王艷 晉玲 申培增 呂嬌嬌

關(guān)鍵詞枸杞褐斑病;枸杞小黑梨孢;生物學(xué)特性

枸杞屬茄科Solanaceae落葉灌木，主要以果實(shí)人藥，具滋肝補(bǔ)腎、益精明日之功效;根皮亦可入藥，俗稱(chēng)地骨皮，具涼血除蒸、清肺降火之功效。枸杞主要分布于我國(guó)寧夏、甘肅、內(nèi)蒙古、新疆等省區(qū)。甘肅省白銀、酒泉、武威、金昌和張掖5市發(fā)展為枸杞主產(chǎn)區(qū)，年種植面積在3萬(wàn)～4萬(wàn)hm。但是隨著栽培面積的不斷擴(kuò)大，枸杞病害發(fā)生日益嚴(yán)重，成為制約其產(chǎn)量和品質(zhì)的一大因素。

枸杞褐斑?。ú≡瓰镾tigmella lycii X.R.Chen&Yan Wang）是2010年課題組在甘肅省景泰縣進(jìn)行枸杞病害調(diào)查時(shí)發(fā)現(xiàn)的一種新病害，癥狀主要表現(xiàn)為在葉片、葉柄及花蕾上產(chǎn)生圓形、近圓形褐色至灰褐色病斑，嚴(yán)重時(shí)，病斑相互連接，引起大量落葉和落果。據(jù)調(diào)查，2010年該病害在白銀市的景泰草窩、靖遠(yuǎn)五合、靖安等鄉(xiāng)鎮(zhèn)，發(fā)病率95%～98%，嚴(yán)重度2～4級(jí)，減產(chǎn)22%～25%，損失嚴(yán)重。該病最早于5月下旬開(kāi)始發(fā)病，發(fā)病初期主要從葉緣開(kāi)始形成褐色凹陷斑塊，7月-9月降雨多，田間濕度大，病原菌再侵染頻繁，病害蔓延迅速。病害持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，可一直持續(xù)至枸杞果實(shí)采收期。其病原枸杞小黑梨孢S.lycii為目前小黑梨孢屬Stigmella全世界報(bào)道的第3個(gè)種，在調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，該菌在越冬前的落葉中和離體培養(yǎng)條件下均可形成子囊殼和子囊孢子，即該菌的有性態(tài)，課題組通過(guò)對(duì)該菌的系統(tǒng)發(fā)育地位分析表明，該菌為子囊菌門(mén)格孢腔菌目格孢腔菌科真菌。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于枸杞小黑梨孢的生物學(xué)特性、寄主范圍以及引起的病害情況等均無(wú)相關(guān)研究報(bào)道。因此，本研究通過(guò)離體培養(yǎng)的方法測(cè)定了枸杞小黑梨孢在不同培養(yǎng)基、溫度、pH、光照條件、相對(duì)濕度及不同營(yíng)養(yǎng)條件下的生物學(xué)特性，為確定枸杞褐斑病在田間侵染和擴(kuò)散的氣象條件、病害的發(fā)生發(fā)展規(guī)律及制定綜合防治措施提供一定的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌種

2016年自甘肅省景泰縣草窩鄉(xiāng)大田采集具有典型癥狀的枸杞褐斑病葉，經(jīng)PDA分離培養(yǎng)，鏡檢確定為Stigmella lycii，純化后接種使健康枸杞葉片發(fā)病的病菌，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2生物學(xué)特性測(cè)定

1.2.1不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

在生長(zhǎng)20 d的菌落邊緣打取菌餅（d=7mm）接種于以下11種供試培養(yǎng)基：1%枸杞葉（果）煎汁（取100g‘寧杞1號(hào)枸杞葉或果于1000mL水中煮沸10min，過(guò)濾，濾液加水補(bǔ)足1000mL，加入14g瓊脂）、1%枸杞葉煎汁+PDA（馬鈴薯200g，葡萄糖10g，1%枸杞葉煎汁1000mL，瓊脂14g）、1%枸杞果煎汁+PDA（馬鈴薯200g，葡萄糖10g，1%枸杞果煎汁1000mL，瓊脂14g）、淀粉培養(yǎng)基（可溶性淀粉10g，水1000mL）、燕麥培養(yǎng)基（OA）、PDA、PSA、WA、Richard、Czapek培養(yǎng)基和玉米粉蔗糖培養(yǎng)基，每處理3皿，置于25℃±1℃光暗各12h交替條件下培養(yǎng)。菌絲生長(zhǎng)量測(cè)定采用十字交叉法，每隔2d測(cè)定一次菌落直徑（菌落直徑=兩次直徑平均值一接種菌餅直徑）。14d后計(jì)測(cè)產(chǎn)孢量，在菌落半徑一半處打取菌餅（d=7mm）5塊，置于盛有5mL蒸餾水的試管中，用玻棒搗碎，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)測(cè)單位面積子囊孢子產(chǎn)孢量，重復(fù)5次，求平均值。

