顧王露，陳 莉,2**，周家名

(南通大學(xué)1 杏林學(xué)院醫(yī)學(xué)部，2 醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，南通 226000)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界上第六大最常見的癌癥和第四大癌癥相關(guān)死亡原因[1]。只有40%的早期或局部HCC 患者適合手術(shù)切除、肝移植、局部射頻消融，20%適合經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞(transcatheter arterial chemoembolization,TACE)等治療。因為缺乏有效早期診斷方法，約80%的患者在進(jìn)展晚期才被診斷。晚期肝癌預(yù)后差，中位總生存期僅為1～2 個月[2]，主要的死亡原因是腫瘤的過度增殖、浸潤、轉(zhuǎn)移同時又缺乏有效的干預(yù)手段。因此探索能調(diào)控腫瘤增殖和遷移的關(guān)鍵基因作為干預(yù)靶點，對改善肝癌患者的預(yù)后具有重要意義。

肝細(xì)胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)是目前已知生物活性最廣泛的生長因子之一，能刺激多種上皮和內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂、運動及促進(jìn)腎小管形態(tài)發(fā)生，在組織器官損傷修復(fù)、形態(tài)發(fā)生和腫瘤轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。HGF 可由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，通過旁分泌作用于靶細(xì)胞上的肝細(xì)胞生長因子受體(hepatocyte growth factor receptor,HGFR)引起靶細(xì)胞的功能變化。高親和性的HGF 的特異性受體是間充質(zhì)上皮轉(zhuǎn)換因子(mesenchymal epithelial transition factor,c-Met)，這是一種由c-Met 原癌基因編碼的蛋白產(chǎn)物，由二硫化物連接的異二聚體復(fù)合物組成，該復(fù)合物是一種跨膜單體，具有受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinase,RTK)活性，與多種癌基因產(chǎn)物和調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)，參與細(xì)胞信息傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架重排的調(diào)控，是影響細(xì)胞增殖、分化和運動的重要因素。HGF 與其特定受體c-Met 結(jié)合，后者位于肝細(xì)胞以旁分泌或自分泌的方式發(fā)揮作用。正由于HGF/c-Met 軸參與細(xì)胞增殖、運動、分化、侵襲、血管生成和凋亡[3]，因此HGF/c-Met 軸在正常肝臟生長、再生和保護(hù)中起著關(guān)鍵作用[4]。由于HGF/c-Met 軸在細(xì)胞增殖、遷移、存活、形態(tài)發(fā)生和上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-mesenchymal transition,EMT)等細(xì)胞行為中起著重要作用，所以在一些惡性腫瘤細(xì)胞中存在持續(xù)激活的c-Met 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[5-6]，可促進(jìn)腫瘤增殖轉(zhuǎn)移，與腫瘤的惡性進(jìn)展和不良預(yù)后有密切關(guān)系[7]。

本文采用小核酸干擾技術(shù)(small RNA interference,siRNA)下調(diào)肝癌細(xì)胞株(HepG2、Huh7)中c-Met 的表達(dá)，觀察敲除c-Met 基因?qū)Π┘?xì)胞的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及試劑 肝癌細(xì)胞株(HepG2、Huh7)及正常肝細(xì)胞(LO2)購自上海中山醫(yī)院肝癌研究所，保存于南通百奧邁科生物技術(shù)有限公司。DMEM 培養(yǎng)基及胎牛血清(fatal bovine serum,FBS)購自Gibco 公司；Trizol、RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及LipofectamineTM2000 購自Invitrogen 公司；SYBR Green 實時定量試劑盒購自羅氏公司；抗c-Met 抗體和羊抗鼠IgG-HRP 購自Abcam 公司。羊抗鼠IgG-TRITC 購自BOSTER 公司。3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-Htetrazolium bromide,MTT]染色液購自南京生興生物公司；Transwell 小室購自Corning 公司；siRNA 質(zhì)粒和實時定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR) 引物由百奧邁科生物技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 實驗細(xì)胞保存于南通百奧邁科生物技術(shù)有限公司。細(xì)胞生長于含10% FBS 的DMEM培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2加濕培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 構(gòu)建靶向c-Met 基因的siRNA 用PGPU6/GFP/Neo 質(zhì)粒構(gòu)建靶向c-Met 基因的siRNA(si-c-Met)及陰性對照非特異性序列的siRNA(si-NC)(表1)。篩選下調(diào)靶基因的有效si-c-Met 用于后續(xù)實驗。以si-NC 和未處理細(xì)胞作為實驗對照組。

