趙子婧 蘆鈺 田文 王玉璽 溫常龍 李健強(qiáng) 徐秀蘭 羅來鑫

關(guān)鍵詞微滴數(shù)字PCR;real_time PCR;種子帶菌檢測;西瓜嗜酸菌;丁香假單胞菌黃瓜致病變種

我國是世界蔬菜種植大國，種植面積、總產(chǎn)量和出口量等均居世界第一。葫蘆科植物共有118屬825種，廣泛分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，其中不乏多種重要的蔬菜作物。我國葫蘆科植物共有32屬154種35變種，常見的有西瓜、甜瓜、黃瓜、南瓜、西葫蘆等。根據(jù)世界糧農(nóng)組織（FAO）統(tǒng)計結(jié)果，近十年我國西瓜、甜瓜和黃瓜的種植面積和產(chǎn)量逐年增加，種植面積和產(chǎn)量均居世界第一。然而瓜類細(xì)菌性病害尤其是果斑病和角斑病的頻頻發(fā)生嚴(yán)重影響了我國葫蘆科作物的生產(chǎn)。

西瓜嗜酸菌Acidovorax citrulli（Ac），是引起果斑病的病原細(xì)菌，為重要的世界檢疫性有害生物。西瓜嗜酸菌為革蘭氏陰性菌，主要分為兩個組群，其中GroupⅡ群主要侵染西瓜，GroupⅠ群主要侵染除西瓜外的其他作物，如甜瓜、黃瓜、葫蘆等。果斑病發(fā)病初期在子葉和果實(shí)上都表現(xiàn)為水浸狀的斑點(diǎn)，在發(fā)病后期，真葉上有黃色暈圈的褐色小斑，在果實(shí)上會導(dǎo)致果皮龜裂，果肉腐爛。

丁香假單胞菌黃瓜致病變種Pseudomonas sy-ringae pv.1achrymans（Psl），是引起角斑病的病原細(xì)菌，革蘭氏陰性，主要寄主為黃瓜，也可侵染甜瓜、西瓜等葫蘆科作物，以及部分茄科作物和豆科作物。角斑病發(fā)病初期為水浸狀病斑，隨后會受到葉脈的限制呈多角形或者不規(guī)則形病斑，果實(shí)上為水浸狀病斑，可導(dǎo)致果實(shí)潰爛，溢出白色菌膿。

兩種病原菌侵染甜瓜初期，葉片癥狀較為相似，難以區(qū)分，而果斑病造成西瓜、甜瓜等果實(shí)水浸狀腐爛的損失更大。由于兩種病原細(xì)菌均可通過種子傳播，對種子進(jìn)行帶菌檢測，減少因帶菌種子引起病害流行是種傳病害防控的首要環(huán)節(jié)。

微滴數(shù)字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）是可以實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確定量的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，被稱為第三代PCR技術(shù)。該技術(shù)將含有DNA或RNA的PCR體系分成數(shù)萬個油包水的納米級微滴，每個微滴里可能不含或含1個甚至多個核酸分子，每個微滴都作為一個獨(dú)立的PCR體系，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，對每個微滴反應(yīng)進(jìn)行檢測，有熒光信號的微滴判讀為1，沒有熒光信號的微滴判讀為0，根據(jù)泊松分布原理及陽性微滴的個數(shù)與比例即可得出靶標(biāo)分子的起始拷貝數(shù)。即利用有限稀釋，PCR反應(yīng)和泊松分布實(shí)現(xiàn)核酸濃度的絕對定量，也可高度靈敏和準(zhǔn)確地對低濃度的核酸進(jìn)行絕對定量。與熒光定量PCR相比，ddPCR技術(shù)具有更高的靈敏度和特異性，可實(shí)現(xiàn)無需外部標(biāo)準(zhǔn)的絕對定量，簡化了計算。目前ddPCR技術(shù)廣泛用于生物醫(yī)學(xué)、基因表達(dá)分析、拷貝數(shù)變異分析、轉(zhuǎn)基因食品檢測等，在植物病害的檢測方面應(yīng)用很少。最早在2014年，Dreo等利用ddPCR首次檢測了兩種檢疫性植物病原菌——梨火疫病菌Erwinia amylovora和馬鈴薯青枯病菌Ralstonia solanacearum，隨后Zhao等利用ddPCR技術(shù)對柑橘潰瘍病進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與real-time PCR相比，ddPCR的靈敏性、重復(fù)性均高于reabtime PCR，并降低了銅離子對反應(yīng)的干擾。此外，Wang等利用ddPCR通過收集雙通路熒光信號實(shí)現(xiàn)了對轉(zhuǎn)基因水稻的兩個靶標(biāo)基因的檢測。