1.2.2溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

將菌餅接種于PDA平板上，分別置于5、10、15、20、25、30、35℃下培養(yǎng)，菌絲生長(zhǎng)量及產(chǎn)孢量的測(cè)定方法同1.2.1。選用凹玻片懸滴法測(cè)定孢子萌發(fā)率，配制子囊孢子（培養(yǎng)菌菌齡30d）懸浮液和分生孢子（自然菌）懸浮液，將孢子懸浮液滴加在潔凈的蓋玻片中央，在其四周涂上少量凡士林，然后將其覆蓋在凹玻片上，每隔1.5h測(cè)定一次孢子萌發(fā)率，直至10.5h孢子萌發(fā)率不再增長(zhǎng)時(shí)，共測(cè)定6次。

1.2.3光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

將菌餅接種于PDA平板上，分別置于25℃連續(xù)光照、光暗12h交替及連續(xù)黑暗條件下培養(yǎng)，菌絲生長(zhǎng)量及產(chǎn)孢量測(cè)定方法同1.2.1。采用凹玻片懸滴法測(cè)定孢子萌發(fā)率，分別置于20℃連續(xù)光照、光暗1.5h交替及連續(xù)黑暗條件下培養(yǎng)，每隔1.5h測(cè)定一次孢子萌發(fā)率。

1.2.4 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)的影響

采用NaOH和HCl將PDA培養(yǎng)基的pH調(diào)整為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，將菌餅分別接種于上述PDA平板上，25℃下培養(yǎng)。用檸檬酸一磷酸二氫鉀緩沖液配制pH為4.51、5.58、6.49、7.00、7.41、8.39、9.19的孢子懸浮液，20℃下凹玻片懸滴法培養(yǎng)。菌絲生長(zhǎng)量及產(chǎn)孢量的測(cè)定方法同1.2.1。

1.2.5濕度對(duì)孢子萌發(fā)的影響

將孢子懸浮液均勻涂抹于載玻片上，在室溫下自然干燥，用小容器調(diào)節(jié)法，以硫酸控制相對(duì)濕度，濕度設(shè)置為70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99.5%，以100%飽和濕度為對(duì)照，共9個(gè)處理，20℃下培養(yǎng)。菌絲生長(zhǎng)量及產(chǎn)孢量的測(cè)定方法同1.2.1。

1.2.6營(yíng)養(yǎng)對(duì)孢子萌發(fā)的影響

測(cè)定的營(yíng)養(yǎng)物共計(jì)有6種：葡萄糖、枸杞葉片、枸杞果實(shí)、馬糞、土壤（馬糞和田問(wèn)土壤收集于枸杞褐斑病菌標(biāo)樣采集地）和尿素。按照1g營(yíng)養(yǎng)物加入5、10mL和20mL蒸餾水的比例依次配制1：5、1：10、1：20濃度的營(yíng)養(yǎng)液。枸杞葉片（果實(shí)）榨出液：取1g葉片（果實(shí)）加入不同體積的蒸餾水，在預(yù)冷的研缽中研磨成不同濃度的枸杞葉片（果實(shí)）榨出液。馬糞浸漬液和土壤浸漬液：將1g馬糞（土壤）與不同體積的蒸餾水混合，300r/min充分振蕩10min，后靜置30min。取上清液配制孢子懸浮液，20℃下凹玻片懸滴法培養(yǎng)，其他同1.2.1。

2結(jié)果與分析

2.1病原菌的培養(yǎng)特性

表1結(jié)果表明：病菌在各種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢，適溫下于最適培養(yǎng)基（1%枸杞葉煎汁+PDA）上，8d后菌落直徑2.8cm;菌落生長(zhǎng)以1%枸杞葉煎汁+PDA.玉米粉蔗糖培養(yǎng)基、1%枸杞果煎汁+PDA最好，14d菌落直徑分別可達(dá)4.5、4.4、4.2cm，PDA、1%枸杞葉煎汁、OA、PSA次之，在Richard和WA上病菌不生長(zhǎng)。病菌除在1%枸杞葉煎汁、1%枸杞葉煎汁+PDA、1%枸杞果煎汁+PDA.PDA和OA培養(yǎng)基上產(chǎn)生孢子外，在其他培養(yǎng)基上均未產(chǎn)孢，在1%枸杞葉煎汁上產(chǎn)孢量最大，為8.9×10個(gè)/cm。

