劉澤慧，劉 銳，王君玲，白秀麗，陳志文*，趙建國，吳佳文，常蕊蕊，鐘世平

（1.石墨烯林業(yè)應(yīng)用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，山西大同大學(xué)炭材料研究所，山西大同 037009；2.山西大同大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山西大同 037009）

碳納米材料是指分散相尺度至少有一維小于100 nm的碳材料，包括納米金剛石、納米碳纖維、碳納米管、石墨烯、富勒烯等，由于其種類繁多、結(jié)構(gòu)獨特、性能優(yōu)異等特點，在物理、材料、化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)等多個領(lǐng)域都有研究應(yīng)用。

作為二維的碳納米材料代表，具有高比表面積、高導(dǎo)電率、化學(xué)穩(wěn)定性好等特點，石墨烯在很多領(lǐng)域得到研究和應(yīng)用。目前石墨烯對植物影響的研究相對來說比較少。石墨烯是碳原子以六邊形蜂窩狀矩陣連接在一起，以sp2雜化方式存在，每個碳原子的pz軌道垂直于石墨烯層，在表面形成多原子離域大鍵，ZHAO等[1]研究發(fā)現(xiàn)陽離子與石墨烯離域大鍵的相互作用可以提高含石墨烯水系統(tǒng)（如分離膜、吸附劑）的穩(wěn)定性、選擇性和吸附能力；石墨烯比表面積大且表面有多種含氧物質(zhì)官能團(tuán)，使石墨烯能夠吸附肥料并緩慢釋放肥效[2]。LIU等[3]研究石墨烯對水稻（Oryza sativa L.）萌發(fā)和幼苗形態(tài)的影響時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)石墨烯為低濃度5 mg/L時，觀察到對不定根數(shù)、根鮮重和地上部分鮮重的促進(jìn)作用，而在100 mg/L和200 mg/L等高濃度下，水稻各生長指標(biāo)均受到抑制。郭緒虎等[4]發(fā)現(xiàn)4.00和8.00 mg/L的石墨烯溶液可以促進(jìn)藜麥（Chenopodium quinoa Willd.）組培苗根系的生長和發(fā)育，且增加了藜麥幼苗的生物量。SHEN等[5]研究不同濃度氧化石墨烯對5個品種水稻（Ory?za sativa L.）根系影響時，證實低濃度（5 mg/L）的氧化石墨烯對2個品種水稻根長有促進(jìn)作用，對其他3個品種水稻根長有抑制作用，而高濃度（50 mg/L）的氧化石墨烯處理對5個品種水稻根系生長都有抑制作用。這些研究表明石墨烯對植物生長的影響受植物種類和品種、石墨烯濃度等多種因素影響?？偟膩碚f，低濃度石墨烯可以促進(jìn)某些植物種子萌發(fā)、根和莖的生長，并促進(jìn)生物量的增加，而高濃度的石墨烯則對植物生長有抑制作用，所以我們需要尋找石墨烯促進(jìn)植物生長的最佳濃度。

棉花是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，主要分布在長江流域、黃河流域、西北內(nèi)陸。目前國產(chǎn)棉花不能滿足國內(nèi)需求，每年有30%的國內(nèi)棉花需求依賴進(jìn)口，成為繼大豆、食用油后第三大進(jìn)口農(nóng)作物。棉田黃萎病呈發(fā)展態(tài)勢，2012年，全國棉田流行黃萎病約3 000萬畝[6]，導(dǎo)致棉田減產(chǎn)15%～20%。由于黃萎病的危害，加上大幅度增長的原棉需求和5×106t的原棉缺口，使我國棉花安全面臨著很大威脅。隨著抗蟲棉的推廣普及，棉鈴蟲被基本控制，但是農(nóng)藥使用量大幅度下降，導(dǎo)致原來零星發(fā)生的蚜蟲、盲蝽象、煙粉虱等刺吸式次生害蟲逐漸上升為主要害蟲，危害逐年加重，棉田面臨藥量使用反彈問題[6]。

植物體內(nèi)的一些基因能夠?qū)Ω鞣N生物和非生物脅迫做出快速的應(yīng)答，從而使植物適應(yīng)逆境帶來的傷害，其中重要的調(diào)節(jié)因子是轉(zhuǎn)錄因子。根據(jù)轉(zhuǎn)錄因子保守DNA結(jié)合域的不同可分為WRKY家族、bZIP家族、MYB家族、AP2/ERF家族等[7]，而RAV是AP2/ERF家族的RAV亞家族類[8?9]。盧合均[10]通過對陸地棉接種黃萎病后分析發(fā)現(xiàn)RAV基因上調(diào)對棉花抵抗黃萎病有積極作用。目前還未有文獻(xiàn)研究石墨烯和植物RAV基因家族的響應(yīng)關(guān)系。本研究利用不同質(zhì)量濃度的石墨烯溶液處理棉花幼苗，尋找表型最好的一個實驗組，通過利用qRT?PCR技術(shù)檢測棉花RAV基因家族17個基因的表達(dá)量，以期尋找棉花根系RAV基因家族17個基因中響應(yīng)石墨烯的靶基因，為石墨烯提高棉花抗逆性提供理論基礎(chǔ)。

