賴(lài)曉娜，李媛媛，陳 旭，巫榮華，董張及*，劉 梅*

(南通大學(xué)教育部/江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/神經(jīng)再生協(xié)同創(chuàng)新中心，南通 226001)

遺傳性痙攣性截癱(hereditary spastic paraplegia,HSP)是一類(lèi)遺傳性的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要累及上運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，表現(xiàn)為脊髓雙側(cè)皮質(zhì)脊髓束的軸索變性和(或)脫髓鞘。在HSP 病程中，上神經(jīng)元漸進(jìn)性退化，導(dǎo)致出現(xiàn)下肢進(jìn)行性痙攣、無(wú)力、行走困難等癥狀。目前HSP 已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過(guò)70 種類(lèi)型，其遺傳方式包括常染色體顯性、常染色體隱性和X 連鎖隱性遺傳[1]，其中編碼AAA(ATPase associated with various cellular activities)家族成員Spastin 的spast 基因的突變是導(dǎo)致常染色體顯性HSP 的主要原因[2]。

Spastin 與Katanin 蛋白同屬于一個(gè)蛋白家族，均具有ATP 酶活性，能利用ATP 水解產(chǎn)生能量切斷和解聚微管，是一個(gè)微管切割蛋白[3]。spast 基因擁有兩個(gè)起始密碼子：第1 個(gè)起始密碼子的Kozak 序列為tgaATGa，與典型的一致序列(g/a)ccATGg 序列的偏差較大，常被核糖體漏掃描，翻譯效率較低；而其第2 個(gè)起始密碼子周?chē)蛄惺莄tcATGg，更符合Kozak一致序列，其翻譯效率較高[4-5]。因此可在不同水平上同時(shí)合成兩種Spastin 同源異型體蛋白：全長(zhǎng)同源異型體(稱(chēng)為M1)和較短同源異型體(根據(jù)第2 個(gè)起始密碼子在不同物種中的位置命名，人類(lèi)中為M87，嚙齒動(dòng)物中為M85，斑馬魚(yú)中為M61)[4]。

在嚙齒動(dòng)物中，M85 是所有發(fā)育階段組織中的主要同源異型體，M1 型僅表達(dá)于成體脊髓[6]。在成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，M87 在脊髓和大腦皮層均有表達(dá)，而M1 優(yōu)勢(shì)表達(dá)于脊髓，卻在腦中未能檢出[7]。兩種同源異型體都具有微管相互作用和運(yùn)輸結(jié)構(gòu)域(MIT)、微管結(jié)合域(MTBD)和ATPase AAA 結(jié)構(gòu)域。M1 則獨(dú)有一個(gè)包含疏水結(jié)構(gòu)域的N 末端區(qū)域，因此是一個(gè)完整的膜蛋白，可定位于多種細(xì)胞內(nèi)膜性細(xì)胞器，包括內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[8]、內(nèi)體[9]和脂滴[10]等，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)塑形和脂質(zhì)代謝等非微管切割功能。兩種同源異型體蛋白的差異定位提示它們的功能存在歧化，Spastin 蛋白的微管切割被認(rèn)為是較短的同源異型體的主要功能，而不是M1 的主要功能。然而，關(guān)于兩種同源異型體的功能研究大多在體外細(xì)胞水平進(jìn)行，M1 在體內(nèi)的獨(dú)特作用尚未闡明。

斑馬魚(yú)是低等脊椎動(dòng)物，但與高等脊椎動(dòng)物在結(jié)構(gòu)和功能上具有較高的同源性，其神經(jīng)系統(tǒng)在發(fā)育、結(jié)構(gòu)和功能上具有與哺乳動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)保守性較強(qiáng)的特點(diǎn)[11-13]，且其發(fā)育早期透明，又擁有眾多組織特異性表達(dá)特征的品系，可直接觀察特定神經(jīng)元的發(fā)育情況。本研究通過(guò)對(duì)spast 基因敲除斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)行為進(jìn)行觀察和分析，并與特殊品系的斑馬魚(yú)雜交，觀察其后代脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表型變化，以闡明Spastin M1 在體內(nèi)的作用，為闡釋HSP 的發(fā)病機(jī)制探索新的研究視角。

