劉玉峰，徐偉松，范 輝，顧新紅，劉肇修，倪潤洲，肖明兵***

(1 江蘇省南通市第二人民醫(yī)院消化內(nèi)科，南通 226002；2 南通大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科)

克羅恩病(Crohn′s disease,CD)是一種病因不明的慢性非特異性胃腸道肉芽腫性炎癥性疾病，主要影響胃腸道的黏膜層及黏膜下層，以炎癥的緩解和復(fù)發(fā)交替為特征[1]。臨床表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、腹塊、瘺管形成和腸梗阻，可伴有發(fā)熱、貧血、營養(yǎng)障礙及關(guān)節(jié)、皮膚、眼、口腔黏膜、肝臟等腸外損害。近年來，CD 在我國的發(fā)病率明顯上升，多見于18～35 歲人群[1]。研究[2-3]表明，遺傳易感基因、環(huán)境和免疫系統(tǒng)之間復(fù)雜的一系列相互作用參與了CD 的發(fā)生發(fā)展，而腸上皮屏障破壞是以上這些因素發(fā)生作用的前提。腸上皮細胞的增殖和凋亡的平衡維持著腸上皮屏障完整，腸道屏障的破壞引發(fā)了強烈的炎癥反應(yīng)。研究[4]顯示，凋亡的腸上皮細胞數(shù)目在CD 患者的炎癥部位明顯多于其非炎癥部位，因此研究CD 腸上皮細胞凋亡的作用機制將為CD 的治療提供潛在的分子藥物靶點，具有顯著的臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集南通市第二人民醫(yī)院2014 年1 月—2019 年12 月CD 患者腸黏膜及健康人群腸黏膜石蠟標(biāo)本各10 例，由南通市第二人民醫(yī)院病理科提供。有完整的臨床病理資料。選取8～10 周大小、體質(zhì)量約20 g 的健康雌性BALB/C 小鼠，由南通大學(xué)實驗動物中心提供。所有動物的試驗處理過程，均按照南通大學(xué)實驗動物規(guī)則嚴(yán)格執(zhí)行，得到南通大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實驗方法 取CD 患者炎癥部位及正常對照人群的腸黏膜活檢組織，進行免疫組化檢測VPS4B 的表達和定位。建立三硝基苯磺酸(trinitrobenzenesulphonic acid,TNBS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎動物模型，模型建立參照E.Hollenbach 等[5]的方法。選用健康雌性BALB/C 小鼠，體質(zhì)量18～20 g，將小鼠隨機分為TNBS組和乙醇對照組，每組25 只，禁食24 h 后，稱重。TNBS 組灌腸注入10 mL 的TNBS 灌腸液5% w/v TNBS 試劑與無水乙醇1∶1 配制)，乙醇對照組注入10 mL 的50%乙醇溶液。造模后將小鼠常規(guī)飼養(yǎng)。每日觀察并記錄小鼠疾病活動性狀(大便性狀、大便潛血及體質(zhì)量變化)，若3 d 內(nèi)小鼠體質(zhì)量未持續(xù)下降，未出現(xiàn)血便則造模不成功，予以排除。分別在灌腸后的第1、2、3、4、5 天，每組用頸脫臼的方法隨機處死5 只小鼠。另取5 只小鼠作為正常對照，不予灌腸，在禁食24 h 后處死。取小鼠直腸至回盲部的腸組織，參照結(jié)腸組織病理學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)[6]，留取部分組織保存于-80 ℃冰箱以備提取蛋白，另一部分組織經(jīng)4%多聚甲醛、20%蔗糖脫水、30%蔗糖脫水以備行切片用。

確定TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎達高峰的時間，后續(xù)研究都選取這個時間點。將選取的小鼠腸組織標(biāo)本一部分提取組織蛋白進行Western Blot 分析，檢測TNBS結(jié)腸炎模型中VPS4B 蛋白及active caspase-3、裂解多聚(ADP-核糖)聚合酶[cleaved poly(ADP-ribose)polymerase,cleaved PARP](兩種細胞凋亡指標(biāo))的表達水平。另一部分小鼠腸組織切片進行免疫組化及免疫熒光分析。