表1 siRNA 序列

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)整其細(xì)胞密度為1×106個/mL，以1 mL/孔接種24 孔板中。參照LipofectamineTM2000 說明書進(jìn)行siRNA(各吸取適量的siRNA 于50 μL Opti-MEM 中，輕輕混勻，保證siRNA 終濃度為100 nmoL/L)轉(zhuǎn)染至HepG2 和Huh7肝癌細(xì)胞。

1.2.4 RT-qPCR 檢測靶基因mRNA 水平 離心收集對數(shù)生長期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞和未處理細(xì)胞，分別使用Trizol 試劑提取細(xì)胞總RNA；將2 μg 總RNA 逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA，根據(jù)SYBR Green 實時定量試劑盒說明書進(jìn)行RT-qPCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃20 s，55 ℃30 s，72 ℃30 s，共45 個循環(huán)；同時以GAPDH為內(nèi)參。進(jìn)行目的基因相對表達(dá)量的計算時使用2-△△Ct值法。c-Met 引物擴(kuò)增長度101 bp：上游引物為5′-GACAAGCATCT-TCAGTTAC-3′，下游引物為5′-TGACAATGTTGAG-AGGTT-3′；GAPDH 引物擴(kuò)增長度226 bp：上游引物為5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3′，下游引物為5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′。

1.2.5 Western Blot 檢測靶蛋白表達(dá) 將細(xì)胞接種于6 孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞融合度達(dá)70%～80%時收集各組細(xì)胞，用SDS 蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白，使用BCA 法測定蛋白濃度，并將蛋白裂解液進(jìn)行SDS-PAGE(5%積層膠，8%分離膠)電泳后，采用濕轉(zhuǎn)印儀以200 mA 恒流轉(zhuǎn)印2 h，將凝膠中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，用含5%脫脂奶粉的TBS 封閉液室溫封閉2 h，加入一抗(1∶1 000)37 ℃孵育2 h，再加入二抗(1∶2 000)37 ℃孵育2 h，使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence,ECL)法顯影。結(jié)果分析：以內(nèi)參基因作為內(nèi)對照，使用ImageJ 軟件分析目的條帶的灰度值，計算目的基因相對表達(dá)量=目的條帶灰度值/同一樣本內(nèi)參灰度值。

1.2.6 免疫熒光檢測靶蛋白的原位表達(dá) 收集對數(shù)生長期細(xì)胞鋪板24 h 后當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)50%～60%時用4%多聚甲醛固定30 min，0.5% Triton 透膜處理15 min，1% BSA 液封閉30 min，用稀釋好比例的一抗(1∶50)孵育，4 ℃過夜。加羊抗鼠IgG-TRITC 二抗(1∶100)室溫30 min。用1 μg/mL 的Hoechst 避光復(fù)染細(xì)胞，室溫孵育10 min，用抗熒光淬滅封片液封片，熒光顯微鏡下觀察，采集圖像。

1.2.7 MTT 法檢測細(xì)胞增殖能力 離心收集對數(shù)生長期的各組細(xì)胞，鋪96 孔板，細(xì)胞密度為5×104個/mL，每組4 個平行，100 μL/孔。每孔加入10 μL MTT，37 ℃避光放置4 h。加入150 μL/孔二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)，37 ℃放置10 min。吹打混勻后取120 μL 于另一干凈96 孔板中，并取120 μL DMSO 作為空白對照調(diào)零，酶標(biāo)儀上測吸光度(optical density,OD)，波長為490 nm。以時間為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.8 電鏡樣品制備 將滅菌后的小圓玻片放入24 孔板中，分別接種細(xì)胞，待細(xì)胞爬片密度約60%進(jìn)行轉(zhuǎn)染。加入2.5%的戊二醛4 ℃固定24 h。電鏡樣本自備由南通大學(xué)電鏡室協(xié)助完成。

