吳琴燕 陳宏州 李冬冬 張文文 楊紅福 莊義慶

關(guān)鍵詞氟唑菌酰羥胺;超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜;麥穗;消解

氟唑菌酰羥胺是瑞士先正達(dá)公司開發(fā)的新型殺菌劑，為琥珀酸脫氫酶抑制劑，其分子式為C16H16Cl3F2N302，分子量為426.67。該藥劑主要通過影響病原菌的呼吸鏈電子傳導(dǎo)系統(tǒng)，阻礙其能量代謝，從而抑制病原菌的生長，具有廣譜、高效的特點(diǎn)，適用于多種作物。

據(jù)報(bào)道氟唑菌酰羥胺對小麥赤霉病菌具有較高的活性，并具有提高小麥產(chǎn)量的作用。近年來，氟唑菌酰羥胺陸續(xù)在美國、加拿大、阿根廷等國家登記上市。美國環(huán)境保護(hù)署規(guī)定，氟唑菌酰羥胺在小麥中的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)為0.3μg/g。由于該藥劑在國內(nèi)剛剛登記上市，目前暫未規(guī)定其最大殘留限量和檢測方法。氟唑菌酰羥胺懸浮液的高效液相色譜分析方法及其在西瓜中的殘留動(dòng)態(tài)已有報(bào)道，但其在小麥中的殘留分析暫無報(bào)道。

本文引入超聲輔助提取技術(shù)提取揚(yáng)花期和收獲期麥穗中氟唑菌酰羥胺，并建立其UPLC-MS/MS分析方法，研究氟唑菌酰羥胺在麥穗中的消解動(dòng)態(tài)，掌握其消解規(guī)律，為小麥安全生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

三重四級桿串聯(lián)液相質(zhì)譜聯(lián)用儀（Agilent1290，ABsciex 4500），安捷倫科技有限公司;XPl05DR型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司;AWL-020I-P超純水系統(tǒng)，艾科浦儀器有限公司;KQ_250E型超聲波清洗器，昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司;H2050R型醫(yī)用離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

甲醇和乙腈（色譜純，美國默克公司），甲酸銨（≥98%，德國CNW公司），質(zhì)譜用水為屈臣氏蒸餾水，氟唑菌酰羥胺（≥98%）標(biāo)準(zhǔn)樣品和20%氟唑苯酰羥胺懸浮劑（SC）購自先正達(dá)生物科技有限公司。

1.2田間試驗(yàn)

試驗(yàn)于2017年和2018年4月中旬在江蘇省句容市鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)院行香園區(qū)試驗(yàn)田進(jìn)行，小麥品種為‘鎮(zhèn)麥13，試驗(yàn)地水、肥條件良好，常規(guī)田間管理。

采用20%氟唑菌酰羥胺SC按照推薦用量8g/667m2（有效成分）分別施藥1次和2次。首次施藥時(shí)間為揚(yáng)花初期。2次施藥的問隔期為7d。每處理3次重復(fù)，隨機(jī)區(qū)組排列。小區(qū)面積20m2，小區(qū)問設(shè)保護(hù)行，以清水處理作為空白對照。分別于施藥后1h及1、3、5、7、10、15、14、20、25、30d按照對角線5點(diǎn)取樣法取樣，每點(diǎn)取麥穗10株，麥穗在40℃下烘干粉碎后于-20℃保存，待測。

1.3樣品分析方法建立

液相色譜柱為Agilent C18色譜柱（100mm×2.1mm，1.7μm）。流動(dòng)相為含0.1%甲酸的5mmol/L甲酸銨溶液（A）一甲醇（B），75%甲醇等度洗脫10min。流速為200μL/min，柱溫40℃;進(jìn)樣量1μL。

質(zhì)譜檢測條件：正離子模式（ESI+），檢測方式為多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM），氣簾氣：35 psi;噴霧電壓：5 500 V;霧化溫度：450℃;霧化氣：40 psi;輔助氣：40 psi;其他MRM參數(shù)見表1。

