商勇 周慧芳 劉勛 牙生·沙吉旦

新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院呼吸二科844000

由于人口的增長和老齡化,癌癥已成為世界范圍內(nèi)的主要死亡原因[1]。肺癌是常見的癌癥之一,約占總癌癥的18.4%[2]。小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌是肺癌的兩種主要病理類型。研究普遍認(rèn)為,環(huán)境風(fēng)險因素(如煙草和遺傳變異)與肺癌的發(fā)展有關(guān)[3-5]。已有的研究證據(jù)表明,血清中高葉酸水平對肺癌有保護作用[6-7]。葉酸代謝參與DNA 甲基化和修復(fù)過程,可能預(yù)防癌變。此外,葉酸參與的一碳代謝在癌細(xì)胞過度增殖中起到重要作 用[8-9]。5，10-亞 甲 基 四 氫 葉 酸 還 原 酶(met hylenetetrahydr of olate reductase,MT HFR)基因多態(tài)性可能調(diào)節(jié)葉酸的表達[10]。通過調(diào)節(jié)葉酸的表達,MTHFR 基因多態(tài)性被認(rèn)為與肺癌的易感性有關(guān)。677C/T 和1298 A/C 是MTHFR 基因中最常見的2個單核苷酸多態(tài)性,這些單核苷酸多態(tài)性已被確定影響血清葉酸水平和MTHFR 基因活性[11],MT HFR 基因多態(tài)性與肺癌風(fēng)險之間的相關(guān)性已被廣泛研究;然而,中國新疆維吾爾族人群肺癌病例中的MT HFR 基因多態(tài)性分布是否具有一定的地域差異? 本研究通過選取2018年9月至2020年9月在新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院收治的維吾爾族肺癌患者進行探究,以期從遺傳學(xué)的角度為治療維吾爾族肺癌患者提供更多的理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 前瞻性研究。選取2018年9月至2020年9月在新疆喀什地區(qū)第一人民醫(yī)院收治的維吾爾族肺癌患者50例為試驗組;選取同期在該院體檢的健康維吾爾族者50名為對照組。其中試驗組男28例,女22例;年齡(53.27±4.33)歲,年齡范圍為42～73 歲;吸煙史 (25.67±3.57)年。對照組男32 名,女18 名;年齡 (54.38±5.65)歲,年齡范圍為42～76歲;吸煙史(24.39±4.48)年。試驗組和對照組患者一般資料具有可比性(P值均＞0.05)。

納入標(biāo)準(zhǔn):無血緣關(guān)系的喀什地區(qū)維吾爾族患者;患者生存期≥3個月,一般狀態(tài)KPS 評分≥60分,無明顯的腦、心、肺、肝、腎等主要臟器功能障礙。該研究是根據(jù)世界醫(yī)學(xué)協(xié)會《赫爾辛基宣言》進行的,并且征得各受試者的知情同意。

排除標(biāo)準(zhǔn): (1)嚴(yán)重心血管疾病、腦血管疾病,有血栓、栓塞性疾病病史;(2)糖尿病;(3)嚴(yán)重肝腎功能不全;(4)嚴(yán)重營養(yǎng)不良;(5)甲狀腺疾病;(6)妊娠以及接受器官移植。