1.2.9 Transwell 實驗檢測細(xì)胞侵襲能力 取對數(shù)生長期細(xì)胞接種于24 孔板，并且在Transwell 小室的上室和下室中分別加入100 μL 和600 μL DMEM完全培養(yǎng)基，37 ℃5%CO2孵育過夜。轉(zhuǎn)染48 h 后用DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞重懸，調(diào)整細(xì)胞密度至1×106/mL。24 h 后吸棄上下室的培養(yǎng)基，用棉簽輕輕擦拭上室的細(xì)胞，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)清洗后10%甲醇固定細(xì)30 s，將下室浸沒于0.2%的結(jié)晶紫溶液中，染色5 min，用鋒利刀片沿邊緣將小室的膜切下，并在倒置顯微鏡下計數(shù)穿膜移到下室的細(xì)胞，每張膜計數(shù)5 個不同視野(×250)并拍照。

1.2.10 統(tǒng)計學(xué)方法 每組實驗至少重復(fù)3 次。所有數(shù)據(jù)以表示，使用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。各組樣品間的比較采用t 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肝癌細(xì)胞中c-Met 的表達(dá) 用RT-qPCR、Western Blot 和免疫熒光染色檢測HepG2、Huh7 中c-Met 的表達(dá)，用正常肝細(xì)胞LO2 作為對照(圖1)。圖1 結(jié)果顯示，與LO2 相比，HepG2 和Huh7 細(xì)胞中c-Met mRNA 和蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)(P＜0.01)。免疫熒光染色顯示該基因蛋白表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞邊緣。該結(jié)果提示肝癌HepG2、Huh7 細(xì)胞中該基因明顯過表達(dá)。

圖1 c-Met 在肝癌細(xì)胞(HepG2 和Huh7)和肝細(xì)胞(LO2)中的表達(dá)

2.2 siRNA 有效下調(diào)癌細(xì)胞中c-Met 基因mRNA的表達(dá) si-c-Met 轉(zhuǎn)染HepG2 和Huh7 細(xì)胞后用RT-qPCR 的方法檢測篩選有效si-c-Met 敲降靶基因的效果。如圖2 所示，在HepG2 和Huh7 細(xì)胞中與轉(zhuǎn)染si-NC 組相比，轉(zhuǎn)染si-c-Met 后靶蛋白mRNA表達(dá)被siRNA 顯著下調(diào)(P＜0.05)，尤其是c-Met-siR3和c-Met-siR4 抑制效率達(dá)到85%。故在后續(xù)實驗中均選用c-Met-siR4。

圖2 c-Met-siR 下調(diào)HepG2(A)和Huh7(B)細(xì)胞靶基因mRNA的表達(dá)

2.3 下調(diào)c-Met 的表達(dá)能抑制HepG2、Huh7 細(xì)胞增殖 HepG2、Huh7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-c-Met 后經(jīng)MTT法檢測顯示細(xì)胞增殖水平下降(圖3)。與轉(zhuǎn)染si-NC組細(xì)胞的增殖能力比較，轉(zhuǎn)染si-c-Met 后HepG2 細(xì)胞增殖能力從24 h 開始下降(t=3.244,P=0.031 6)。轉(zhuǎn)染si-c-Met 后Huh7 增殖能力從48 h 開始下降(t=3.879,P=0.017 9)。

圖3 c-Met-siR 轉(zhuǎn)染HepG2(A)和Huh7(B)細(xì)胞后，細(xì)胞增殖能力下降(MTT 檢測)

2.4 掃描電鏡顯示HepG2、Huh7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-c-Met 后細(xì)胞表面形態(tài)的改變 掃描電鏡顯示HepG2、Huh7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-c-Met 后細(xì)胞體積縮小，表面皺縮，與鄰近細(xì)胞聯(lián)系減少，顯示發(fā)生凋亡趨勢。進(jìn)一步放大(×2 500)顯示在細(xì)胞表面?zhèn)巫銣p少、細(xì)而短，細(xì)胞間黏附減弱。相反轉(zhuǎn)染si-NC 組細(xì)胞體積較大，無明顯的凋亡趨勢；細(xì)胞偽足粗而豐富，細(xì)胞黏附(圖4)。