1.4樣品提取方式和提取條件的優(yōu)化

以2017年施藥1次麥穗樣品為材料進(jìn)行提取方式和條件的優(yōu)化。分別取施藥后10 d（揚(yáng)花期）和施藥后30d（收獲期）麥穗樣品，冷凍干燥粉碎后準(zhǔn)確稱取1g，加入20mL乙腈，在室溫條件下，分別采用振蕩和超聲破碎兩種方式提取30min，比較兩種提取方式下氟唑菌酰羥胺的提取量，選擇最優(yōu)提取方式進(jìn)一步對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。

乙腈濃度篩選：在30℃條件下，按液固比100 mL/g，乙腈濃度分別在0、20%、40%、60%、80%和100%的條件下超聲提取15 min，檢測氟唑菌酰羥胺的提取量;液固比篩選：采用最適宜的乙腈濃度，在30℃條件下，分別采用液固比10、25、50、100 mL/g和200mL/g超聲提取15min，檢測氟唑菌酰羥胺的提取量;溫度篩選：采用最適宜的乙腈濃度和液固比，分別在30、40、50、60。C和70℃條件下超聲提取15min，檢測氟唑菌酰羥胺的提取量。

1.5樣品前處理

采用優(yōu)化的條件提取不同時(shí)問采集的麥穗樣品中的氟唑菌酰羥胺，以及收獲的麥穗經(jīng)人工脫殼并粉碎后獲得的麥粒樣品中的氟唑菌酰羥胺。

2結(jié)果與分析

2.1 LC-MS方法的建立

用50%乙腈溶液溶解標(biāo)樣，考察氟唑菌酰羥胺特征峰在正、負(fù)離子掃描模式下的電離強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)正離子掃描模式下的電離強(qiáng)度明顯高于負(fù)離子模式。以[M+H]+作為母離子進(jìn)行子離子掃描分析，選擇豐度較大的2個(gè)離子作為特征碎片離子，如圖1所示，根據(jù)特征碎片離子對去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使得離子對的信號最強(qiáng)。

采用UPLC常用的C18色譜柱，考察了以5mmol/L甲酸銨為水相，分別以甲醇和乙腈為有機(jī)相時(shí)的色譜分離情況。發(fā)現(xiàn)以甲醇為有機(jī)相時(shí)響應(yīng)值較高，基線平穩(wěn)，水相中加入0.1%的甲酸，響應(yīng)值提高l倍。經(jīng)過反復(fù)試驗(yàn)，可在5min內(nèi)獲得良好的分離效果。圖1和圖2分別為50ng/mL氟唑菌酰羥胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)譜掃描圖和MRM色譜圖。

氟唑菌酰羥胺標(biāo)樣在0.05～50 ng/mL濃度范圍內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=35 654w+26 164.89，R2=0.998 77，在此范圍內(nèi)，本試驗(yàn)建立的方法的檢出限為0.03ng/mL，定量限為0.15ng/mL。

2.2樣品前處理方式和條件優(yōu)化

試驗(yàn)首次施藥時(shí)小麥處于揚(yáng)花期，試驗(yàn)過程麥穗從綠逐漸變黃。揚(yáng)花期麥穗主要基質(zhì)以葉綠素為主，收獲期麥穗主要基質(zhì)為淀粉、糖、蛋白質(zhì)等?；|(zhì)不同，提取條件可能存在差異，因此分別針對揚(yáng)花期和收獲期麥穗進(jìn)行提取條件優(yōu)化。

2.2.1提取方式的優(yōu)化

圖3為超聲和振蕩兩種提取方式對氟唑菌酰羥胺提取量的影響，揚(yáng)花期和收獲期氟唑菌酰羥胺提取量均在提取15 min時(shí)達(dá)到較高水平。揚(yáng)花期樣品超聲處理后，最大提取量從振蕩提取的1.69μg/g提高至2.28μg/g;收獲期樣品從振蕩提取的0.68μg/g提高至0.85μg/g，說明超聲條件更有利于氟唑菌酰羥胺的溶出，由于超聲波輻射可產(chǎn)生破碎、混合攪拌、空化作用等多級效應(yīng)，從而使分子運(yùn)動(dòng)速度和頻率加快，使物料內(nèi)部組織和結(jié)構(gòu)崩潰，從而促進(jìn)了氟唑菌酰羥胺溶出。