本研究建立了應(yīng)用ddPCR技術(shù)同時檢測瓜類細(xì)菌性果斑病和角斑病的技術(shù)方法，并與熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)行平行測試，比較分析了兩種方法對種子帶菌檢測的靈敏性與穩(wěn)定性。

1材料與方法

1.1供試菌株及培養(yǎng)條件

丁香假單胞菌黃瓜致病變種P.syringae pv.lachrymans菌株NCPPB543（后文簡稱丁香假單胞菌）分離自黃瓜，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)種子病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供;西瓜嗜酸菌A.citrulli由北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心提供，其中，菌株Xul7-15分離自西瓜種子，分型為Ⅱ型;菌株Xu201807，分離自甜瓜發(fā)病果實(shí)，分型為工型。兩個菌株分別用于制備帶菌的西瓜和甜瓜種子。菌株Xul7-15用于混合菌懸液和混合DNA的制備。菌株懸浮于15%甘油，保存在-80℃冰箱中。菌株活化采用PF培養(yǎng)基（蛋白胨20g/L，瓊脂15g/L，甘油10mL/L，1 mol/L磷酸氫二鉀14 mL/L，1mol/L硫酸鎂14 mL/L）于28℃培養(yǎng)2d。

分別將濃度為10cfu/mL的西瓜嗜酸菌和丁香假單胞菌進(jìn)行10倍梯度稀釋，系列濃度菌懸液，將制備好的菌懸液凍存于-20℃。

1.2 ddPCR引物探針組合

參考相關(guān)文獻(xiàn)，前期測試了2組西瓜嗜酸菌引物探針與1組丁香假單胞菌引物探針不同組合，選擇A-1為檢測西瓜嗜酸菌的引物探針，P-0為檢測丁香假單胞菌的引物探針（表1）。所有引物探針均由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.3 ddPCR檢測體系與反應(yīng)程序

ddPCR采用Qx200全自動微滴式數(shù)字PCR系統(tǒng)（北京匯力宏業(yè)生物科技有限公司），包含Qx200微滴自動生成儀、Qx200微滴讀取儀以及QuantaSoft數(shù)據(jù)分析軟件。反應(yīng)總體系24止，保存。

1.4 real-time PCR檢測體系與反應(yīng)程序

1.5西瓜嗜酸菌和丁香假單胞菌菌懸液樣品制備

1.5.1等濃度混合菌懸液

將濃度分別為10cfu/mL的西瓜嗜酸菌和丁香假單胞菌菌懸液等體積混合，得到菌濃度為10cfu/mL的等濃度混合菌懸液，按同樣的方法制備菌濃度為10～10cfu/mL的等濃度混合菌懸液。以混合菌懸液為模板，分別用real-time PCR和ddPCR進(jìn)行檢測。

1.5.2非等濃度混合菌懸液

在106 cfu/mL西瓜嗜酸菌菌懸液中分別加入等體積的10～10cfu/mL的丁香假單胞菌菌懸液，得到高濃度西瓜嗜酸菌和低濃度丁香假單胞菌的非等濃度混合菌懸液;同樣地，制備高濃度丁香假單胞菌和低濃度西瓜嗜酸菌的非等濃度混合菌懸液。以非等濃度混合的菌懸液為模板，分別用real-timePCR和ddPCR進(jìn)行檢測。