2.5 HepG2、Huh7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-c-Met 后細(xì)胞遷移能力下降 Transwell 遷移實驗結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染si-c-Met 后HepG2 細(xì)胞遷移均數(shù)(101.3±27.06)顯著低于si-NC 組(323.7±5.132)。Huh7 細(xì)胞細(xì)胞遷移均數(shù)(115.0±21.66)顯著低于si-NC 組(282.0±15.72)(均P＜0.001)。提示敲降c-Met 后癌細(xì)胞遷移能力減弱(圖5)。

圖4 c-Met-siR 轉(zhuǎn)染HepG2(A)和Huh7(B)細(xì)胞后，細(xì)胞表面形態(tài)變化

圖5 c-Met-siR 轉(zhuǎn)染HepG2(A)和Huh7(B)細(xì)胞后，癌細(xì)胞的侵襲能力減弱(Transwell 遷移實驗)

3 討論

HGF 最早在1984 年由日本的中村敏從大鼠血漿中得到，其結(jié)構(gòu)是全部728 個氨基酸的肝素結(jié)合糖蛋白，由間質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，通過旁分泌作用于鄰近細(xì)胞，并與細(xì)胞表面受體結(jié)合激活RTK 活性，作為較強(qiáng)的肝細(xì)胞有絲分裂原[8]促進(jìn)上皮細(xì)胞的細(xì)胞運動。研究[3-7]還揭示其具有運動、損傷修復(fù)、凋亡等其他的功能。

c-Met 是一種極為重要的原癌基因，最早是C.S.COOPER 等[9]在研究應(yīng)用化學(xué)致癌物(誘導(dǎo))的人骨肉瘤Hos 細(xì)胞系時，克隆出的一個具有轉(zhuǎn)化活性的片段，并將其鑒定為TRP 位點的一個融合基因，其融合產(chǎn)生了一個活躍的編碼配體HGFR，定名為c-Met，作為一種跨膜蛋白，具有RTK 活性。被其配體激活后可產(chǎn)生廣泛的細(xì)胞反應(yīng)，包括增殖、存活、血管生成、創(chuàng)傷愈合、擴(kuò)射、游走、浸潤和器官發(fā)生[9]。c-Met原癌基因的RNA 存在于人類幾種細(xì)胞中，如消化道上皮、神經(jīng)元、肝細(xì)胞和造血細(xì)胞[10]。完整和正常的HGF/c-Met 信號是維持細(xì)胞正常氧化還原穩(wěn)態(tài)的基礎(chǔ)，并能抑制N-亞硝基二甲胺誘導(dǎo)的肝癌[11]。c-Met的二聚化和自體磷酸化是HGF/c-Met 信號通路的關(guān)鍵因素。已知在多種人類癌癥(腎、肺、肝、乳腺癌、結(jié)腸、甲狀腺、卵巢和胰腺)中存在HGF/c-Met 信號通路的異常激活，如c-Met 過度表達(dá)、擴(kuò)增、與其他配體結(jié)合或異常高的HGF 水平，導(dǎo)致腫瘤的啟動和進(jìn)展[12]。c-Met 在前列腺、結(jié)直腸、乳房、惡性黑色素瘤、肝細(xì)胞和子宮頸上的過度表達(dá)與分期、轉(zhuǎn)移潛能和預(yù)后不良有相關(guān)性。在結(jié)直腸癌中c-Met 的mRNA 拷貝數(shù)的增加與腫瘤的侵襲程度相關(guān)。在乳腺癌中c-Met 的表達(dá)增加與生存時間短相關(guān)，而且相對于人表皮生長因子受體-2、表皮生長因子受體和激素受體狀態(tài)是獨立的預(yù)后指標(biāo)。c-Met 在癌耐藥性中起著關(guān)鍵作用[13]。此外c-Met 可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子A 表達(dá)能促進(jìn)腫瘤血管形成[14-15]?？傊琧-Met 的異常表達(dá)參與轉(zhuǎn)移和侵襲并與較差的臨床轉(zhuǎn)歸相關(guān)。由于c-Met 在腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起一定的作用，現(xiàn)在已成為藥物治療很有潛力的研究靶標(biāo)。

