陸袁洲，龔 偉，許智惠，陳 楚，陸 齊

(1 南通大學(xué)附屬通州醫(yī)院心血管內(nèi)科，南通 226300；2 江蘇省人民醫(yī)院心血管內(nèi)科；3 南通大學(xué)附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科)

糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)是糖尿病患者最常見的并發(fā)癥，是在異常糖代謝的基礎(chǔ)上出現(xiàn)的一系列心臟損傷[1]。早期主要表現(xiàn)為心臟舒張功能異常，晚期則會(huì)出現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)異常并伴膠原纖維沉積，極大影響了心臟射血功能，且易發(fā)展為充血性心力衰竭，是糖尿病患者發(fā)生猝死的重要原因之一[2]。相關(guān)流行病學(xué)研究[3]也顯示，死于這種心血管疾病的糖尿病患者逐年增加，但目前尚無針對(duì)性的治療策略。因此，如能有效緩解這種心血管相關(guān)并發(fā)癥，延緩甚至逆轉(zhuǎn)DCM 進(jìn)程，可成為改善糖尿病患者預(yù)后的重要方法。

盡管目前DCM 的具體發(fā)病機(jī)制尚不明確，但相關(guān)研究[4]提示DCM 的發(fā)生發(fā)展可能涉及多個(gè)方面，如代謝障礙、氧化應(yīng)激損傷、鈣調(diào)節(jié)異常等。而近期研究[5-8]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)體液系統(tǒng)的異常與影響DCM 發(fā)展的多個(gè)方面均有關(guān)，可能是促進(jìn)DCM 的發(fā)展與惡化的重要原因。一方面，DCM 患者往往表現(xiàn)為交感神經(jīng)主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)[5]，增加的兒茶酚胺水平與過量活性氧的釋放密切相關(guān)[6]，并會(huì)誘導(dǎo)纖維化的發(fā)展；另一方面，DCM 患者伴有的腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)的異常激活又會(huì)降低細(xì)胞對(duì)葡萄糖的敏感性[7]，并促進(jìn)水鈉潴留進(jìn)一步加重心功能障礙進(jìn)展[8]。因此針對(duì)這種異常的神經(jīng)體液進(jìn)行持久有效的調(diào)節(jié)，可能成為改善DCM 的新策略。

腎去交感神經(jīng)術(shù)(renal denervation,RDN)是心血管領(lǐng)域的一項(xiàng)新型神經(jīng)體液調(diào)節(jié)技術(shù)。臨床研究[9]已證實(shí)RDN 可通過消融腎臟交感神經(jīng)長期有效地降低血壓。而近期基礎(chǔ)研究[10-11]還發(fā)現(xiàn)，RDN 在調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活性的同時(shí)還可有效抑制RAAS 系統(tǒng)活性，并可在此基礎(chǔ)上有效改善心功能與心肌重構(gòu)。因此RDN 在DCM 方面可能具有潛在治療價(jià)值。但目前RDN 在DCM 方面的治療效果與相關(guān)機(jī)制尚不明確。因此，本研究旨在通過構(gòu)建DCM 模型大鼠，探討RDN 對(duì)DCM 的影響并進(jìn)一步探索其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 28 只清潔級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠購自南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體質(zhì)量180～200 g，于南通大學(xué)心內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室大鼠飼養(yǎng)室分籠飼養(yǎng)，每4 只大鼠一籠，室溫18～22 ℃，相對(duì)濕度45%～65%。自由攝取標(biāo)準(zhǔn)水和食物，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后開始造模。