1.2 方法

1.2.1 樣本取樣 清晨采集試驗組和對照組的空腹靜脈血標(biāo)本,所有的血標(biāo)本在-80 ℃冰箱凍存。1.2.2 DNA 提取 采用北京百泰克生物科技有限公司生產(chǎn)的提取試劑盒進行DNA 抽提。首先嚴(yán)格按照說明書稀釋或者混懸各種試劑,并做好標(biāo)記。然后裂解細(xì)胞,加入相應(yīng)試劑純化DNA,用微量紫外分光光度計測量提取DNA 濃度及260/280的比值,260/280的比值范圍為1.8～2.0時樣本方可用于后續(xù)實驗。提取的DNA 保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 MT HFR 基因多態(tài)性檢測 MT HFR 基因上第667和1 298位的堿基容易發(fā)生點突變,采用限制性片段長度多態(tài)性酶切技術(shù)檢測2組MT HFR基因677C/T 和1298 A/C 多態(tài)性分布。引物由北京擎科生物科技公司合成,PCR Mix購自上海近岸蛋白生物科技公司。 (1)PCR 反應(yīng)體系:總體積為50μl,其中模板DNA 30 ng,正向、反向引物各1.2μmol/L,Mix 25μl,加水補足至50μl。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s后進入熱循環(huán),94 ℃1 min,60℃30 s,72℃1 min,循環(huán)35次,最后72 ℃延伸5 min。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物。667C/T 和1298 A/C的基本信息及引物序列見表1。 (2)PCR 產(chǎn)物酶切分析MT HFR 基因多態(tài)性:在PCR 擴增產(chǎn)物中加入內(nèi)切酶MboⅡ(日本Takara公司,根據(jù)酶切產(chǎn)物的量加入相應(yīng)體積酶),37 ℃金屬浴反應(yīng)4 h。反應(yīng)結(jié)束后,適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠電泳進行酶切產(chǎn)物檢測,進一步分析納入患者中3種基因型:野生純合型、雜合型和純合突變型。

表1 MT HFR 基因1298 A/C、677C/T 位點擴增引物

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 22.0分析軟件進行分析,計算MT HFR 677C/T 和1298A/C 基因突變率,等位基因頻率確定維吾爾族肺癌患者中MTHFR 基因多態(tài)性。計數(shù)資料以頻數(shù) (%)表示,組間比較采用χ2檢驗,Kaplan-Meier分析患者生存預(yù)后。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA 數(shù)據(jù)庫中肺鱗狀細(xì)胞癌和肺腺癌樣本MT HFR mRNA 的表達量分析 在TCGA 肺癌樣本數(shù)據(jù)庫中,我們發(fā)現(xiàn)肺腺癌樣本和肺鱗狀細(xì)胞癌樣本中MTHFR均較癌旁組織高表達(肺腺癌:t=2.391,P=0.022 3;肺鱗狀細(xì)胞癌:t=2.426,P=0.020 5),見圖1。

圖1 MTHFR 在TCGA 數(shù)據(jù)庫中表達量的分析

2.2 肺癌患者中MTHFR 的表達和患者生存預(yù)后分析 進一步通過對MT HFR 的表達量和肺癌患者的預(yù)后生存進行分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)低表達的MT HFR 有助于肺癌患者的生存預(yù)后,高表達MTHFR 不利于患者的預(yù)后,見圖2。

圖2 MT HFR 的表達與肺癌患者生存預(yù)后的關(guān)系

2.3 MT HFR 677C/T 基因型頻率及等位基因頻率 如表2所示,試驗組中MT HFR 677CC 基因型頻率為26.0%,677CT 基因型頻率為42.0%,677TT 基因型頻率為32.0%;對照組中MT HFR 677CC基因型頻率為68.0%,677CT 基因型頻率為20.0%,677 TT 基因型頻率為12.0%,組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P值均＜0.05)。試驗組T 等位基因分布頻率高于對照組,C等位基因分布頻率則相反,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (χ2=4.352、8.647,P值均＜0.05)。

表2 MT HFR 667C/T 基因型及等位基因的分布頻率 [頻數(shù) (%)]

2.4 MT HFR 1298 A/C基因型頻率及等位基因頻率 如表3 所示,試驗組中MT HFR 1298 AA 基因型頻率是30.0%,1298 AC 基因型頻率是38.0%,1298CC基因型頻率是32.0%;對照組中MT HFR 1298 AA 基因型頻率是64.0%,1298 AC基因型頻率是22.0%，1298CC 基因型頻率是14.0%,組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P值均＜0.05)。試驗組C 等位基因分布頻率高于對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (51.0%比25.0%,χ2=4.424,P＜0.05)。