2.2.2超聲提取條件的優(yōu)化

從圖4可知，乙腈濃度對氟唑菌酰羥胺提取量有明顯影響，乙腈濃度在40%～80%之間時(shí)提取效果較好，其中濃度為60%時(shí)，揚(yáng)花期和收獲期樣品的提出量均為較高，且維持在穩(wěn)定水平，分別為3.34μg/g和1.12μg/g，當(dāng)乙腈濃度超過80%，氟唑菌酰羥胺的提取量明顯下降，這可能是由于氟唑菌酰羥胺為非極性化合物，當(dāng)乙腈溶液濃度低時(shí)溶液極性相對較大，不利于氟唑菌酰羥胺的溶出，適量水的溶脹作用可以促進(jìn)氟唑菌酰羥胺的溶出，而當(dāng)乙腈濃度過大，水的溶脹作用減弱，使氟唑菌酰羥胺提取量下降。溫度和液固比對氟唑菌酰羥胺提取量無明顯影響。

2.3回收率和標(biāo)準(zhǔn)偏差

在空白樣品中分別添加4個(gè)濃度水平的標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行提取，標(biāo)準(zhǔn)溶液采用60%的乙腈配制而成，每個(gè)濃度平行測定3次，在液固比為20 mL/g的條件下，超聲破碎15min。由表2可知，揚(yáng)花期樣品平均回收率為80.3%～115.8%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.4%～10.5%;收獲期樣品平均回收率為99.8%～109.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.6%～8.5%，揚(yáng)花期和收獲期樣品均符合檢測要求。

2.4氟唑菌酰羥胺消解動(dòng)態(tài)

20%氟唑菌酰羥胺SC以8 g/667 m2的用量于2017年和2018年連續(xù)兩年在麥穗上施用，施藥1次的原始積累量分別為37.4μg/g和47.2μg/g，施藥2次的原始積累量分別為60.4μg/g和89.0μg/g。氟唑菌酰羥胺在麥穗上的殘留動(dòng)態(tài)如圖5所示。在麥穗上的消解率與時(shí)間的關(guān)系符合一級動(dòng)力學(xué)模型，施藥1次的半衰期約為3.2 d，施藥2次的半衰期為3.49～4.35 d，不同年份對氟唑菌酰羥胺消解半衰期無明顯影響。

收獲的麥穗中，2017年和2018年施藥1次氟唑菌酰羥胺含量分別為0.98μg/g和0.62μg/g，施藥2次分別為2.66μg/g和0.89μg/g，而2年試驗(yàn)收獲的麥穗脫殼后，麥粒中氟唑菌酰羥胺含量均約為0.12μg/g，說明氟唑菌酰羥胺大部分集中于麥穗表皮，本試驗(yàn)收獲的麥粒中氟唑菌酰羥胺含量均未超過美國規(guī)定的最大殘留限量。

3結(jié)論

本文采用超聲提取，對提取溶劑、溫度、液固比3個(gè)主要提取條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了氟唑菌酰羥胺在麥穗中的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，該方法適合不同時(shí)期麥穗中氟唑菌酰羥胺的提取和檢測，方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和回收率均符合農(nóng)藥殘留檢測要求。2017年和2018年兩年在江蘇句容消解動(dòng)態(tài)試驗(yàn)表明，氟唑菌酰羥胺在麥穗中消解速率較快，屬于易降解農(nóng)藥（T1/z<30 d），收獲后麥粒殘留量約為0.12μg/g，低于美國規(guī)定的氟唑菌酰羥胺在小麥上的最大殘留限量（0.3μg/g）。