1 試驗部分

1.1 試驗場地和試驗材料

本研究于2019年5?6月在大同大學(xué)炭材料研究所院內(nèi)試驗地內(nèi)進(jìn)行，以陸地棉種子為試驗材料，石墨烯由大同大學(xué)炭材料研究所以電化學(xué)法制備而成。

1.2 試驗方法

1.2.1 棉花種植與試驗設(shè)計

按照完全隨機(jī)區(qū)組的方法將60顆大小一致的棉花種子分為6組，每組10顆，分別標(biāo)記為空白組和實驗組（6組），所有棉花種子均培養(yǎng)在土壤中。

1.2.2 數(shù)據(jù)獲取

棉花RAV基因家族序列是從PlantTFDB v5.0數(shù)據(jù)庫（Plant Transcription Factor Database）與Cottongen數(shù)據(jù)庫（https：//www.cottongen.org/）中下載得到。

1.2.3 進(jìn)化樹構(gòu)建

使用MEGA?X軟件中內(nèi)置MUSCLE軟件進(jìn)行序列比對。在系統(tǒng)發(fā)育分析中，利用PHYLOGENY做進(jìn)化樹分析，分析參數(shù)用1 000 Bootstrap值，構(gòu)建進(jìn)化樹。選用陸地棉作進(jìn)化分析。

1.2.4 引物設(shè)計

棉花RAV基因序列下載自Cottongen數(shù)據(jù)庫，利用CDS序列文件來設(shè)計qRT?PCR的引物，引物設(shè)計工具為NCBI?primer balst。

1.2.5 石墨烯處理

取一定量5.00 g/L的石墨烯溶液分別稀釋300、250、200、150、100和50倍，對應(yīng)的質(zhì)量濃度分別為16.00、20.00、25.00、50.00和100.00 mg/L。實驗組，將5個不同質(zhì)量濃度石墨烯溶液分別澆灌于對應(yīng)實驗組的棉花幼苗根部，分4次澆灌，從播種開始每隔1周澆灌1次，每次澆灌體積1 L，澆灌時間18：00；空白組，澆灌溶液為等量的蒸餾水，其余處理與實驗組一致。

1.2.6 RNA提取與qRT?PCR分析

從土壤中挖出對照和石墨烯處理的棉花根系，用蒸餾水沖洗干凈，立刻凍于液氮中，隨后置于?80 ℃超低溫冰箱保存，用以提取RNA。在實時熒光定量PCR反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。具體實驗步驟為：

（1）反轉(zhuǎn)錄：依賴反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA;

（2）擴(kuò)增：用PCR的方法擴(kuò)增cDNA;

（3）檢測：實時檢測和定量擴(kuò)增的產(chǎn)物;

（4）以陸地棉組蛋白HIS3mRNA(GenBank登錄號AF024716)作為內(nèi)部對照。

對各反應(yīng)的解離曲線進(jìn)行評價，采用周期閾值(CT)2?ΔΔCT法計算各靶基因的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 不同植物中RAV基因家族基因數(shù)量

從植物轉(zhuǎn)錄因子數(shù)據(jù)庫下載25種植物RAV家族基因（表1），這25種植物涵蓋了被子植物20種，包括基礎(chǔ)被子植物無油樟1個，單子葉植物4種，雙子葉植物16種，苔蘚植物1種，藻類植物3種等?？梢钥吹剑孱愔参镏胁缓蠷AV基因，甘藍(lán)型油菜中所含RAV基因最多。本實驗所要研究的陸地棉中，此種基因數(shù)量多達(dá)17個。

2.2 進(jìn)化分析

根據(jù)上述的分析結(jié)果，我們選取陸地棉的RAV基因，用以做進(jìn)化分析。如圖1所示，17個RAV家族基因可以分為4支，陸地棉的17個RAV基因分布于Clade I，II，III和IV中。

2.3 確定棉花中的RAV基因家族

為了探究這17個RAV棉花基因是否可以響應(yīng)石墨烯處理，我們從Cottongen棉花數(shù)據(jù)庫下載陸地棉基因組測序CDS序列文件，利用CDS序列文件來設(shè)計qRT?PCR的引物，見表2。這些引物用以石墨烯處理棉花幼苗根系后，利用RT?PCR技術(shù)分析17個陸地棉RAV基因的表達(dá)量。

