許艷 李冉 宋健 王丹 周雷 李俊嬌 張丹丹 陳捷胤 戴小楓 楊星勇

關(guān)鍵詞大麗輪枝菌;植物激素;酵母雙雜交;cDNA文庫(kù);互作蛋白

黃萎病是由大麗輪枝菌Verticillium dahliae引起的世界性真菌病害，每年造成棉花、馬鈴薯、蔬菜等農(nóng)作物損失數(shù)十億美元，嚴(yán)重威脅農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全。感染黃萎病的植物通常表現(xiàn)出葉片萎蔫、黃化、卷曲或壞死癥狀，維管束變褐，并隨著病程進(jìn)展最終枯萎死亡。

大麗輪枝菌分泌大量具有毒力的胞外蛋白是成功侵染寄主的重要策略之一，如其分泌的細(xì)胞壁降解酶類在侵染寄主過(guò)程中通常參與降解細(xì)胞壁的作用，表現(xiàn)為毒力功能。另外一類分泌蛋白則參與了病原與寄主互作過(guò)程，如大麗輪枝菌的無(wú)毒因子Avel能夠被番茄的抗性蛋白Vel識(shí)別而誘導(dǎo)寄主免疫反應(yīng);大麗輪枝菌中小分子量的富含半胱氨酸蛋白VdSCP41能與寄主植物的轉(zhuǎn)錄因子CBP60g互作而激發(fā)免疫反應(yīng)。此外，通過(guò)在模式植物煙草中瞬時(shí)表達(dá)大麗輪枝菌分泌的胞外蛋白，還篩選出了多個(gè)參與寄主互作的毒力因子，如糖苷水解酶VdEG1和VdEG3、角質(zhì)酶VdCUTll、小分子量富含半胱氨酸蛋白VdSCP7、壞死和乙烯誘導(dǎo)蛋白NLPs。目前，多個(gè)參與病原與寄主互作的效應(yīng)蛋白已經(jīng)被鑒定并確定了其在侵染過(guò)程中的毒力功能，但其是如何識(shí)別寄主或被寄主識(shí)別并發(fā)揮作用的機(jī)制仍不清楚。

酵母雙雜交系統(tǒng)（yeast two-hybrid system，Y2H）是研究蛋白相互作用的常用方法之一，最早在1989年由Fields和Song提出，其原理是利用真核生物轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域-BD和DNA轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域AD，如GAL4和GCN4等，將2個(gè)待研究的蛋白分別與BD和AD結(jié)構(gòu)域連接并共同導(dǎo)人酵母菌中，若2個(gè)蛋白相互作用則轉(zhuǎn)錄因子的BD和AD結(jié)構(gòu)域相互靠近，即可以轉(zhuǎn)錄激活下游報(bào)告基因的表達(dá)來(lái)檢測(cè)這種相互作用的發(fā)生。除應(yīng)用于2個(gè)已知蛋白間的相互作用的檢測(cè)外，酵母雙雜交體系也廣泛應(yīng)用于與已知蛋白具有潛在相互作用的蛋白篩選。但這一技術(shù)在大麗輪枝菌效應(yīng)子與寄主植物相互作用的研究中很少報(bào)道，因此，在明確參與大麗輪枝菌與寄主互作效應(yīng)子的前提下，通過(guò)構(gòu)建植物寄主酵母雙雜交文庫(kù)并篩選與病原效應(yīng)子互作的靶標(biāo)蛋白，對(duì)揭示大麗輪枝菌侵染寄主過(guò)程的致病分子機(jī)理具有重要意義。

本研究以大麗輪枝菌及激素處理的棉花為材料，構(gòu)建了用于大麗輪枝菌效應(yīng)子互作蛋白篩選的酵母雙雜交文庫(kù)，并對(duì)文庫(kù)的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估;以實(shí)驗(yàn)室篩選的具有誘導(dǎo)細(xì)胞壞死且定位于植物細(xì)胞核的效應(yīng)子VCR1（未發(fā)表）為例，通過(guò)互作蛋白篩選、基因功能分析和驗(yàn)證進(jìn)一步評(píng)價(jià)了構(gòu)建的酵母雙雜交文庫(kù)的應(yīng)用價(jià)值。本研究建立的棉花酵母雙雜交cDNA文庫(kù)將為大麗輪枝菌效應(yīng)子互作蛋白的篩選鑒定及深入研究病原與寄主互作分子機(jī)制的研究提供有力支撐。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

植物材料：海島棉‘海7124Gossypium barba-dense‘Hai 7124，生長(zhǎng)條件為L(zhǎng)∥D=14 h∥10h，溫度28℃。