1.2 主要試劑 戊巴比妥鈉，20%苯酚，青霉素鈉，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)，液氮，4%多聚甲醛，鏈尿佐霉素(streptozotocin,STZ)(索來寶生物技術(shù)有限公司,北京)。去甲腎上腺素(noradrenaline,NA)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)試劑盒(華美生物工程有限公司，武漢)。SDS-PAGE 凝膠試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司，上海)。TUNEL 凋亡檢測(cè)試劑盒(賽維爾生物科技有限公司，武漢)。半胱天冬酶-3(caspase 3,C3)抗體，活性半胱天冬酶-3(cleaved caspase-3,CC3)抗體(Proteintech 公司，美國)。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)抗體，絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase,AKT)抗體，磷酸化絲氨酸/蘇氨酸激酶(phospho-serine/threonine kinase,pAKT)抗體，糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)抗體，磷酸化糖原合成酶激酶-3β(phospho-glycogen synthase kinase-3β,pGSK-3β)抗體(Cell Signaling Technology 公司，美國)。

1.3 主要儀器 Vevo2100 彩色多普勒超聲(Visual Sonics 公司,加拿大)；羅氏活力型血糖儀(羅氏診斷公司,德國)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)分組及DCM 造模 28 只SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(8 只)，DCM 模型組(10 只)和RDN 治療組(10 只)。對(duì)照組給予標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，DCM 組及RDN 組給予高脂高熱量飼料喂養(yǎng)，4 周后3 組大鼠均行腹腔葡萄糖耐量及腹腔胰島素耐量試驗(yàn)。DCM組及RDN 組出現(xiàn)胰島素抵抗的大鼠給予30 mg/kg STZ 的檸檬酸緩沖液(pH4.5)腹腔注射；對(duì)照組給予同等體積的檸檬酸緩沖液腹腔注射。1 周后，檢測(cè)大鼠空腹血糖，連續(xù)2 次空腹血糖≥11.1 mmol/L 的大鼠于STZ 注射后8 周行心超檢測(cè)，左室收縮功能減退提示DCM 造模成功。本實(shí)驗(yàn)方案通過南通大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查。

1.4.2 RDN 手術(shù) DCM 造模成功后，RDN 組大鼠行RDN 手術(shù)。手術(shù)大鼠予2%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，俯臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。在一側(cè)肋脊角下方2 橫指處鈍性分離筋膜及肌肉，直至暴露腎臟及腎周結(jié)締組織，再進(jìn)一步分離腎血管周圍的疏松結(jié)締組織和脂肪組織，以充分暴露腎血管及腎門。通過玻璃分針離斷可視腎神經(jīng)后，予苯酚沿著腎動(dòng)脈走形反復(fù)涂抹1 min，充分破壞腎神經(jīng)，再予生理鹽水擦拭。同樣的操作去除另一側(cè)腎交感神經(jīng)，逐層縫合肌肉及皮膚，肌肉注射青霉素預(yù)防感染。其余兩組大鼠行假手術(shù)，暴露腎血管后不破壞腎神經(jīng)。

1.4.3 心臟超聲檢測(cè) STZ 注射后12 周，行超聲心動(dòng)圖檢測(cè)大鼠心功能。通過異氟烷誘導(dǎo)大鼠麻醉并維持，將大鼠仰臥位置于操作臺(tái)上，固定四肢，心前區(qū)備皮、涂抹耦合劑，通過超高分辨率小動(dòng)物超聲影像系統(tǒng)(Vevo2100)記錄大鼠瞬時(shí)心率并測(cè)量以下指標(biāo)：左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter,LVDd)、左室收縮末期內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter,LVDs)、左室短軸縮短率(left ventricular fractional shortening,LVFS)、左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction,LVEF)等。

1.4.4 心臟組織病理檢測(cè) 完成心超檢測(cè)后，通過腹腔注射過量戊巴比妥鈉處死所有大鼠。完整取下心臟、腎臟組織。將每只大鼠的一半心臟及腎臟置于-80 ℃冰箱保存，另一部分心臟在4%多聚甲醛中浸泡48 h 后經(jīng)脫水及石蠟包埋制成切片，進(jìn)行Masson 染色。將病理切片置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察并攝片，并通過Image-Pro Plus 6.0 軟件計(jì)算膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volume fraction,CVF)。