S.TAKEO 等[16]研究表明HCC 中c-Met 擴(kuò)增頻率很低(1/20)，但D.TAVIAN 等[17]發(fā)現(xiàn)在20%～48%HCC 標(biāo)本中有c-Met 的擴(kuò)增或過表達(dá)，而且癌中c-Met 水平高于癌周肝組織中。在HCC 中過度表達(dá)c-Met 比突變和擴(kuò)增更常見，雖然并非所有的HCC 都與HGF 或c-Met 過表達(dá)有關(guān)[18]，但高表達(dá)c-Met 的HCC 患者比低表達(dá)或無表達(dá)c-Met 的患者生存時間更短[19]；因此HGF/c-Met 軸被認(rèn)為是HCC 患者腫瘤侵襲性和預(yù)后的生物標(biāo)志物[3]。本文采用RT-qPCR、Western Blot 檢測發(fā)現(xiàn)在HCC 細(xì)胞中c-Met 基因mRNA 和蛋白明顯高表達(dá)，免疫熒光染色顯示該基因蛋白表達(dá)位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞邊緣。腫瘤細(xì)胞通常產(chǎn)生生長因子和受體的自主分泌。已發(fā)現(xiàn)與癌形成和發(fā)展有關(guān)的不同細(xì)胞類型之間出現(xiàn)異型信號(非自主分泌)。已有關(guān)于c-Met 蛋白的相關(guān)信號通過非自分泌機(jī)制促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移的報道。在體內(nèi)非自分泌信號與自主分泌信號進(jìn)行的是條件不均衡的競爭，惡性腫瘤的非內(nèi)部生長因子對轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重大影響。正常細(xì)胞有能力通過減少c-Met 的表達(dá)來抵消HGF 的作用。而腫瘤細(xì)胞中c-Met 過表達(dá)，并呈現(xiàn)高水平的自體磷酸化，c-Met 過表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對HGF 更敏感、更強(qiáng)烈，更具侵襲性，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。本文構(gòu)建的siRNA 能有效下調(diào)HepG2、Huh7 細(xì)胞中c-Met 基因mRNA 和蛋白的表達(dá)。其中si-c-Met4 的抑制效率最佳，敲降靶基因c-Met 達(dá)到85%，以此用于后續(xù)實驗。下調(diào)c-Met 基因后經(jīng)MTT 法檢測顯示細(xì)胞增殖水平下降。掃描電鏡顯示HepG2、Huh7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-c-Met 后細(xì)胞體積縮小，表面皺褶，顯示發(fā)生凋亡趨勢。細(xì)胞表面絲狀偽足形成減少。已知在腫瘤侵襲中瘤細(xì)胞向轉(zhuǎn)移器官表面靠攏→腫瘤細(xì)胞用偽足貼在表面與內(nèi)皮細(xì)胞黏連→腫瘤細(xì)胞借偽足從細(xì)胞間隙而移動到達(dá)基底層。偽足運動的本質(zhì)是胞內(nèi)細(xì)胞骨架微絲迅速重組裝使細(xì)胞的形狀輪廓隨偽足的伸縮而變形，即微絲的變化牽引細(xì)胞運動。細(xì)胞偽足密度的差異，可能是細(xì)胞微絲組裝的差異造成的，這一差異決定了細(xì)胞運動的能力和細(xì)胞移動的方向。正如Transwell 侵襲實驗顯示癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-c-Met 后遷移能力減弱。因此敲降癌細(xì)胞中c-Met 可使其惡性的生物學(xué)行為得到遏制。

本研究結(jié)果提示HCC 細(xì)胞(HepG2、Huh7)中c-Met 高表達(dá)與癌細(xì)胞增殖、遷移和偽足形成有關(guān)。下調(diào)c-Met 可抑制細(xì)胞的增殖、遷移，增加細(xì)胞發(fā)生凋亡，減少細(xì)胞偽足形成，干預(yù)腫瘤進(jìn)展[20]。因此，靶向HGF/c-Met 軸是干預(yù)HCC 最有前途的探索之一[21]。通過研究將更深入地了解HCC 的侵襲的機(jī)制及關(guān)鍵信號通路，以利于阻斷HCC 惡性進(jìn)程，為臨床尋找更有效的和新的靶向治療位點，將改善HCC 患者的臨床療效和預(yù)后。