在PDA培養(yǎng)基上，菌落生長(zhǎng)速度為0.28 cm/d，菌落微隆起，淡黃褐色，邊緣不整齊，氣生菌絲白色，稀疏，后期密生大量黑色小顆粒，即病菌的子囊殼（圖la）;在OA培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)速度為0.21 cm/d，菌落平鋪，氣生菌絲非常稀疏，后期產(chǎn)生大量子囊殼，埋生或半埋生于培養(yǎng)基中（圖1b），PSA、1%枸杞果煎汁+PDA和1%枸杞葉煎汁+PDA培養(yǎng)性狀同PDA;在1%枸杞葉煎汁培養(yǎng)基上，生長(zhǎng)速度為0.20cm/d，氣生菌絲稀疏，灰白色，絨狀，層層疊起，子囊殼埋生或半埋生于培養(yǎng)基中（圖1c）;在玉米粉蔗糖培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)速度為0.31cm/d，但是菌絲非常稀疏，僅在培養(yǎng)基表面擴(kuò)展，在其余培養(yǎng)基上病菌僅在原菌餅上產(chǎn)生白色絮狀菌絲。子囊孢子萌發(fā)時(shí)每個(gè)小細(xì)胞都能長(zhǎng)出芽管（圖1f）。

2.2病原菌的生物學(xué)特性

2.2.1溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢及孢子萌發(fā)的影響

該菌在10～30℃范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，最適溫度為25℃（表2）。病菌生長(zhǎng)較緩慢，在25℃下，14d菌落直徑4.5cm，而30℃時(shí)僅為0.13cm，表明高溫能抑制該菌正常生長(zhǎng)發(fā)育。在20～25℃下病菌可以產(chǎn)孢，適宜產(chǎn)孢溫度為25℃，在此溫度下產(chǎn)孢量高達(dá)0.9×10個(gè)/cm，與其他溫度下的產(chǎn)孢量存在顯著差異。子囊孢子和分生孢子分別在5～30℃和0～35℃可以萌發(fā)，20℃和25℃分別為其適宜萌發(fā)溫度，萌發(fā)最高溫度為30℃和35℃。該菌孢子萌發(fā)速度較快，最適溫度下10h萌發(fā)率達(dá)90%以上。由此可見(jiàn)，該菌菌絲生長(zhǎng)較緩慢，即病菌在葉片上擴(kuò)展速度較慢，而孢子萌發(fā)速度較快，有利于初侵染和再侵染，且子囊孢子萌發(fā)適溫較分生孢子的低5℃，適宜于越冬后初春引起初侵染。

2.2.2光照對(duì)菌落生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

表4結(jié)果表明，連續(xù)光照條件有利于菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，培養(yǎng)14d后，產(chǎn)孢量達(dá)5.7×10個(gè)/cm，與其他處理具有顯著差異;表5結(jié)果表明，在光暗交替條件下，子囊孢子萌發(fā)率最高，連續(xù)光照條件下，分生孢子萌發(fā)率量高，10.5 h萌發(fā)率分別為93.5%和91.0%。連續(xù)光照有利于菌落生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和分生孢子萌發(fā)，但光暗交替有利于子囊孢子萌發(fā)。

2.2.3 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢和孢子萌發(fā)的影響

表6結(jié)果表明：病菌生長(zhǎng)適宜的pH范圍較寬，在pH 4.0～10.0范圍內(nèi)均能生長(zhǎng)，pH6.5時(shí)生長(zhǎng)最快，14 d菌落直徑達(dá)4.8cm，菌落在堿性條件下生長(zhǎng)較好，pH為9.0時(shí)菌落直徑4.1cm，顯著大于pH 5.0的3.5 cm;在pH為6.0～7.0時(shí)可以產(chǎn)孢，其余pH條件下均不產(chǎn)孢。

表7結(jié)果表明：子囊孢子在pH 4.5～9.2范圍內(nèi)均可萌發(fā)，pH7.0時(shí)萌發(fā)率最高，達(dá)93%，堿性條件下萌發(fā)率均達(dá)83%以上，酸性條件下萌發(fā)率除6.5以外均在80%以下。分生孢子在中性條件下萌發(fā)率較高，pH7.0萌發(fā)率為93.3%，菌絲的生長(zhǎng)和子囊孢子萌發(fā)以偏堿性條件為好，而分生孢子萌發(fā)以中性偏酸條件為好。

