǒng)中藥在各種癌癥的治療中已引起廣泛關(guān)注[3-6]。新藤黃酸（gambogenic acid，GNA，C38H47O8，結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1）是從傳統(tǒng)中藥藤黃中分離得到的生物活性成分，具有多種抗腫瘤活性[7]，例如肝癌（HepG2）[8]、肺腺癌[9]、人鼻咽癌[10]、多發(fā)性骨髓瘤[11]、脈絡(luò)膜黑色素瘤[12]等，還可能是逆轉(zhuǎn)P-糖蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥性的潛在抑制劑[13]，因此有望成為一種新型的抗腫瘤結(jié)構(gòu)藥物。但是GNA 水溶性差、血管刺激較大，限制了它的臨床應(yīng)用[14]，亟需適當(dāng)?shù)闹苿┮愿纳艷NA 的缺陷。

圖1 GNA 的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig 1 Chemical structure of GNA

目前，關(guān)于GNA 的研究主要集中于注射劑。如Huang 等[15]采用高溫乳化-低溫固化的方法成功研制了注射劑GNA 固體脂質(zhì)納米粒；Yuan 等[16]采用反溶劑沉淀法制備了以PVPK30 和PEG2000為穩(wěn)定劑的注射型GNA 納米懸浮液（GNA-NS）；Luo 等[17]制備了注射劑GNA 脂質(zhì)立方液晶納米粒；Lin 等[14，18]制備了注射型長(zhǎng)循環(huán)納米脂質(zhì)載體及PEG 化非離子表面活性劑等納米載體來(lái)包裹GNA；Liu 等[19]制備了負(fù)載GNA 的注射型pH 響應(yīng)聚合物膠束（PMS）。雖然靜脈內(nèi)給藥具有許多優(yōu)點(diǎn)，但是鑒于口服給藥便利、可減少并發(fā)癥，尤其是能有效地解決血管刺激性問(wèn)題，而靜脈注射的成本高，因此，本文旨在制備出一種優(yōu)良的口服制劑來(lái)解決GNA 現(xiàn)存的不足。

納米乳是由水、油、表面活性劑和助表面活性劑等自發(fā)形成，粒徑為10 ～100 nm，熱力學(xué)穩(wěn)定、各向同性的透明或半透明的均相分散體系[20]。納米乳一般被用作載體來(lái)增加難溶性藥物的溶解度、提高藥物的穩(wěn)定性及生物利用度。在蒿甲醚納米乳的制備中，納米乳顯著提高了蒿甲醚在水中的溶解度，且粒徑小，穩(wěn)定性好，體內(nèi)口服生物利用度比普通藥物高2.6 倍[21]。納米乳還能減少藥物的不良反應(yīng)，起到緩釋效應(yīng)和增強(qiáng)藥物的被動(dòng)靶向性的作用。如將氨苯砜制成納米乳后，不僅改善了溶解度，減少了藥物的必要?jiǎng)┝亢筒涣挤磻?yīng)，還提高了藥物生物利用度和穩(wěn)定性[22]。隨著納米劑型的快速發(fā)展，國(guó)內(nèi)外關(guān)于納米乳的研究越來(lái)越多，通過(guò)納米乳來(lái)改善藥物缺陷的報(bào)道也越來(lái)越多，如吡羅昔康[23]、阿伐那非[24]、燈盞花素[25]等；另外，納米乳還被用來(lái)增加疫苗的免疫作用[26]。眾多研究表明，納米乳在改善藥物自身缺陷和提高藥效方面具有廣泛的應(yīng)用前景，并可以通過(guò)各種途徑如口服、透皮和靜脈注射等遞送藥物，尤其是口服制劑，在其中占據(jù)了較大的比例[27-28]。因此，將GNA 制成納米乳口服給藥將是一個(gè)優(yōu)良的選擇。

本研究主要基于GNA 的局限性設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了新藤黃酸納米乳（GNE）：首先通過(guò)溶解度實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)GNA 溶解度最大的賦形劑，并利用偽三元相圖和單因素的考察優(yōu)化納米乳的配方；然后通過(guò)外觀、類(lèi)型、粒徑、多分散系數(shù)、透射電鏡、稀釋穩(wěn)定性和放置穩(wěn)定性等方法系統(tǒng)地表征GNE；最后通過(guò)體外藥效學(xué)來(lái)證明納米乳增加了GNA 的藥效。