1.6西瓜嗜酸菌和丁香假單胞菌DNA樣品制備

1.6.1 DNA提取

從PF培養(yǎng)基上分別刮取西瓜嗜酸菌和丁香假單胞菌，用無菌水制備成菌懸液。用DNA提取試劑盒（北京全式金EasyPure Bacteria Genomic DNAKit）分別提取西瓜嗜酸菌和丁香假單胞菌的DNA，測定DNA濃度并稀釋至22.8 ng/μL。

1.6.2兩種細(xì)菌等濃度DNA混合樣品制備

將兩個靶標(biāo)的DNA分別梯度稀釋，各得到22.8～2.28×10ng/μL的8個DNA樣品，凍存于一20℃。取等體積等濃度兩種菌的DNA樣品混合均勻，得到混合DNA濃度為22.8～2.28×10ng/μL的混合樣品。以混合DNA為模板，分別用real-timePCR和ddPCR進(jìn)行檢測。

1.6.3兩種細(xì)菌非等濃度DNA混合樣品制備

在22.8 ng/vL西瓜嗜酸菌DNA樣品中分別加入等體積的2.28～2.28×10ng/μL的丁香假單胞菌DNA樣品，得到高濃度西瓜嗜酸菌和低濃度丁香假單胞菌的非等濃度混合DNA樣品;同樣地，制備高濃度丁香假單胞菌和低濃度西瓜嗜酸菌的非等濃度混合DNA樣品。以非等濃度混合的DNA為模板，分別用real-time PCR和ddPCR進(jìn)行檢測。

1.7帶菌西瓜和甜瓜種子樣品制備及檢測

1.7.1西瓜帶菌種子制備

以經(jīng)檢測確認(rèn)未攜帶西瓜嗜酸菌和丁香假單胞菌的西瓜種子（‘國蜜101）作為樣品制備的供試材料。取兩份西瓜種子（各50 g）分別完全浸泡在10cfu/mL的西瓜嗜酸菌和丁香假單胞菌菌懸液中，28℃，120 r/min培養(yǎng)2 h，取出種子，自然晾干2～3 d，獲得分別攜帶西瓜嗜酸菌和丁香假單胞菌的西瓜種子。將分別攜帶西瓜嗜酸菌和丁香假單胞菌的西瓜種子按照粒數(shù)比0：0、1：0、1：1、1：5、1：10、5：1、10：1、0：1（均為實(shí)際混入的粒數(shù)）混入健康種子中，得到樣本總量為100粒/份與500粒/份的種子樣品各8份。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，共準(zhǔn)備100粒/份與500粒/份的樣品各24份。

1.7.2西瓜種子樣品帶菌檢測

以1：4的比例在檢測樣品中加入PBST洗滌緩沖液，用均質(zhì)器激烈拍打1 min后，28℃120 r/min培養(yǎng)4 h，之后放置冰箱4℃培養(yǎng)過夜，第2天再次拍打1min，用雙層紗布過濾，收集洗滌液于50 mL離心管中。以4000r/min低速離心10min，收集上清液，再以10000r/min高速離心10min，棄上清液，用1mL無菌水重懸底部沉淀，得到種子洗滌液原液，分別用real-time PCR和ddPCR進(jìn)行檢測。

1.7.3帶菌甜瓜種子樣品制備及檢測

甜瓜種子（‘京玉6號）接菌方法、種子樣品制備、檢測方法與西瓜種子相同。

2結(jié)果與分析

2.1 ddPCR和real-time PCR檢測兩種病原菌混合菌懸液樣品

用ddPCR和real-time PCR對西瓜嗜酸菌和丁香假單胞菌等濃度混合菌懸液進(jìn)行檢測，結(jié)果如表2所示。混合菌懸液濃度為10cfu/mL時，real-time PCR可以同時檢測到兩個靶標(biāo)菌，濃度為10cfu/mL時可檢測到混合菌懸液中的西瓜嗜酸菌，但未檢測到等濃度的丁香假單胞菌;而ddPCR可以同時檢測兩個靶標(biāo)菌的混合菌懸液濃度為10du/mL，可檢測到10cfu/mL混合菌懸液中的西瓜嗜酸菌，但未檢測到等濃度的丁香假單胞菌。對于等濃度混合菌懸液，ddPCR的檢測靈敏度比real-time PCR高1個數(shù)量級。