2.2.4濕度對(duì)孢子萌發(fā)的影響

表8結(jié)果表明，子囊孢子在相對(duì)濕度95%～99.5%和水滴中均可萌發(fā)，以在對(duì)照水滴中萌發(fā)最好，達(dá)91.7%，與其他處理均有顯著差異，相對(duì)濕度99.5%條件下的子囊孢子萌發(fā)率為15.7%，相對(duì)濕度90%以下子囊孢子不萌發(fā)。分生孢子在相對(duì)濕度75%～99.5%和水滴中均可萌發(fā)，以在對(duì)照水滴中萌發(fā)最好，達(dá)到97.3%，在99.5%的相對(duì)濕度下，萌發(fā)率43.3%，相對(duì)濕度70%時(shí)分生孢子不萌發(fā)，因此初春雨水較多的氣候條件有利于病害完成初侵染。

2.2.5營(yíng)養(yǎng)對(duì)孢子萌發(fā)的影響

結(jié)果表明（圖2），尿素對(duì)子囊孢子萌發(fā)具有強(qiáng)烈的抑制作用。蒸餾水中，10.5h子囊孢子萌發(fā)率為93%，在供試的葡萄糖、葉片、果實(shí)、土壤不同濃度的營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)枸杞小黑梨孢孢子萌發(fā)具有一定的促進(jìn)作用，子囊孢子萌發(fā)速率高于蒸餾水中，7.5h孢子萌發(fā)率即可達(dá)到90%。

枸杞小黑梨孢子囊孢子在不同的營(yíng)養(yǎng)液中的萌發(fā)速率趨勢(shì)較一致，從子囊孢子在蒸餾水、葡萄糖（1：10）、葉片榨出液（1：20）3種處理中的萌發(fā)速度來(lái)看（圖3），在4.5～7.5h萌發(fā)最快，4.5h萌發(fā)率在30%左右，7.5h可達(dá)到80%以上，7.5～9h萌發(fā)變慢，9h以后萌發(fā)率不再增長(zhǎng)。說(shuō)明4.5～7.5h是子囊孢子萌發(fā)的最快時(shí)期，這與溫度、濕度等試驗(yàn)中的結(jié)果一致。分生孢子的萌發(fā)速率與此相同。

3討論

深入研究病原菌的生物學(xué)特性及發(fā)病流行條件，可為病害防治提供較完善科學(xué)的理論依據(jù)。本研究結(jié)果表明，枸杞褐斑病發(fā)生后，造成大量的落葉落果，病原菌在落葉中可形成子囊殼和子囊孢子越冬，子囊孢子的萌發(fā)最適溫度比分生孢子萌發(fā)最適溫度低5℃，適宜于早春越冬后的子囊孢子的萌發(fā)和侵染，造成病害始發(fā)。在25℃，田間有露水、雨后天晴或灌溉后田間濕度大的條件下，分生孢子4.5h萌發(fā)率在30%左右，7.5h可達(dá)到80%，因此，在枸杞生長(zhǎng)期，田間病害擴(kuò)展蔓延迅速。分生孢子萌發(fā)溫度范圍為5～37℃，最適溫度為25℃，在35℃的高溫下，10.5h后，分生孢子也有9.3%可以萌發(fā)，并且研究發(fā)現(xiàn)中性偏堿環(huán)境下適宜枸杞褐斑病菌生長(zhǎng)，我國(guó)枸杞多種植在北方高溫干旱地區(qū)，土壤多為鹽堿地，因此田問(wèn)病原菌再侵染頻繁，病害持續(xù)時(shí)問(wèn)長(zhǎng)，蔓延擴(kuò)展速度快。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，枸杞小黑梨孢在甘肅省景泰縣主要以菌絲體及子囊殼在地表和病殘?bào)w上越冬，因此，在夏末冬初，清理田園，將病葉病果等病殘組織集中燒毀或深埋，減少來(lái)年初侵染源，是防治該病發(fā)生和擴(kuò)散的重要措施。在枸杞栽培管理過(guò)程中要注意種植地的灌溉和通風(fēng)情況，通過(guò)降低環(huán)境中的溫度和濕度來(lái)降低枸杞褐斑病的發(fā)病率，從而提高枸杞的產(chǎn)量和質(zhì)量?？傊ㄟ^(guò)研究枸杞小黑梨孢的體外生物學(xué)特性，對(duì)該病害的后續(xù)研究以及田問(wèn)防治提供了重要的參考。