1 材料

1.1 儀器

島津LC-20AXR 高效液相色譜儀（日本島津公司）；AB135-S 型十萬(wàn)分之一電子分析天平（德國(guó)Mettler Toledo 公司）；DF-101B 集熱式恒溫磁力攪拌器（金壇市鑫鑫實(shí)驗(yàn)儀器廠）；LC-4016 低速離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；TG16-WS 高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；Zetasizer3000HS 型激光粒度儀（英國(guó)Malvern 公司）；Hitachi-HT7700 透射電鏡（上海滬西分析儀器廠有限公司）；KQ-300B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；DZF-6050 型真空干燥箱（上海傅訊實(shí)業(yè)有限公司）；ESCO 二氧化碳培養(yǎng)箱（新加坡Esco 公司）；YM50B 型高壓蒸汽滅菌鍋（上海三申醫(yī)療器械有限公司）；酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技公司）；注射泵（上海藍(lán)德醫(yī)療器械有限公司）；Cascada 超純水儀（美國(guó)PALL 公司）。

1.2 試藥

新藤黃酸（GNA）對(duì)照品（純度≥ 98%，安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 GNA 課題組提供）；亞麻籽油、橄欖油、油酸乙酯、中碳鏈三酰甘油（MCT）（上海源葉生物科技有限公司）；肉豆蔻酸異丙酯（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；蛋黃卵磷脂（上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司）；聚氧乙烯氫化蓖麻油（RH40，江蘇省海安石油化工廠）；泊洛沙姆188（F68，德國(guó)BASF 公司）；吐溫80、甘油、聚乙二醇400（PEG400）（上海潤(rùn)捷化學(xué)試劑有限公司）；1，2-丙二醇（上海蘇懿化學(xué)試劑有限公司）；異丙醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；蘇丹紅（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；三水合亞甲藍(lán)（西隴科學(xué)股份有限公司）；RPMI 1640 培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Hyclone 公司）；胰酶細(xì)胞消化液（Biosharp 公司）；四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，美國(guó)Sigma 公司）；青霉素-鏈霉素溶液（碧云天生物技術(shù)）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

1.3 細(xì)胞

乳腺癌4T1 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞所（傳代4 次）。

2 方法與結(jié)果

2.1 GNE 的制備

2.1.1 油相和助表面活性劑的確定 各取1 mL的油相和助表面活性劑于離心管中，加入過(guò)量的GNA，室溫振蕩48 h，15 000 r·min－1離心5 min后取上清液，甲醇稀釋適宜的倍數(shù)后，用0.22 μm的微孔濾膜過(guò)濾，采用HPLC 在360 nm 測(cè)定GNA的含量。計(jì)算GNA 在不同油相、助表面活性劑中的溶解度，其結(jié)果見(jiàn)圖2A。GNA 分別在油相MCT和助表面活性劑PEG400 中GNA 的溶解度最高，因此選擇MCT 為油相，PEG400 為助表面活性劑。

2.1.2 表面活性劑的確定 各取50 mg 的表面活性劑于離心管中，加水稀釋成10.83 mg·mL－1的膠束溶液，加入過(guò)量的GNA，室溫振蕩48 h，15 000 r·min－1離心5 min 后取上清液，甲醇稀釋適宜的倍數(shù)后，用0.22 μm 的微孔濾膜過(guò)濾，采用HPLC 在360 nm 測(cè)定GNA 的含量。計(jì)算GNA在不同表面活性劑中的溶解度，其結(jié)果見(jiàn)圖2B。結(jié)果顯示，GNA 在表面活性劑RH40 中的溶解度最高，因此選用RH40 為納米乳的表面活性劑。

圖2 GNA 在不同油相（A）、助表面活性劑（A）和表面活性劑（B）中的溶解度Fig 2 Solubility of GNA in oil phases（A），co-surfactants（A）and surfactants（B）

2.1.3Km的確定 由圖2可知，以溶解度最大的MCT、RH40 和PEG400 分別作為油相、表面活性劑和助表面活性劑。采用偽三元相圖的方法，在室溫條件下，將表面活性劑與助表面活性劑按不同質(zhì)量比（1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1）振蕩搖勻后，再將混合表面活性劑與MCT 按不同質(zhì)量比（1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1）振蕩混勻，滴入水相。以混合表面活性劑、油相和水分別為一條邊，記錄體系從渾濁到澄清時(shí)所用水相的體積，計(jì)算各組分的質(zhì)量百分?jǐn)?shù)，用Origin 軟件繪制偽三元相圖[29]（Km為表面活性劑與助表面活性劑質(zhì)量比，陰影面積為乳化區(qū)域），其結(jié)果如圖3。