非等濃度混合菌懸液的檢測結(jié)果如表3所示。當(dāng)西瓜嗜酸菌菌懸液濃度恒定為10cfu/mL時，real-time PCR能檢測到的丁香假單胞菌的最低濃度為10du/mL，而ddPCR為10cfu/mL;當(dāng)丁香假單胞菌懸液濃度恒定為10du/mL時，real-time PCR能檢測到的西瓜嗜酸菌的最低濃度為10cfu/mL，而ddPCR為10cfu/mL。采用real-time PCR檢測，當(dāng)某種菌含量高時，另一種低濃度病原菌的檢測靈敏度受到抑制，而ddPCR不受高濃度靶標(biāo)的干擾，提高了對低濃度靶標(biāo)的檢測靈敏度。

2.2 ddPCR和real-time PCR檢測兩種病原菌混合DNA樣品

以西瓜嗜酸菌和丁香假單胞菌等濃度混合DNA為模板的檢測結(jié)果如表4所示。Real-timePCR可以同時檢測到兩種靶標(biāo)菌的最低DNA濃度為;ddPCR可檢測的最低DNA濃度為ddPCR的檢測靈敏度比real-time PCR高1個數(shù)量級。

西瓜嗜酸菌和丁香假單胞菌非等濃度DNA混合樣品的檢測結(jié)果如表5所示。在22.8ng/μL西瓜嗜酸菌DNA中混入等體積不同濃度的丁香假單胞菌的DNA時，real-time PCR可在1 000：1比例下檢測到低濃度的丁香假單胞菌DNA，而ddPCR檢測限達(dá)到10 000：1;在22.8 μg丁香假單胞菌DNA中混入等體積不同濃度的西瓜嗜酸菌的DNA時，real-timePCR和ddPCR對低濃度的西瓜嗜酸菌DNA的檢測限也分別為1000：1和10000：1。ddPCR對低濃度靶標(biāo)的檢測靈敏度是real-time PCR的10倍。

2.3 ddPCR和real-time PCR檢測攜帶兩種病原菌的種子樣品

人工接菌的西瓜、甜瓜種子經(jīng)浸提、平板培養(yǎng)檢測，獲得西瓜、甜瓜帶菌種子，帶菌量穩(wěn)定在10～10cfu/粒。當(dāng)檢測樣本容量為100粒或500粒未添加人工接菌種子的健康對照時，real-time PCR和ddPCR對西瓜、甜瓜種子的檢測結(jié)果均為陰性（表6）。

在健康西瓜種子中混入接菌種子的樣品檢測結(jié)果如表6所示：在100粒西瓜種子樣品中ddPCR可以穩(wěn)定地檢測到1%的帶菌種子，且3次重復(fù)結(jié)果一致;而對于同一個樣品real-time PCR未能得到3次重復(fù)一致的陽性結(jié)果。當(dāng)保持西瓜嗜酸菌帶菌率為1%，增加攜帶丁香假單胞菌的種子數(shù)到5粒或者10粒時，ddPCR均可檢測到帶菌率低的西瓜嗜酸菌及帶菌率高的丁香假單胞菌（5%～10%），同樣地，丁香假單胞菌帶菌率為1%，而西瓜嗜酸菌帶菌率為5%～10%，采用ddPCR仍可同時檢測到兩種菌。但是real-time PCR對帶菌率差異大的樣品檢測結(jié)果并不穩(wěn)定，未能每次都檢測到帶菌率為1%的西瓜種子，尤其是對丁香假單胞菌的檢測重復(fù)性較差，當(dāng)檢測樣品中攜帶西瓜嗜酸菌與丁香假單胞菌的種子粒數(shù)比大于5：1時，real-time PCR 3次重復(fù)都未能檢出丁香假單胞菌。