3 討論

近年來,癌癥發(fā)生、發(fā)展中的遺傳易感性位點的研究取得了一定的進展,但是肺癌的遺傳因素還未能夠完全闡明。本研究對維吾爾族人群中50例肺癌患者和50名健康對照者MT HFR 基因的多態(tài)性位點進行檢測,分析其多態(tài)性在肺癌患者以及健康人群中發(fā)生的頻率以及通過TCGA 數(shù)據(jù)庫進一步檢測該基因在肺腺癌以及鱗狀細(xì)胞癌中的表達水平和對肺癌患者生存預(yù)后的影響。TCGA 數(shù)據(jù)庫顯示肺腺癌和肺鱗癌患者中MT HFR 高表達,與低表達組相比,高表達MT HFR 的肺癌患者生存預(yù)后較差,表明MT HFR 和MT HFR 基因多態(tài)性可能與維吾爾族人群肺癌風(fēng)險密切相關(guān)。

采用限制性片段長度多態(tài)性酶切技術(shù)檢測試驗組和對照組患者MTHFR 基因677C/T 和1298A/C多態(tài)性,以及組間該基因發(fā)生多態(tài)性的頻率。如表1所示,試驗組MT HFR 677C/T 野生純合型基因型 (CC)的分布頻率為26.0%,而對照組為68.0%,顯著高于試驗組;試驗組MTHFR 677C/T雜合突變型基因型 (CT)的分布頻率為42.0%,而對照組為20%;試驗組MTHFR 677C/T 純合突變型基因型 (TT)的分布頻率32.0%,而對照組為12.0%;試驗組和對照組的肺癌患者T 等位基因分布頻率分別為53.0%和22.0%,試驗組中T等位基因分布頻率高于對照組,以上各項組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 (P值均＜0.05)。這與Liu等[11]的研究結(jié)果具有一致性,肺癌患者的MT HFR 677C/T 純合突變型基因型較多。章婷等[10]卻得出了相反的結(jié)論,認(rèn)為T 等位基因可能降低肺癌的發(fā)病風(fēng)險。以上研究結(jié)果提示在不同種族人群中,MT HFR 基因單核苷酸多態(tài)性可能與遺傳學(xué)背景和環(huán)境等因素有關(guān)。雖然本研究的研究對象均為維吾爾族人群,但是納入對象可能來自不同的地區(qū),存在一定的地區(qū)差異,可能會影響實驗結(jié)果。

此外,本研究還發(fā)現(xiàn)試驗組MT HFR 1298 AA型患者有30.0%,MTHFR 1298 AC 型患者有38.0%,MT HFR 1298CC 型患者有32.0%,對照組分別為64.0%、22%和14.0%,組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均＜0.05),但仍需更大的樣本量證實這一推論。MTHFR 基因變異引起肺癌的機制可能與DNA 和RNA 的甲基化異常有關(guān)[11-14]。MT HFR 是葉酸代謝途徑中的限速酶,催化葉酸代謝產(chǎn)物5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)變?yōu)?-甲基四氫葉酸,前者可進一步合成核苷酸,而后者是合成體內(nèi)通用甲基供體S-腺苷甲硫氨酸的原料之一[15-16]。MT HFR 基因變異致酶活性降低,5-甲基四氫葉酸水平低下,S-腺苷甲硫氨酸的合成減少,進一步引起基因組的異常甲基化[17-19]。綜上所述,本研究顯示MTHFR 基因677C/T 和1298A/C的單核苷酸多態(tài)性在維吾爾族人群肺癌中較常見;同時MTHFR 在肺癌組織中高表達,影響患者的生存預(yù)后。因此本研究提示MT HFR 基因的多態(tài)性與維吾爾族人群肺癌的發(fā)生存在一定關(guān)系,MT HFR 有望作為篩選肺癌高危人群靶向分子,也可作為臨床早期發(fā)現(xiàn)肺癌的預(yù)測因子。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

表3 MT HFR 1298 A/C基因型及等位基因的分布頻率 [頻數(shù) (%)]