圖3 MCT/RH40/PEG400/水納米乳偽三元相圖Fig 3 Pseudo ternary phase diagram of MCT，RH40，PEG400 and water with different Km

當(dāng)Km＝1/2、Km＝1、Km＝3 時(shí)無(wú)法形成偽三元相圖，在Km值為2 時(shí)，納米乳區(qū)域面積最大，因此選擇Km值為2。同時(shí)為增加GNA 的載藥量，減少表面活性劑的用量，選擇陰影區(qū)域中油相和表面活性劑比為3∶7 的點(diǎn)作為后續(xù)納米乳的處方（油相最多，載藥最多，混合表面活性劑最?。患纯瞻准{米乳的最優(yōu)處方為：MCT/RH40/PEG400/水（0.3∶0.47∶0.23∶1.0）。為 便于后續(xù)單因素實(shí)驗(yàn)的考察，精密稱(chēng)取MCT 0.9 g、RH40 1.4 g、PEG400 0.7 g 和水3 g 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 轉(zhuǎn)速的確定 固定其他因素不變，考察攪拌速度對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響。結(jié)果見(jiàn)表1，可以看出，轉(zhuǎn)速的大小對(duì)于納米乳的外觀無(wú)明顯的影響，但粒徑和多分散系數(shù)（PDI）均隨著攪拌速度的增加，先減小后增大。其中，當(dāng)轉(zhuǎn)速在400 r·min－1時(shí)粒徑和PDI 均最小，故選擇攪拌速度為400 r·min－1。

表1 攪拌速度對(duì)空白納米乳外觀、粒徑和PDI 的影響Tab 1 Influence of stirring velocity on appearance，size and PDI of blank nanoemulsion

2.1.5 滴加速度的確定 固定其他因素不變，通過(guò)注射泵控制滴加速度，考察滴加速度對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響。結(jié)果見(jiàn)表2，可以看出，滴加速度對(duì)于納米乳的外觀無(wú)明顯的影響，但粒徑和PDI 均在滴加速度為0.3 mL·min－1和0.7 mL·min－1時(shí)較優(yōu)。從節(jié)省時(shí)間成本上的考慮，選擇滴加速度為0.7 mL·min－1。

表2 滴加速度對(duì)空白納米乳外觀、粒徑和PDI 的影響Tab 2 Influence of drop acceleration on appearance，size and PDI of blank nanoemulsion

2.1.6 溫度的確定 固定其他因素不變，考察溫度對(duì)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響。結(jié)果見(jiàn)表3，可以看出，溫度對(duì)于納米乳的外觀無(wú)明顯的影響，但對(duì)粒徑和PDI 均有較大的影響，其中在50 ℃時(shí)粒徑最小，在40 ℃時(shí)PDI 最小，兩者相差不大，從節(jié)約能源的角度考慮，選擇溫度為40℃。

表3 溫度對(duì)空白納米乳外觀、粒徑和PDI 的影響Tab 3 Influence of temperature on appearance，size and PDI of blank nanoemulsion

2.1.7 GNE 的制備 精密稱(chēng)取MCT 0.9 g、RH40 1.4 g、PEG400 0.7 g 于錐形瓶中，在40℃下用磁力攪拌器以400 r·min－1的轉(zhuǎn)速攪拌混勻，然后用注射泵以0.7 mL·min－1的滴加速度緩慢滴加3 g 水于混合體系中，攪拌至澄清透明即得空白納米乳。最后多次少量地將36 mg GNA 粉末加入空白納米乳中[30-31]，直至攪拌完全溶解，即得6 mg·mL－1的淡黃色澄清透明納米乳制劑。