菌株：落葉型強(qiáng)致病力大麗輪枝菌Vd991、酵母菌株Y187和Y2H均由本實(shí)驗(yàn)室保存，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Transl-T1購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

質(zhì)粒：酵母雙雜交所用的誘餌質(zhì)粒pGBKT7、文庫(kù)質(zhì)粒pGADT7、對(duì)照質(zhì)粒pGBKT7-Lam、pGBKT7-53和pGADT7-T購(gòu)自美國(guó)賽默飛公司。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1海島棉樣品處理及RNA提取

大麗輪枝菌于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato Dex-trose agar，PDA）培養(yǎng)基25℃條件下培養(yǎng)7d，無(wú)菌水收集孢子并制備成2×10個(gè)/mL孢子懸浮液。取20株2周齡海島棉幼苗（2片真葉完全展平）浸泡于50mL上述孢子懸浮液，30min后移栽回含有滅菌土的營(yíng)養(yǎng)缽，處理后分別于12、24、48、96 h和144 h取根部樣品液氮速凍，-80℃保存。制備10 mmol/L水楊酸（salicylic acid，SA）、5 mmol/L乙烯利溶液（ethephon，ET）和100mol/L茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA），其中乙烯利用水溶，水楊酸和茉莉酸甲酯用乙醇促溶后用水稀釋到目標(biāo)濃度，3種激素分別噴施于20株上述海島棉幼苗，進(jìn)行單獨(dú)處理，處理后于2、6、12、24、48 h和72 h后取葉片迅速置于液氮中速凍，-80℃保存。RNA提取使用EASYspin植物RNA快速提取試劑盒（北京原平皓生物技術(shù)有限公司），通過(guò)1.0%瓊脂糖電泳檢測(cè)提取RNA的完整性，使用Nano-Drop2000檢測(cè)提取RNA的質(zhì)量與濃度。

1.2.2酵母雙雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建

根據(jù)檢測(cè)濃度將大麗輪枝菌和激素處理的所有植株RNA樣品等量混合，利用SMARTTM cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒（美國(guó)賽默飛公司）構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。以上述2μL的RNA為模板合成第1條cDNA鏈，然后通過(guò)LD-PCR擴(kuò)增cDNA得到第2條鏈，并利用柱層析剔除250 bp以下的雙鏈cDNA。利用PEG/LiAc法將所得cDNA產(chǎn)物和6μL的pGADT7-Rec線性質(zhì)粒共轉(zhuǎn)入Y187酵母感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)，用15mL的NaCl溶液（0.9%）重懸菌體并涂布于缺少亮氨酸（Leu）的酵母培養(yǎng)基（syn-thetic dropout nutrient medium，SD）SD/-Leu培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)3～4d后收集菌體，得到的酵母細(xì)胞即為處理樣品的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，按1.0mL/管分裝于1.5mL離心管中，液氮速凍存于μ80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 cDNA文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率及滴度檢測(cè)

從上述重懸菌液吸取100μL并用0.9%NaCl10倍梯度稀釋至10，涂布于SD/-Leu培養(yǎng)基后于30℃條件下倒置培養(yǎng)3～4d，通過(guò)單菌落數(shù)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率。將無(wú)菌水收集的菌體稀釋至10、10、10和10，分別吸取50，μL涂布于SD/-Leu培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)3d，根據(jù)單菌落數(shù)計(jì)算文庫(kù)滴度。

1.2.4cDNA文庫(kù)平均插入片段大小及重組率分析

在SD/-Leu平板上隨機(jī)挑取23個(gè)單菌落，使用上游引物（5，-TAATACGACTCACTATAGGGO3）和下游引物（5-AGATGGTGCACGATGCA-CAG-3）進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min;95℃變性30s，55℃退火30 s，72℃延伸2min，擴(kuò)增34個(gè)循環(huán);72℃延伸5min。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，依據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小計(jì)算cDNA文庫(kù)的平均插入片段大小，陽(yáng)性克隆比率以及cDNA文庫(kù)的重組率。

1.2.5誘餌載體構(gòu)建

以實(shí)驗(yàn)室篩選的定位于寄主植物細(xì)胞核、引起細(xì)胞壞死的大麗輪枝菌效應(yīng)蛋白VCR1（未發(fā)表）為研究對(duì)象，構(gòu)建誘餌載體并開展酵母雙雜交文庫(kù)的篩選。利用帶EcoR I酶切位點(diǎn)的特異性引物（上游引物：5，-CATATGGCCATGGAGGC-CGAATTCATGGCACCAGTCCCGGCT-3;下游引物：5，-AGGTCGACGGATCCCCGGGAATTCG-CATGTGTTGAGCATGCT-3）對(duì)VCR1基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，EcoR I對(duì)誘餌表達(dá)載體pGBKT7酶切消化，再通過(guò)ClonExpress II One Step Cloning Kit（諾唯贊，南京）將VCR1基因片段連接到pGBKT7上;獲得重組質(zhì)粒pGBKT7-VCRl轉(zhuǎn)入Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，使用pGBKT7載體通用引物（上游引物：5，-TAATACGACTCACTATAGGGC-3;下游引物：5，-TAAGAGTCACTTTAAAATTT-GTAT-3）進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證。