1 材料與方法

1.1 斑馬魚(yú)飼養(yǎng)及繁育 spast 基因突變體斑馬魚(yú)(ZKO988a 品系)，購(gòu)于中國(guó)斑馬魚(yú)資源中心。轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(hb9:eGFP)，該品系斑馬魚(yú)的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元CaP 神經(jīng)元表達(dá)綠色熒光蛋白，又名Tg(mnx1:eGFP)，由南通大學(xué)神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室斑馬魚(yú)平臺(tái)提供。斑馬魚(yú)按14 h 光照：10 h 黑暗周期進(jìn)行飼養(yǎng)。第2 代斑馬魚(yú)卵在自然交配后采集：當(dāng)天晚上將雌雄spast 雜合突變斑馬魚(yú)spast+/ZKO988a按照1∶1 的比例放入雜交缸中，用隔板分開(kāi)雌雄斑馬魚(yú)，第2 天早上9 時(shí)取下隔板。將斑馬魚(yú)胚胎收集于90 mm 的培養(yǎng)皿中(每個(gè)培養(yǎng)皿50 個(gè)卵)，用斑馬魚(yú)培養(yǎng)液E3 buffer培養(yǎng)，每天更換新鮮培養(yǎng)液，28.5 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至受精后5 d(5 dpf)。接著將幼魚(yú)放入雜交缸中飼養(yǎng)2 周后移至循環(huán)水系統(tǒng)中飼養(yǎng)，并進(jìn)行基因型鑒定。嚴(yán)格按南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審查規(guī)范進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

將spast 純合突變斑馬魚(yú)spastZKO988a/ZKO988a與轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)Tg(hb9:eGFP)按照1∶1 的比例進(jìn)行交配，通過(guò)熒光篩選和測(cè)序鑒定基因型得到帶綠色熒光標(biāo)記運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的spast 雜合突變體斑馬魚(yú)Tg(hb9:eGFP);spast+/ZKO988a，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 spast 基因突變體斑馬魚(yú)的基因型鑒定 將斑馬魚(yú)胚胎或者剪下的成魚(yú)尾鰭放入0.2 mL EP 管中，加入10 μL YSY buffer，離心使樣本浸入液體中，置于56 ℃1 h，使樣本充分裂解、釋放基因組DNA。取1 μL 基因組DNA 樣品作為模板，使用spast 特異性的引物spast-F(5′-atgaattctgggcacaaagc-3′)和spast-R(5′-cctcgtcgatctgcagag-3′)對(duì)基因組DNA 進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增，得到斑馬魚(yú)spast 基因組DNA 片段；將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行DNA 測(cè)序，測(cè)序引物為spast-SF(5′-gcttgcggtccggtgtctga-3′)，分析確定spast 基因型。