2.2 GNA 分析方法的建立

2.2.1 GNA 對(duì)照品溶液的配制 精密稱(chēng)取GNA對(duì)照品4.99 mg 于10 mL 量瓶中，甲醇溶解定容，再精密吸取0.1 mL 并用甲醇稀釋為4.99 μg·mL－1，渦旋混合即得GNA 對(duì)照品溶液，置于4℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 GNA 供試品溶液的配制 吸取一定體積的GNE 于10 mL 量瓶中，加入適量甲醇渦旋，超聲使其完全破乳，再加入甲醇定容至刻度線即得GNE 破乳溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2.3 空白納米乳的配制 吸取等量的空白納米乳于10 mL 量瓶中，加入適量甲醇渦旋，超聲使其完全破乳，再加入甲醇定容至刻度線即得空白納米乳破乳溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

2.2.4 色譜條件 采用COSMOSIL C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為甲醇-0.1%磷酸水溶液（90∶10，V/V），流速為1.0 mL·min－1，檢測(cè)波長(zhǎng)為360 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μL。

2.2.5 方法學(xué)驗(yàn)證 對(duì)所建立的 HPLC 方法進(jìn)行方法學(xué)考察，結(jié)果見(jiàn)圖4。可以看出輔料對(duì)GNA 的含量測(cè)定無(wú)干擾，表明此方法的專(zhuān)屬性好。其線性關(guān)系、日內(nèi)精密度、日間精密度、回收率、重復(fù)性及穩(wěn)定性均符合體外分析的要求（RSD值均小于5%）。

圖4 GNA 的HPLC 色譜圖Fig 4 HPLC chromatogram of GNA

2.3 包封率和載藥量的測(cè)量

結(jié)合課題組的前期研究，選擇微柱離心法作為測(cè)量GNA 的主要方法。精密吸取稀釋后的GNE 100 μL 于葡聚糖凝膠柱頂端中央，3000 r·min－1離心3 min 后，在頂端加入100 μL 的超純水，連續(xù)洗脫5 次，收集并合并濾液，加甲醇定容至2 mL，按“2.2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定GNA 含量，計(jì)算GNA 的包封量（W包封）。另取GNE 100 μL，直接用甲醇定容至2 mL，按“2.2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定GNA 含量，計(jì)算GNA 的量（W總）。包封率（EE%）和實(shí)際載藥量（DL%）的計(jì)算公式如下：

其中，W包封是被包裹在納米乳里的GNA 質(zhì)量，W總是投的GNA 總量，W載體是除水后納米乳空白載體的質(zhì)量。根據(jù)計(jì)算公式，可得出GNE的包封率為93.50%，實(shí)際載藥量為1.11%。

2.4 GNE 的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.4.1 納米乳外觀考察 由圖5可知，所制備的空白納米乳是外觀帶有淡藍(lán)色乳光的澄清透明的液體，沒(méi)有沉淀或絮凝，而GNE 則呈現(xiàn)黃色。

圖5 空白納米乳（左）和GNE（右）的外觀Fig 5 Outward appearances of the blank nanoemulsiom （left）and GNE（right）

2.4.2 鑒別實(shí)驗(yàn) 各取兩份GNE 1 mL 于進(jìn)樣小瓶中，分別滴加蘇丹紅（紅色油性染料）和亞甲基藍(lán)（藍(lán)色水性染料）1 滴，結(jié)果觀察到藍(lán)色的擴(kuò)散速度快于紅色，如圖6，表明所制備的GNE 為水包油型。

圖6 納米乳的鑒別實(shí)驗(yàn)（左-蘇丹紅；右-亞甲基藍(lán)）Fig 6 Identification experiment of GNE （left-Sudan red；rightmethylene blue）

2.4.3 形態(tài)學(xué)考察 將銅網(wǎng)置于干凈的載玻片上，滴加10 μL 稀釋適量倍數(shù)的GNE 靜置揮干，然后用2%的磷鎢酸染色2 min，用濾紙吸去多余的染液，置透射電鏡下觀察，如圖7。結(jié)果顯示GNE 外觀呈類(lèi)球型，大小均勻，表面光滑圓整，粒子間無(wú)粘連。

圖7 GNE 透射電鏡圖Fig 7 Transmission electron microscope of GNE

2.4.4 粒徑分布與Zeta 電位 取GNE 1 mL，用外相水稀釋至50 mL，用激光粒度分析儀分別測(cè)定其粒徑和Zeta 電位，結(jié)果顯示GNE 的平均粒徑為（45.28±0.32）nm，多分散指數(shù)（PDI）為（0.137±0.01）；Zeta 電位為（－10.5±0.52）mV。由此可知，制備的GNE 粒徑分布窄，大小均勻，符合納米制劑的要求（見(jiàn)圖8）。