2 結(jié)果

2.1 VPS4B在CD 患者腸黏膜中的表達及定位 取CD 患者炎癥部位及正常對照人群的腸黏膜活檢組織，檢測VPS4B 的表達和定位。免疫組化結(jié)果顯示，VPS4B 在CD 患者炎癥部位腸組織中高表達，主要定位于腸上皮細胞的胞漿(圖1A)。Western Blot 結(jié)果也證實，VPS4B 在炎癥組織的表達高于正常組織；同時，磷酸化的p38(phosphorylated p38,p-p38)表達在炎癥組織中也升高(圖1B～C)。這結(jié)果提示VPS4B在CD 的作用可能與p38 有絲分裂原活化的蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase,p38 MAPK)信號通路相關(guān)。

圖1 VPS4B 在CD 患者和正常對照人群腸黏膜中的表達及定位

2.2 TNBS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型 TNBS 誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型的臨床表現(xiàn)和形態(tài)改變類似人類CD，是CD 的經(jīng)典動物模型[7]。體質(zhì)量變化、病理改變、組織學(xué)評分是該模型是否成功的重要評價指標(biāo)。結(jié)果顯示，與乙醇對照組相比，TNBS 灌腸的小鼠在第2 天開始出現(xiàn)體質(zhì)量下降，在第3 天達高峰。炎癥細胞浸潤、潰瘍形成、上皮細胞缺失、水腫、增厚結(jié)腸壁，組織學(xué)評分在第3 天高峰，共10 分(P＜0.05)，在灌腸后第5 天開始緩解，表明TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型構(gòu)建成功，并在第3 天達到最高峰。

2.3 VPS4B 在TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中的表達及定位 TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎在第3 天達高峰，因此在后續(xù)的研究均選取這個時間點。Western Blot 檢測TNBS 結(jié)腸炎模型中VPS4B 的蛋白表達水平，結(jié)果顯示，VPS4B 在TNBS 灌腸小鼠中的表達明顯高于乙醇灌腸小鼠(圖2A,P＜0.05)。為進一步證實Western Blot 的結(jié)果，使用免疫組化檢測TNBS 結(jié)腸炎模型VPS4B表達和分布，結(jié)果顯示，與乙醇對照組相比，VPS4B 在TNBS 造模組中表達增加，主要定位于腸上皮細胞的胞漿(圖2B)，這與前述Western Blot及CD 患者腸組織免疫組化的結(jié)果相似。進一步利用免疫熒光將VPS4B 與腸上皮細胞標(biāo)志物(E-cadherin)進行共定位分析，VPS4B 在TNBS 結(jié)腸炎模型中和E-cadherin 的共定位增加(圖2C)。表明VPS4B在TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中表達增加，主要定位在腸上皮細胞。

圖2 VPS4B 在TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中的表達

2.4 VPS4B 在TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中與腸上皮細胞的凋亡相關(guān) 研究[8]提示腸上皮細胞凋亡破壞了腸黏膜的完整性，并促進結(jié)腸炎發(fā)展。使用Western Blot 法分別檢測active caspase-3、cleaved PARP(兩種細胞凋亡指標(biāo))的表達變化，結(jié)果表明：active caspase-3、cleaved PARP 在TNBS 灌腸后的表達都顯著增加(圖3A,P＜0.05)，與VPS4B 的表達趨勢一致。p-p38 在TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎表達升高(圖3B，P＜0.05)，p38 MAPK 信號通路參與CD的發(fā)病進程。免疫熒光雙標(biāo)分析顯示在TNBS 結(jié)腸炎腸組織中，VPS4B 與active caspase-3 存在共定位(圖3C)，表明VPS4B 與腸上皮細胞的凋亡相關(guān)，可能通過p38 MAPK 信號通路發(fā)揮作用。

圖3 VPS4B 與TNBS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎模型中的腸上皮細胞凋亡表達