1.3 斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)行為分析 收集雌雄spast 雜合突變斑馬魚(yú)交配所產(chǎn)的胚胎，待其發(fā)育至特定時(shí)間，將斑馬魚(yú)幼魚(yú)轉(zhuǎn)移至48 孔板(每孔放入1 條魚(yú)并加入500 μL 系統(tǒng)水)。將48 孔板放入斑馬魚(yú)專(zhuān)用動(dòng)物行為分析儀的觀察箱/室中適應(yīng)0.5 h，觀察箱中的實(shí)時(shí)錄影功能記錄斑馬魚(yú)幼魚(yú)在無(wú)刺激和不同刺激狀態(tài)下的活動(dòng)情況：待斑馬魚(yú)幼魚(yú)適應(yīng)0.5 h 后，進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)為1 h、全程光照無(wú)刺激運(yùn)動(dòng)行為學(xué)檢測(cè)；讓斑馬魚(yú)幼魚(yú)在光照下適應(yīng)0.5 h 后，光照10 min 黑暗10 min 的節(jié)律重復(fù)4 次給予光刺激，進(jìn)行光刺激下運(yùn)動(dòng)行為學(xué)檢測(cè)；讓斑馬魚(yú)幼魚(yú)在光照下適應(yīng)0.5 h，開(kāi)始拍攝后10 min 敲擊1 次(強(qiáng)度為8)，后續(xù)每15 min 敲擊1 次(強(qiáng)度為8)重復(fù)4 次給予聲音刺激，進(jìn)行聲音刺激下運(yùn)動(dòng)行為學(xué)檢測(cè)；用動(dòng)物運(yùn)動(dòng)跟蹤系統(tǒng)(EthoVision XT)對(duì)不同實(shí)驗(yàn)的48 條斑馬魚(yú)幼魚(yú)游泳速度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.4 共聚焦成像觀察斑馬魚(yú)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表型收集雌雄Tg(hb9:eGFP);spast 斑馬魚(yú)交配所產(chǎn)的胚胎，置于E3 緩沖液中培養(yǎng)，24 h 后更換含0.003%苯硫脲(1-Phenyl-2-thiourea,PTU)的E3 緩沖液培養(yǎng)，待斑馬魚(yú)發(fā)育至受精后72 h(72 hpf)，在熒光顯微鏡下挑選脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有綠色熒光標(biāo)記的魚(yú)放入皿中，低熔點(diǎn)瓊脂糖固定，共聚焦拍攝斑馬魚(yú)脊髓神經(jīng)元。拍攝結(jié)束后，將斑馬魚(yú)從瓊脂糖中輕輕取出，提取斑馬魚(yú)幼魚(yú)基因組DNA，進(jìn)行基因型鑒定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用ImageJ 軟件對(duì)斑馬魚(yú)神經(jīng)元的軸突長(zhǎng)度進(jìn)行測(cè)量，用GraphPad Prism5 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)，數(shù)據(jù)用表示。使用two-tail t 檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 spast 基因突變體斑馬魚(yú)的鑒定 從中國(guó)斑馬魚(yú)資源中心引種的spast 基因敲除的雜合子突變體斑馬魚(yú)(ZKO988a)由CRISPR/Cas9 技術(shù)建立，基因型為spast+/ZKO988a。通過(guò)斑馬魚(yú)資源中心給出的CRISPR/Cas9 靶位點(diǎn)與斑馬魚(yú)spast 基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)靶位點(diǎn)位于N 端(圖1A)。將突變體spast+/ZKO988a斑馬魚(yú)相互交配并測(cè)序鑒定得到spast+/+野生型、spast+/ZKO988a雜合突變體、spastZKO988a/ZKO988a純合突變體斑馬魚(yú)(圖1B)。

2.2 spast 基因突變對(duì)斑馬魚(yú)在無(wú)刺激下運(yùn)動(dòng)行為的影響 為評(píng)估spast 基因敲除后是否對(duì)斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)有影響，將突變體spast+/ZKO988a斑馬魚(yú)相互交配得到胚胎，待其發(fā)育至5、6、7 dpf，分別記錄幼魚(yú)在無(wú)刺激下自由游泳的情況，發(fā)現(xiàn)5、6、7 dpf 的spast 雜合突變體、純合突變體的游泳速率與野生型均無(wú)顯著差異(圖2)。

圖1 spast 基因突變體斑馬魚(yú)的鑒定

2.3 spast 基因突變對(duì)斑馬魚(yú)在光刺激下運(yùn)動(dòng)行為的影響 為進(jìn)一步確認(rèn)spast 基因敲除對(duì)斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)行為的影響，通過(guò)給予光刺激，觀察5、6、7、8、9、10 dpf 的3 種基因型spast 突變體受到明暗變化刺激后的運(yùn)動(dòng)速度。均未發(fā)現(xiàn)5、6、7、8、9、10 dpf 的spast 雜合突變體、純合突變體斑馬魚(yú)的運(yùn)動(dòng)速度與野生型之間存在顯著差異(圖3)。

圖2 spast 基因突變體幼魚(yú)在無(wú)刺激下自由游泳的運(yùn)動(dòng)行為分析

圖3 spast 基因突變體幼魚(yú)在光刺激下自由游泳的運(yùn)動(dòng)行為分析

2.4 spast 基因突變對(duì)斑馬魚(yú)在聲音刺激下運(yùn)動(dòng)行為的影響 通過(guò)給予聲音刺激觀察5、6、7、8、9、10 dpf 的3 種spast 突變體受到驚嚇后的運(yùn)動(dòng)速度。結(jié)果表明，雖然spast 純合突變體在6 dpf 的運(yùn)動(dòng)速率比雜合突變體和野生型增加，但其在5、6、7、8、9、10 dpf 的運(yùn)動(dòng)速率與野生型無(wú)顯著差異(圖4)。