圖8 GNE 的粒徑分布圖（A）及Zeta 電位圖（B）Fig 8 Particle size distribution（A）and Zeta potential（B）of the GNE

2.4.5 稀釋穩(wěn)定性 取等量的GNE 用水稀釋至不同的倍數(shù)（20、100、400、800 倍），觀察GNE的外觀，測(cè)定其平均粒徑、PDI。結(jié)果顯示，納米乳外觀保持穩(wěn)定，呈淡黃色，無(wú)絮凝、沉淀和分層等現(xiàn)象，粒徑和PDI 均稍微增大，但都在允許范圍內(nèi)（粒徑 ＜200 nm，PDI ＜0.3），具有較好的稀釋穩(wěn)定性，見(jiàn)圖9。

圖9 GNE 的稀釋穩(wěn)定性Fig 9 Dilution stability of GNE

2.4.6 放置穩(wěn)定性 將GNE 分別放置于4℃及25℃條件下，分別于0、7、14、21 和28 d 時(shí)取出，觀察GNE 的外觀，測(cè)定其平均粒徑、PDI、包封率，初步評(píng)價(jià)GNE 的放置穩(wěn)定性。結(jié)果表明在4℃下，GNE 一直呈淡黃色透明液體，4 周內(nèi)的平均粒徑略有增加趨勢(shì)，PDI 變化不明顯，包封率稍有下降；但在25℃下納米乳第3 周就變得稍微渾濁，平均粒徑、PDI 和包封率均有較大的變化（見(jiàn)圖10）。說(shuō)明溫度會(huì)對(duì)納米乳的放置穩(wěn)定性產(chǎn)生一定的影響，GNE 在4℃環(huán)境中放置4 周是相對(duì)穩(wěn)定的。

圖10 GNE 在4 和 25 ℃環(huán)境中的放置穩(wěn)定性（A.粒徑；B.多分散系數(shù)；C.包封率）Fig 10 Storage stability of GNE at 4 and 25℃ for 4 weeks（A.size；B.PDI；C.Encapsulation efficiency）

2.5 GNE 的體外抗腫瘤活性

2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將4T1 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清，1%青霉素-鏈霉素溶液的RPMI 1640培養(yǎng)基，并放在37℃，5%CO2的恒溫、恒濕的無(wú)菌培養(yǎng)箱中，定期更換培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部90%時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

2.5.2 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn) 選擇MTT 法研究細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞以1×105個(gè)/孔的密度接種在96 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，加入不同濃度的游離GNA，空白納米乳和GNE 到細(xì)胞中溫育24 h，并向每個(gè)孔中加入20 μL MTT 溶液（5.0 mg·mL－1），溫育4 h，除去培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，搖晃10 min。用酶標(biāo)儀在490 nm 處測(cè)定各孔光密度（OD）值，記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，計(jì)算細(xì)胞存活率，細(xì)胞存活率（%）＝OD給藥/OD空白×100%其中，OD給藥、OD空白分別代表給藥組和空白對(duì)照組的OD值，根據(jù)上式計(jì)算出各濃度所對(duì)應(yīng)的細(xì)胞存活率的柱狀圖，并采用GraphPad prism 5 擬合計(jì)算半數(shù)抑制濃度（IC50），見(jiàn)圖11。

圖11 GNA 和GNE 對(duì)4T1 細(xì)胞的存活率的影響（ ±s，n ＝3）Fig 11 Effect of GNA and GNE on the cell viability of 4T1 cells（ ±s，n ＝3）

MTT 結(jié)果顯示，GNA 以及GNE 對(duì)4T1 細(xì)胞均有明顯的抑制作用，且隨著濃度的升高，抑制程度增強(qiáng)。空白納米乳在8.0 μmol·L－1（即5048 μg·mL－1）時(shí)對(duì)細(xì)胞有微弱的毒性，但細(xì)胞存活率達(dá)到80%，根據(jù)部分文獻(xiàn)報(bào)道，可認(rèn)為該載體是安全無(wú)毒的[32-33]。且從圖11 中可以看出，GNE較GNA 而言細(xì)胞存活率下降更加明顯，IC50值更小，是游離GNA [IC50值（6.041 μmol·L－1）]的0.55 倍，這表明納米乳包裹后的GNA 相對(duì)于游離藥物，其抑制細(xì)胞增殖的能力提高了，對(duì)癌細(xì)胞的毒性增大了，因此其抗腫瘤活性得到增強(qiáng)。