3 討論

CD 是一種原因不明的慢性復(fù)發(fā)性胃腸道炎癥性疾病，好發(fā)于末段回腸和右半結(jié)腸，但全消化道均可累及，患者需長期服用藥物治療，甚至手術(shù)治療，嚴(yán)重危害身心健康，影響生活質(zhì)量。近年來，CD 在我國的發(fā)病率明顯上升，但CD 的病因仍未明確，腸上皮細胞的凋亡和增殖的平衡失調(diào)導(dǎo)致上皮屏障功能的破壞，在該病的發(fā)病機制中有著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)在CD 中，VPS4B 參與腸上皮細胞的凋亡調(diào)節(jié)，其通過活化的p38 MAPK 信號通路發(fā)揮作用。

VPS4B 是與ATP 酶相關(guān)的、具有多種細胞活性AAA 類蛋白家族成員之一。VPS4B 是轉(zhuǎn)運必需內(nèi)吞體分選復(fù)合物機制組成部分之一[9]，是多囊泡體的形成以及多種膜受體的降解所必須的，包括表皮生長因子受體和胰島素受體。VPS4B 參與溶酶體降解途徑、細胞內(nèi)蛋白質(zhì)運輸、病毒出芽、胞質(zhì)脫落以及調(diào)控有絲分裂和細胞分裂的不同階段。但VPS4B 在CD 中的表達和可能的作用機制尚不清楚。

大量研究[10]證實，p38 MAPK 信號通路在腸道炎癥中有重要作用。p38 有4 個亞型，p38α、p38β、p38γ和p38δ。p38 基因位于炎癥性腸病易感區(qū)域3，p38是炎癥性腸病炎癥發(fā)生的重要激酶之一。p38 MAPK的活性在CD 活動期增高，p38 的活化可抑制腸上皮細胞增殖，促進腸上皮細胞凋亡[11]。p38α 在腸上皮細胞中缺失促進結(jié)腸炎發(fā)展，破壞了腸上皮細胞增殖與凋亡的動態(tài)平衡。然而，p38 調(diào)節(jié)CD 中腸上皮細胞凋亡具體的分子機制仍不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)在CD 患者中，VPS4B 表達在炎癥部位明顯高于非炎癥區(qū)域，且主要定位在胞漿。在TNBS 灌腸誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型中，VPS4B 的表達與主要凋亡指標(biāo)active caspase-3、cleaved PARP在腸上皮中的表達同步增高。免疫組化和免疫熒光雙標(biāo)分析均提示VPS4B 主要表達在腸上皮細胞中，免疫熒光還發(fā)現(xiàn)VPS4B 與active caspase-3 在腸上皮細胞中存在共定位，提示VPS4B 參與腸上皮細胞的凋亡過程。

但VPS4B 在CD 中是如何促進腸上皮細胞凋亡仍不清楚。與其他MAPK 相比，p38 MAPK 在炎癥性腸病患者的炎癥黏膜中活性最強。p38 MAPK 可以調(diào)控一些促炎因子的釋放，如腫瘤壞死因子-α 及白細胞介素[12]。p38α 在腸上皮細胞特異性缺失破壞腸道上皮的內(nèi)穩(wěn)態(tài)，加速小鼠結(jié)腸炎的進程。研究[13]表明，p38 活性抑制腸上皮細胞的增殖，促進其凋亡。表皮生長因子受體的活化引起腸上皮細胞的內(nèi)源性細胞凋亡是經(jīng)由p38α 依賴性Bax 的激活[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)VPS4B 在CD 患者的腸組織中表達增高，p-p38 也同樣增高。同時在小鼠模型中也得到證實，提示VPS4B 參與腸上皮細胞的凋亡，主要是通過p38 MAPK 信號通路。因此，推測VPS4B 在CD 的病理機制中發(fā)揮了重要作用。然而需進一步研究以闡明VPS4B 在這些生物學(xué)病變中的作用及機制，為CD臨床診斷和治療提供更深入更全面的理論依據(jù)。