1.4.5 心臟組織凋亡檢測(cè) 通過TUNEL 免疫熒光法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡。將大鼠心肌組織固定脫水后制備冰凍切片，進(jìn)行TUNEL 染色后用熒光猝滅封片液封片，再置于熒光倒置顯微鏡下觀察并分析，每張切片數(shù)5 個(gè)視野并計(jì)算凋亡細(xì)胞的個(gè)數(shù)，計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率(cardiac myocyte apoptosis rate,CMAR)。

1.4.6 腎臟組織NA 水平檢測(cè) 通過ELISA 檢測(cè)腎臟組織NA 水平。取大鼠心肌組織稱重后剪碎，用9倍勻漿介質(zhì)研磨，再將研磨液3 000～4 000 r/min 離心10 min，取上清制備成10%的組織勻漿，放4 ℃冰箱，待測(cè)。按照ELISA 試劑盒說明書，加樣、孵育及顯色后，在酶標(biāo)儀上于450 nm 處測(cè)各孔OD 值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度和OD 值做標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出樣本NA 濃度。

1.4.7 心臟組織蛋白水平檢測(cè) 通過Western Blot法檢測(cè)心臟組織中C3、CC3、PI3K、AKT、pAKT、GSK-3β及pGSK-3β 的蛋白表達(dá)水平。取大鼠心肌組織提取蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度后，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠分離，并轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。封閉后分別孵育相應(yīng)抗體(C3、CC3、PI3K、AKT、pAKT、GSK-3β 及pGSK-3β)過夜。洗膜后室溫加入二抗孵育1 h，顯色、曝光。通過ImageJ 軟件分析灰度值，并計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.4.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0 軟件處理分析數(shù)據(jù)，采用GraphPad Prism 5 軟件作圖，連續(xù)變量采用表示。使用單因素方差分析進(jìn)行多組間的比較，使用Newman-Keuls 檢驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RDN 有效性評(píng)估 STZ 注射后12 周，RDN 組大鼠腎臟NA 水平顯著低于對(duì)照組及DCM 組(均P＜0.05,圖1)，提示RDN 手術(shù)有效降低腎臟交感神經(jīng)活性，RDN 術(shù)有效。

2.2 RDN 改善DCM 大鼠心臟收縮功能 STZ 注射后12 周，與對(duì)照組大鼠相比，DCM 組大鼠的收縮功能減退，LVEF 及LVFS 均顯著下降，LVDs 及LVDd均顯著升高(均P＜0.05,表1)；而RDN 組的收縮功能改善(圖2)，LVEF 及LVFS 顯著高于DCM 組，LVDs及LVDd 均顯著低于DCM 組(均P＜0.05,表1)。

圖1 3 組大鼠腎臟NA 水平統(tǒng)計(jì)圖

表1 RDN 改善DCM 大鼠心功能()

表1 RDN 改善DCM 大鼠心功能()

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05；與DCM 組相比，#P＜0.05。

圖2 3 組大鼠二維超聲心動(dòng)圖

2.3 RDN 改善DCM 大鼠心肌纖維化 與對(duì)照組(圖3A)相比，心臟Masson 染色可見DCM 組大鼠纖維化區(qū)域(藍(lán)色)明顯增加(圖3B)，RDN 組大鼠較DCM 大鼠纖維化區(qū)域有所減少(圖3C)。且與DCM組相比，RDN 組大鼠左心室CVF 顯著下降[(13.94±2.02)% vs (21.44±3.14)%,P＜0.05,圖3D]。

圖3 3 組大鼠心臟組織的Masson 染色圖

2.4 RDN 改善DCM 大鼠心肌細(xì)胞凋亡 心臟TUNEL 免疫熒光檢測(cè)可見DCM 組大鼠的心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于對(duì)照組[(14.28±2.41)% vs (4.12±1.13)%,P＜0.05]，而RDN 組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率則顯著低于DCM 組[(8.62±1.63)% vs (14.28±2.41)%,P＜0.05,圖4A～D]。同時(shí)，與DCM 組相比，RDN 組大鼠心臟組織中凋亡相關(guān)蛋白CC3 的相對(duì)表達(dá)量也顯著降低(P＜0.05,圖4E～F)。