3 討論

GNA 和藤黃酸均是從藤黃科植物藤黃中分離提取出來(lái)的有效活性成分，但GNA 表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗腫瘤作用。曲寶璽等[34]通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GNA 對(duì)小鼠白血病的抑制作用優(yōu)于藤黃酸，最高生存期延長(zhǎng)率可達(dá)292%，而藤黃酸最高只達(dá)到119%。并且GNA 對(duì)正常細(xì)胞（如人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVEC）不敏感，不影響脾、腎等主要器官的生理功能[35]，是一種極具開(kāi)發(fā)前景的天然抗腫瘤藥物。尤其是在藤黃酸Ⅲ期臨床失敗以后，GNA 的研究變得更為重要。本文旨在通過(guò)制備納米乳來(lái)改善GNA 的脂溶性強(qiáng)、水溶性差的問(wèn)題，并以期通過(guò)改變給藥方式從而避免其血管刺激性。

在納米乳的制備上，首先挑選符合2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定的幾種不同輔料，再根據(jù)溶解度實(shí)驗(yàn)，篩選對(duì)GNA 溶解度最大的油相、表面活性劑和助表面活性劑，決定出納米乳的組分因素。雖然該成分組成的偽三元相圖納米乳區(qū)域小，但穩(wěn)定性良好，且文獻(xiàn)鮮少報(bào)道，具有一定的研究?jī)r(jià)值。在投藥量的選擇上，本研究將過(guò)量的GNA 多次少量地加入到事先制備好的空白納米乳中。冷藏24 h 后，出現(xiàn)沉淀；表明添加的60.23 mg GNA 不能被納米乳劑完全溶解。所以通過(guò)低速離心（3000 r·min－1）將沉淀物與載有GNA 的納米乳劑分離[36]。然后取上清液溶于甲醇測(cè)定GNA 含量，得納米乳的最大載藥量為56.16 mg；考慮到GNE 的長(zhǎng)期穩(wěn)定性，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇了36 mg 為納米乳的投藥量用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。該制劑存在的不足地方是Zeta 電位的絕對(duì)值不夠大，但Zeta 電位并非是考察穩(wěn)定性因素的唯一評(píng)價(jià)指標(biāo)。文獻(xiàn)表明，即使Zeta 電位絕對(duì)值小于20 mV，結(jié)果依然表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性[37-38]。此外，在MTT 實(shí)驗(yàn)中，空白納米乳對(duì)腫瘤細(xì)胞有微弱的毒性，可能是由于空白納米乳輔料量較大的原因?？瞻准{米乳同GNE 制備方法一致，輔料量一樣，若降低了GNE 的輔料量，則可降低空白納米乳的輔料量。因此根據(jù)載藥量的計(jì)算公式，在控制藥量相等的情況下，提高載藥量是減少輔料量的有效途徑，但載藥量低是傳統(tǒng)納米載藥系統(tǒng)的通病，比如GNA PEG 化脂質(zhì)體、納米脂質(zhì)體和葉酸靶向磁性納米粒的載藥量分別僅為3.72%、4.23%和4.35%[7，39-40]，肉豆蔻香精油納米乳的載藥量為1.11%～4.12%[41]。因此，越來(lái)越多的人通過(guò)將藥物與輔料化學(xué)鍵合來(lái)提高載藥量，在攝取相同劑量藥物時(shí)，載藥量大的制劑攝取的輔料量少，從而達(dá)到減少輔料毒性的目的[42-43]。

本文通過(guò)制備經(jīng)口給藥納米乳改善了GNA 的不足，并通過(guò)外觀、類(lèi)型、粒徑、PDI、透射電鏡、稀釋穩(wěn)定性和放置穩(wěn)定性等方法對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)的表征；體外細(xì)胞藥效學(xué)也初步證明了納米乳可以增強(qiáng)GNA 對(duì)腫瘤的抑制作用。雖然涉及的內(nèi)容范圍較少，但后期課題組會(huì)通過(guò)細(xì)胞毒性試驗(yàn)、體外釋放試驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、安全性試驗(yàn)等進(jìn)行進(jìn)一步的考察，以期為其用于臨床研究提供理論基礎(chǔ)。