圖4 spast 基因突變體幼魚(yú)在聲音刺激下自由游泳的運(yùn)動(dòng)行為分析

2.5 spast 基因突變對(duì)脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表型的影響為研究spast 突變是否會(huì)影響脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的發(fā)育，將Tg(hb9:eGFP);spast+/ZKO988a斑馬魚(yú)雌雄雜交，隨機(jī)挑取72 hpf 且?guī)ЬG色熒光的幼魚(yú)，使用共聚焦顯微鏡拍攝脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元。結(jié)果表明spast 突變影響了神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度和分支(圖5A)。分別統(tǒng)計(jì)3 種基因型的神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度和分支數(shù)，每種基因型各3 個(gè)個(gè)體，選取相近部位(16～18 體節(jié))的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元朝向腹側(cè)的軸突，測(cè)量每根軸突的長(zhǎng)度，與野生型相比，雜合突變體軸突長(zhǎng)度縮短了14%，純合突變體軸突長(zhǎng)度縮短了19%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖5B)。通過(guò)測(cè)量每根軸突兩側(cè)的單位面積熒光強(qiáng)度來(lái)表示軸突分支的復(fù)雜度(圖5C)，雜合突變體和純合突變體的軸突分支的復(fù)雜度與野生型比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明spast 突變影響脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的生長(zhǎng)。

3 討論

微管動(dòng)力學(xué)對(duì)于維持運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的軸突發(fā)育和(或)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要，缺乏Spastin 微管切割活性導(dǎo)致微管動(dòng)力學(xué)失調(diào)，影響神經(jīng)系統(tǒng)功能[14-18]。近年來(lái)，隨著對(duì)遺傳性HSP 重要致病基因Spastin 的研究，發(fā)現(xiàn)其在多種細(xì)胞中具有多樣性的功能作用，使得對(duì)spast 引起的HSP 發(fā)病機(jī)制的理解變得更為復(fù)雜。已有的研究表明Spastin 的兩種亞型參與了多種細(xì)胞功能，如其中M1 型參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重塑[8]、脂質(zhì)滴穩(wěn)態(tài)[10]，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的小管分裂過(guò)程中M1 和M87 型均有作用[19-20]。這些研究提示，兩種亞型的Spastin 蛋白在細(xì)胞內(nèi)的功能既有冗余，也有特異性，故而對(duì)不同亞型獨(dú)特性作用的研究顯得更有價(jià)值。

本研究中使用的斑馬魚(yú)的spast 敲除突變位點(diǎn)在該基因的N 端結(jié)構(gòu)域，位于第2 個(gè)起始密碼子之前，因此，可認(rèn)為本研究中所得到的結(jié)果為Spastin M1 功能缺失所致。之前有研究使用CRISPR/Cas9 技術(shù)敲除spast 基因的突變體斑馬魚(yú)模型，其敲除位點(diǎn)位于第2 個(gè)起始密碼子之后，即Spastin M1 和M61功能均缺少，結(jié)果發(fā)現(xiàn)spast 基因敲除后都出現(xiàn)明顯的運(yùn)動(dòng)缺陷[21]。本研究顯示Spastin M1 敲除后對(duì)斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)行為無(wú)顯著影響，提示運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)的行為可能主要由Spastin M61 參與，或兩者功能有冗余，在單純?nèi)笔1 的情況下未能顯示出顯著缺陷。spast 基因敲除后，斑馬魚(yú)的次級(jí)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(secondary motor neurons,sMN)的背神經(jīng)軸突缺失且吻神經(jīng)相關(guān)的sMN 軸突轉(zhuǎn)向相反的方向[21]。在研究中也觀察到相似的表型，但分析發(fā)現(xiàn)與野生型相比差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。然而，本研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的神經(jīng)元軸突表型，即spast 雜合突變體和純合突變體朝腹側(cè)的CaP神經(jīng)元的軸突長(zhǎng)度較野生型的顯著變短。據(jù)此推測(cè)Spastin M1 的功能缺失，雖未顯著影響斑馬魚(yú)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)功能，卻導(dǎo)致脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元表型缺陷。

本研究提示，僅缺失Spastin M1 功能的突變體，其神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)缺陷的表型較輕、發(fā)病進(jìn)程較慢。而Spastin M1 缺失對(duì)于HSP 疾病的功能障礙的貢獻(xiàn)度及與HSP 致病率之間的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。