表1 25種植物RAV家族基因數(shù)量

圖1 陸地棉中17個RAV基因家族進(jìn)化樹分析

2.4 不同濃度的石墨烯處理棉花種子

不同濃度石墨烯溶液通過根部澆灌棉花及幼苗，待長到幼苗期后觀察其表型。本試驗設(shè)置6個石墨烯質(zhì)量濃度，分別為0、16、20、25、50、100 mg/L，澆灌棉花根系共4次，1次/周，然后利用根系掃描儀分析棉花根系發(fā)育狀態(tài)，包括根長，根系體積，根系表面積等。如圖2所示，25 mg/L的石墨烯可以顯著促進(jìn)棉花根系的發(fā)育，包括根長、根體積，并且可以促進(jìn)地上部分莖的伸長，因此在后續(xù)基因表達(dá)實驗中，將25 mg/L的濃度定位最佳石墨烯促進(jìn)濃度。提取對照與最佳石墨烯濃度處理的棉花根系RNA，反轉(zhuǎn)錄成DNA，利用表2設(shè)計的引物，對棉花RAV家族基因表達(dá)量分析，以確定響應(yīng)石墨烯的RAV基因。

圖2 不同石墨烯處理后的棉花幼苗根系

2.5 棉花RAV基因響應(yīng)石墨烯的表達(dá)譜特征

提取對照與最佳濃度石墨烯處理的RNA，經(jīng)過qRT?PCR實驗檢測，發(fā)現(xiàn)4個基因的表達(dá)量發(fā)生了上調(diào)，包括Gh_D13G0717、Gh_A13G2131、Gh_A05G0119、Gh_D05G0181。其中與對照組相比Gh_D13G0717上調(diào)約4倍，Gh_A13G2131上調(diào)約7倍，Gh_A05G0119上調(diào)約5倍，Gh_D05G0181上調(diào)約10倍。由此推測這些基因為棉花根系響應(yīng)石墨烯的靶基因，可能石墨烯通過促進(jìn)這4個基因的表達(dá)量上調(diào)而促進(jìn)了其根系的發(fā)育，進(jìn)一步加強(qiáng)棉花植株的抗逆能力。

3 討論

薛斌龍等[11]研究發(fā)現(xiàn)適宜石墨烯可以有效緩解氯化鈉脅迫對樹莓組培苗的傷害，提高組培苗抗鹽能力；胡曉飛[12]在研究石墨烯防治枯萎病作用過程中，發(fā)現(xiàn)石墨烯可以抑制尖孢鐮刀菌孢子的萌發(fā)；HE等[13]研究表明石墨烯作為抗菌劑可以延長鮮切花的壽命。這些結(jié)果說明適宜濃度的石墨烯不僅可以促進(jìn)某些植物生長，而且還可以提高一些植物的抗鹽、抗菌能力。

對于石墨烯對植物抗逆性影響研究方面，YIN等[14]研究認(rèn)為石墨烯具有較大的比表面積、大量的含氧官能團(tuán)和較強(qiáng)的吸附能力可以將過多的鹽離子吸附在石墨烯表面，從而提高植物的抗逆性。胡曉飛認(rèn)為石墨烯的抗菌性是有2種原因：一是石墨烯表面的含氧基團(tuán)（?COOH和?OH）解離，導(dǎo)致石墨烯本身呈酸性，不適宜尖孢鐮刀菌生長；二是石墨烯片層較大，附著于菌體表面，造成細(xì)胞膜翹起，損壞菌體結(jié)構(gòu)，不利于形成孢子。本研究從RAV基因家族表達(dá)量切入，研究石墨烯和植物抗逆性之間的關(guān)系。通過過逆轉(zhuǎn)錄定量PCR檢測后，發(fā)現(xiàn)RAV基因家族中有4個基因的表達(dá)量上調(diào)，表明此基因家族確實響應(yīng)石墨烯，這就從基因角度說明石墨烯有利于棉花的抗逆性和促進(jìn)植物生長，從而達(dá)到提高了棉花產(chǎn)量的目的。

表2 RAV家族基因引物設(shè)計

4 結(jié)語

本研究通過對棉花中RAV基因家族數(shù)量進(jìn)行鑒定，找到了17個RAV基因；在棉花幼苗處于幼苗期時，用不同濃度的石墨烯進(jìn)行處理，證明25 mg/L是最佳濃度；利用qRT?PCR技術(shù)檢測石墨烯處理的棉花根系組織的RAV基因表達(dá)量，結(jié)果表明4個基因發(fā)生了石墨烯誘導(dǎo)的表達(dá)量上調(diào)，驗證了石墨烯處理會影響棉花RAV家族基因的表達(dá)。