1.2.6重組誘餌載體自激活及毒性檢測(cè)

將上述構(gòu)建的誘餌載體pGBKT7-VCR1及pGBKT7質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入Y2H酵母感受態(tài)細(xì)胞，涂布于SD/-Trp、SD/-Trp-His和SD/-Trp-His-Ade培養(yǎng)基，通過(guò)轉(zhuǎn)化后酵母細(xì)胞在上述培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況檢測(cè)VCR1的自激活性。將上述轉(zhuǎn)化體系涂布SD/-Trp和酵母膏胨葡萄糖瓊脂（YPDA）培養(yǎng)基，通過(guò)觀察其在平板上生長(zhǎng)情況鑒定VCR1對(duì)酵母是否具有毒性。

1.2.7酵母雙雜交文庫(kù)的篩選

酵母文庫(kù)篩選：上述攜帶有誘餌載體的菌株于30 mL SD/-Trp液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)，離心收集菌體并用5mL的SD/-Trp液體培養(yǎng)基重懸，隨后與構(gòu)建的酵母雙雜交文庫(kù)混勻，并于45mL的2×YPDA培養(yǎng)基（卡那霉素，50μL/L）中混勻融合培養(yǎng)，30℃、45r/min振蕩培養(yǎng)20h。待觀察到有合子出現(xiàn)后繼續(xù)培養(yǎng)4h，典型的合子呈現(xiàn)三耳突狀，分別代表兩個(gè)母細(xì)胞和一個(gè)子細(xì)胞。之后收集菌體，用0.5×YPDA（卡那霉素，50μL/L）培養(yǎng)液重懸菌體2次，最后定容至10mL。將上述重懸的酵母細(xì)胞涂布于直徑15cm的SD/-Trp-Leu-His（TDO）培養(yǎng)基上，每個(gè)涂布200μL，共50個(gè)平板，30℃倒置培養(yǎng)3～5d。將TDO培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)較好的陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)接到SD/-Trp-Leu-His-Ade（QDO）培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)觀察其生長(zhǎng)隋況。

結(jié)合效率測(cè)定：取上述重懸的酵母菌體100μL，按10倍梯度稀釋至10后每個(gè)梯度都分別涂布于SD/-Trp、SD/-Leu、SD/-Trp-Leu（DDO）培養(yǎng)基平板上，每種培養(yǎng)基涂5個(gè)平板，30℃倒置培養(yǎng)3～5d。待長(zhǎng)出菌落后，統(tǒng)計(jì)二倍體、文庫(kù)和誘餌克隆數(shù)，在相同稀釋倍數(shù)的前提下，計(jì)算結(jié)合效率。結(jié)合效率=二倍體克隆數(shù)/文庫(kù)或誘餌克隆數(shù)×100%。

潛在互作轉(zhuǎn)化子測(cè)序：挑取在SD/-Trp-Leu-His-Ade培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的酵母細(xì)胞，于SD/-Trp-Leu-His-Ade液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，利用pGADT7載體通用引物（上游引物：5，-TAATAC-GACTCACTATAGGGC-3;下游引物：5，-AGAT-GGTGCACGATGCACA-3）擴(kuò)增轉(zhuǎn)化子的cDNA插入片段并測(cè)序分析。

1.2.8潛在互作蛋白基本特性分析

對(duì)上述獲得的潛在互作轉(zhuǎn)化子序列進(jìn)行初步生物信息學(xué)分析：通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)的BlastP比對(duì)推測(cè)潛在互作蛋白的編碼序列;利用SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/smart/set-mode.cgi？NORMAL=1）預(yù)測(cè)編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域;采用WoLF PSORT（https：//wolfpsort.hgc.jp/）預(yù)測(cè)編碼蛋白的亞細(xì)胞定位;通過(guò)SignalP 4.1（http：//WWW.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/）預(yù)測(cè)編碼蛋白是否具有信號(hào)肽序列特征。

