靳榮, 李紅芳, 南壽山, 姜忠敏, 吳曉蕊

天津市第五中心醫(yī)院 1婦產(chǎn)科， 3消化科， 4病理科(天津 300450)； 2蘭州市第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科(甘肅蘭州 730050)

子宮內(nèi)膜腺癌是一種原發(fā)于子宮內(nèi)膜表面上皮的惡性腫瘤，圍絕經(jīng)期女性好發(fā)，是女性生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一[1]。有報道顯示，我國每年新發(fā)子宮內(nèi)膜腺癌接近20萬例，且發(fā)病率呈升高趨勢[2]。目前子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)病機(jī)制仍未完全明確。小泛素相關(guān)修飾物是一類存在于真核生物中的高度保守的蛋白，參與蛋白質(zhì)泛素化相關(guān)修飾過程[3]。而小泛素相關(guān)修飾物特異性蛋白酶則是在蛋白質(zhì)泛素化過程中特異性催化小泛素相關(guān)修飾物與靶蛋白分離的酶[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，小泛素相關(guān)修飾物特異性蛋白酶(SENP)在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5]。SENP1、SENP5、SENP6是SENPs家族的重要成員，已有研究發(fā)現(xiàn)，SENP1在前列腺癌、胃癌中呈現(xiàn)高表達(dá)； SENP5在舌鱗狀細(xì)胞中呈現(xiàn)高表達(dá)；SENP6在惡性膠質(zhì)瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)[6-8]。但三者在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)情況尚無相關(guān)報道。本研究分析SENP1、SENP5、SENP6蛋白在子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義，旨在探討SENP1、SENP5、SENP6蛋白在子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用，并對診斷治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2013年1月至2019年10月我院收治的子宮內(nèi)膜腺癌病例80例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有病例均經(jīng)高年資病理醫(yī)生診斷確診為子宮內(nèi)膜腺癌；(2)術(shù)前未經(jīng)放化療；(3)不合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；(4)無自身免疫疾病；(5)臨床病歷資料完整。年齡40～78歲，平均(61.38±8.56)歲；國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟臨床分期：Ⅰ期20例、Ⅱ期29例、Ⅲ期19例、Ⅳ期12例；組織學(xué)分級：G1級27例、G2級31例、G3級22例；肌層浸潤程度：<1/2 52例、≥1/2 28例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移18例、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移62例。

不典型增生62例，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有病例均經(jīng)高年資病理醫(yī)生診斷確診為子宮內(nèi)膜不典型增生；(2)無放化療史；(3)不合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；(4)無自身免疫疾?。?5)臨床病歷資料完整。年齡42～77歲，平均(60.15±8.21)歲。

增殖期子宮內(nèi)膜58例。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)所有病例均經(jīng)高年資病理醫(yī)生診斷確診為增殖期子宮內(nèi)膜；(2)無放化療史；(3)不合并其他系統(tǒng)惡性腫瘤；(4)無自身免疫疾?。?5)臨床病歷資料完整。年齡40～79歲，平均(61.02±8.87)歲。

3組在年齡構(gòu)成比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意，患者對研究知情同意。

1.2 主要試劑 兔抗人SENP1、SENP5、SENP6單克隆抗體(美國Abcam公司)；免疫組化試劑盒(福建邁新生物有限公司)；3%過氧化氫、DAB顯色劑、酶標(biāo)羊抗兔聚合物(北京中杉金橋生物有限公司)。

1.3 方法 術(shù)中取病變處標(biāo)本，經(jīng)10%中性甲醛固定24 h后進(jìn)行石蠟包埋，切成4 μm連續(xù)切片。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇溶液脫水、高溫高壓抗原修復(fù)、3%過氧化氫去除內(nèi)源性過氧化物酶、加入山羊血清，然后分別加入兔抗人SENP1、SENP5、SENP6單克隆抗體，4℃下過夜(反應(yīng)時間≥8 h)，加入生物學(xué)二抗，加入SABC工作液后進(jìn)行DAB顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水透明，封片后在顯微鏡下觀察。用PBS代替生物學(xué)一抗進(jìn)行陰性對照，以說明書陽性對照樣品作為陽性對照。