2.5 RDN 調(diào)節(jié)DCM 大鼠心臟PI3K/AKT/GSK-3β通路 Western Blot 結(jié)果顯示，與對(duì)照組大鼠相比，DCM 組大鼠心臟組織中PI3K、pAKT 及pGSK-3β的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.05)；而RDN 組大鼠的心臟組織中PI3K、pAKT 及pGSK-3β 的表達(dá)水平則顯著高于DCM 大鼠(P＜0.05,圖5)。

3 討論

本研究通過構(gòu)建DCM 大鼠模型，發(fā)現(xiàn)RDN 有效改善了DCM 大鼠的心功能與心室重構(gòu)，緩解了DCM 引起的心肌纖維化與心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)上調(diào)了DCM 大鼠心臟組織PI3K/AKT/GSK-3β 通路的蛋白表達(dá)。

圖4 3 組大鼠心臟組織凋亡情況

圖5 3 組大鼠心臟組織PI3K/AKT/GSK-3β 通路蛋白表達(dá)水平

DCM 是糖尿病時(shí)長期代謝異常引起的心肌細(xì)胞凋亡增多及一系列病理生理改變，盡管目前臨床上尚無明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)，但普遍表現(xiàn)為心肌重塑引起的心臟結(jié)構(gòu)改變以及收縮功能下降引起的心功能改變[12]。本研究觀察到，STZ 注射后12 周，DCM 組大鼠心臟組織凋亡水平明顯升高，并出現(xiàn)明顯的心肌間質(zhì)纖維化，同時(shí)宏觀上表現(xiàn)為心室內(nèi)徑增加以及射血分?jǐn)?shù)的顯著下降，與其他相關(guān)研究結(jié)果[13-14]一致，提示大鼠出現(xiàn)心臟損傷，DCM 造模有效。而在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步觀察到RDN 治療在調(diào)節(jié)交感神經(jīng)活性的同時(shí)，有效緩解了DCM 大鼠心功能下降的趨勢(shì)，顯著改善了DCM 引起的心肌纖維化與心肌細(xì)胞凋亡，改善了心室結(jié)構(gòu)的異常。共同提示RDN 可有效延緩DCM 的進(jìn)展，可能成為改善DCM 預(yù)后的潛在治療策略。

PI3K/AKT 信號(hào)通路參與人類的腫瘤形成、代謝疾病等多種病理生理過程。相關(guān)研究[15]發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT 信號(hào)通路可以通過促進(jìn)糖原合成、刺激葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)來調(diào)節(jié)胰島素的代謝與功能，在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。而近年來的研究[16]發(fā)現(xiàn)，該通路的異常還會(huì)影響心肌細(xì)胞的代謝以及凋亡等活動(dòng)，被證實(shí)與心力衰竭關(guān)系密切。因此，PI3K/AKT 通路的異常可能是促進(jìn)DCM 的發(fā)展的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，DCM 大鼠心肌組織中PI3K/AKT 水平顯著下降，而RDN 有效改善DCM 心功能的同時(shí)也提高了PI3K/AKT 的表達(dá)水平，提示PI3K/AKT 可能是RDN 發(fā)揮抗DCM 作用的潛在信號(hào)途徑。GSK-3β 是PI3K/AKT 下游的重要激酶，其活性升高會(huì)促進(jìn)線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablility transition pore,mPTP)開放，發(fā)揮促凋亡的作用。而PI3K/AKT途徑的激活可磷酸化GSK-3β，抑制其活性，減少凋亡水平[17]。與之一致，本研究發(fā)現(xiàn)RDN 在激活PI3K/AKT 通路的同時(shí)，有效提高了pGSK-3β 的水平，并在此基礎(chǔ)上顯著降低了DCM 引起的心肌細(xì)胞凋亡。因此，RDN 可能通過PI3K/AKT/GSK-3β 途徑發(fā)揮抗凋亡及心臟保護(hù)作用。

綜上所述，RDN 可有效改善DCM 模型大鼠的心功能及心臟重構(gòu)，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)PI3K/AKT/GSK-3β 通路抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。