1.4 結(jié)果判別[9]在顯微鏡下觀察切片，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)黃色或棕黃色顆粒為陽性。SENP1、SENP5、SENP6蛋白陽性均主要表達(dá)與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，每個切片隨機(jī)觀察10個高倍鏡(400倍)視野，按照陽性細(xì)胞所占百分比計分：≤5% 0分，6%～25% 1分，26%～50% 2分，51%～75% 3分，>75% 4分。按照細(xì)胞染色程度計分：無著色 0分，淡黃色 1分， 棕黃色 1分，黃褐色3分。將兩項結(jié)果乘積作為總分，≥4分為陽性，<4分為陰性。

2 結(jié)果

2.1 3組組織中SENP1、SENP5、SENP6蛋白表達(dá)情況比較 子宮內(nèi)膜腺癌組子宮內(nèi)膜組織中SENP1、SENP5、SENP6蛋白陽性率顯著高于不典型增生組、增殖期子宮內(nèi)膜組；不典型增生組子宮內(nèi)膜組織中SENP1、SENP5、SENP6蛋白陽性率顯著高于增殖期子宮內(nèi)膜組(P<0.05)，見表1和圖1。

表1 3組組織SENP1、SENP5、SENP6蛋白陽性表達(dá)情況比較 例(%)

注:A：SENP1在增殖期子宮內(nèi)膜組中的表達(dá); B：SENP1在不典型增生組中的表達(dá); C：SENP1在子宮內(nèi)膜腺癌組中的表達(dá)；D：SENP5在增殖期子宮內(nèi)膜組中的表達(dá);E：SENP5在不典型增生組中的表達(dá); F：SENP5在子宮內(nèi)膜腺癌組中的表達(dá)；G：SENP6在增殖期子宮內(nèi)膜組中的表達(dá); H：SENP6在不典型增生組中的表達(dá); I：SENP6在子宮內(nèi)膜腺癌組中的表達(dá)

2.2 子宮內(nèi)膜腺癌組織中SENP1、SENP5、SENP6蛋白表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系 臨床分期Ⅲ+Ⅳ期、組織學(xué)分級G3級、肌層浸潤≥1/2、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者SENP1、SENP5、SENP6蛋白陽性率顯著高于臨床分期Ⅰ+Ⅱ期、組織學(xué)分級G1、G2級、肌層浸潤<1/2、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者(P<0.05)，不同年齡分組SENP1、SENP5、SENP6蛋白陽性率比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 子宮內(nèi)膜腺癌組織中SENP1、SENP5、SENP6蛋白陽性表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系 例(%)

2.3 子宮內(nèi)膜腺癌組織中SENP1、SENP5、SENP6蛋白表達(dá)的相關(guān)性 Spearman相關(guān)分析顯示，子宮內(nèi)膜腺癌組織中SENP1蛋白表達(dá)與SENP5、SENP6蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.708,P=0.000;r=0.773,P=0.000)，SENP5蛋白表達(dá)與SENP6蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.632,P=0.000)，見表3～5。

表3 子宮內(nèi)膜腺癌組織中SENP1、SENP5蛋白表達(dá)的相關(guān)性 例

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)泛素化相關(guān)修飾是真核生物普遍存在的過程，通過蛋白修飾可以調(diào)節(jié)靶蛋白的活性、定位、數(shù)量，并與其他生物學(xué)大分子相互作用參與生命活動過程[10]。蛋白質(zhì)泛素化相關(guān)修飾過程是一個動態(tài)可逆的修飾過程，主要包括活化、結(jié)合、連接和修飾幾個基本步驟，其逆向的去蛋白質(zhì)泛素化相關(guān)修飾過程則由SENPs家族催化完成[11]。研究發(fā)現(xiàn)，SENPs家族主要由兩大類組成，其中SENP1、SENP2具有C末端異肽酶水解活性，可以對無活性的泛素化相關(guān)修飾蛋白前體進(jìn)行切割，而SENP5、SENP6則主要促進(jìn)泛素化相關(guān)修飾蛋白與靶蛋白的解離過程[12-13]。Wei等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌組織中存在SENP1的高表達(dá)。Burdelski等[15]報道SENP1可以通過激活c-Jun信號通路進(jìn)而增加細(xì)胞周期蛋白cyclin D1的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。目前已有研究發(fā)現(xiàn)在骨肉瘤和肝癌中存在SENP5的高表達(dá)，SENP5可以通過激活DNA損傷應(yīng)答激酶的去泛素化相關(guān)修飾作用，促進(jìn)細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[16-18]。而在白血病患者中則存在SENP5的低表達(dá)。SENP6可以促進(jìn)轉(zhuǎn)錄因子叉頭盒蛋白去泛素化相關(guān)修飾，促進(jìn)胃癌的發(fā)生、發(fā)展。但目前三者在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)情況尚未見相關(guān)報道[19]。

本研究應(yīng)用免疫組化法檢測子宮內(nèi)膜腺癌、不典型增生、增殖期子宮內(nèi)膜組織中SENP1、SENP5、SENP6表達(dá)情況，結(jié)果顯示子宮內(nèi)膜腺癌組子宮內(nèi)膜組織中SENP1、SENP5、SENP6蛋白陽性率顯著高于不典型增生組、增殖期子宮內(nèi)膜組，提示SENP1、SENP5、SENP6在子宮內(nèi)膜腺癌發(fā)生中起到促進(jìn)作用。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)分析其原因可能與以下幾方面有關(guān)：(1)SENP1可能通過激活c-Jun等信號通路增加細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)，促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生[20]；(2)SENP5、SENP6可能通過促進(jìn)蛋白去泛素化相關(guān)修飾，進(jìn)而促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生[21]；(3)SENP1可能通過調(diào)控β-鏈蛋白(β-catenin)進(jìn)而調(diào)控wnt信號通路，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和侵襲[19]；(4)SENP6通過抑制泛素連接酶導(dǎo)致抑癌基因失活，促進(jìn)細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變[22]。不典型增生組子宮內(nèi)膜組織中SENP1、SENP5、SENP6蛋白陽性率顯著高于增殖期子宮內(nèi)膜組則提示子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生是一個多步驟、長時間的漸進(jìn)的過程，在這一過程中多種腫瘤相關(guān)信號通路被逐漸激活，相關(guān)蛋白逐漸改變，因此也涉及到SENP1、SENP5、SENP6蛋白表達(dá)陽性率的逐漸升高。近年來盡管子宮內(nèi)膜腺癌在環(huán)境因素、信號通路和癌基因水平均取得了較大進(jìn)展，但對于分化程度較差、肌層浸潤和淋巴道轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜腺癌治療仍不容樂觀，尋找子宮內(nèi)膜腺癌生物學(xué)標(biāo)志進(jìn)而輔助診斷和治療成為臨床的熱點(diǎn)[23]。本研究對子宮內(nèi)膜腺癌組織中SENP1、SENP5、SENP6蛋白表達(dá)情況與臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果顯示SENP1、SENP5、SENP6蛋白的表達(dá)與患者年齡無關(guān)，而與子宮內(nèi)膜腺癌的臨床分期、組織學(xué)分級、浸潤及淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)。目前研究表明腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移是一個主動過程，涉及腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶游出、腫瘤細(xì)胞突破基底膜、進(jìn)入血管或淋巴管，并游走到其他組織和器官進(jìn)行生長等過程[24]。本研究結(jié)果提示SENP1、SENP5、SENP6可能通過激活某些信號通路促進(jìn)子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移。也提示三者在子宮內(nèi)膜癌輔助診斷和指導(dǎo)治療中具有一定價值。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜腺癌組織中SENP1蛋白表達(dá)與SENP5、SENP6蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，提示三者可能具有協(xié)同作用，其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究證實。

綜上所述，子宮內(nèi)內(nèi)膜腺癌組織中存在SENP1、SENP5、SENP6蛋白的異常高表達(dá)，其水平與子宮內(nèi)膜腺癌的臨床分期、組織學(xué)分級、浸潤及淋巴道轉(zhuǎn)移相關(guān)，且三者表達(dá)呈正相關(guān)，SENP1、SENP5、SENP6可能在子宮內(nèi)膜癌輔助診斷和指導(dǎo)治療中具有一定價值。