1.2.9互作蛋白驗(yàn)證

對(duì)篩選的陽(yáng)性克隆與本研究的大麗輪枝菌效應(yīng)蛋白VCR1進(jìn)行驗(yàn)證：隨機(jī)選取5個(gè)可能定位于細(xì)胞核的潛在互作基因，合成全長(zhǎng)cDNA序列并構(gòu)建于pGADT7載體上，將其分別與誘餌載體pGBKT7-VCRl共轉(zhuǎn)化至Y2H酵母感受態(tài)細(xì)胞中，以pGADT7-T和pGBKT7-53、pGADT7-T和pGBKT7-Lam分別作為陽(yáng)性和陰性對(duì)照，涂布SD/-Trp-Leu（DDO）培養(yǎng)基，30℃倒置培養(yǎng)3～5d。觀察SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上酵母的生長(zhǎng)情況，將陽(yáng)性克隆轉(zhuǎn)接到SD/-Trp-Leu-His-Ade（QDO）和SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-a-gal（QDO/x）培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)5～7d后觀察生長(zhǎng)和顯色情況，驗(yàn)證篩選的基因與靶標(biāo)效應(yīng)蛋白的互作情況。

2結(jié)果與分析

2.1構(gòu)建酵母雙雜交文庫(kù)的樣品處理及RNA提取

‘海7124是抗黃萎病棉花品種，落葉型強(qiáng)致病力大麗輪枝菌Vd991侵染5～6d后病原仍停留在皮層，病原菌無(wú)法繁殖擴(kuò)展;同時(shí)，激素SA、ET和MeJA處理下可誘導(dǎo)植物抗病相關(guān)基因表達(dá)。為構(gòu)建有效的抗病相關(guān)基因誘導(dǎo)表達(dá)文庫(kù)，本研究收集了大麗輪枝菌Vd991侵染以及激素SA、ET和MeJA處理的‘海7124樣品，并提取了所有樣品的總RNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果表明28S及18S條帶清晰，完整性好。依據(jù)紫外吸收光譜檢測(cè)發(fā)現(xiàn)上述提取的RNA樣品的ODe60/ODe80在1.97～2.02之間，濃度在500.4～2 086.4ng/μL（圖1），表明RNA質(zhì)量較好，可以用于文庫(kù)構(gòu)建。

2.2海島棉酵母雙雜交eDNA文庫(kù)構(gòu)建及評(píng)價(jià)

上述4組處理樣品（大麗輪枝菌侵染及3種激素處理）的總RNA等量混合，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，使用此cDNA合成雙鏈cDNA（圖2a）并利用柱層析剔除250 bp以下的雙鏈cDNA（ds-cDNA）。將獲得的ds-cDNA與酵母雙雜交文庫(kù)載體pGADT7獲得共轉(zhuǎn)化Y187酵母菌株進(jìn)行同源重組，最終獲得海島棉在上述4種處理?xiàng)l件下的酵母雙雜交文庫(kù)。用SD/-Leu培養(yǎng)基收集cDNA文庫(kù)的菌體，得到約130mL菌懸液并分裝于1.5 mL離心管，-80℃凍存?zhèn)溆谩?/p>

文庫(kù)轉(zhuǎn)化完成后，通過(guò)梯度稀釋涂布SD/-Leu培養(yǎng)基對(duì)酵母文庫(kù)的轉(zhuǎn)化效率和滴度進(jìn)行檢測(cè)。通過(guò)統(tǒng)計(jì)，稀釋至10平板平均菌落數(shù)為590個(gè)（圖2b），計(jì)算得酵母文庫(kù)的轉(zhuǎn)化效率為5.9×10/3μgpGADT7-VCR1，高于1×10/3μg pGADT7-Rec的試驗(yàn)要求，并且文庫(kù)滴度達(dá)到1.18×10cfu/mL，同樣高于1×10cfu/mL的文庫(kù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)。為驗(yàn)證本研究酵母文庫(kù)插入片段情況，從上述計(jì)算轉(zhuǎn)化效率的平板中隨機(jī)挑取23個(gè)菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示，挑取的克隆菌落均可擴(kuò)增出插入片段，重組率達(dá)100%，并且擴(kuò)增片段大小分布在300～2000bp之間（圖2c）。綜上結(jié)果說(shuō)明，本研究構(gòu)建的大麗輪枝菌及激素處理下棉花酵母雙雜交cDNA文庫(kù)質(zhì)量良好，可用于后續(xù)大麗輪枝菌效應(yīng)蛋白的篩選鑒定。

2.3大麗輪枝菌效應(yīng)蛋白VCR1誘餌載體構(gòu)建

使用pGBKT7通用引物對(duì)連接轉(zhuǎn)化后平板上的陽(yáng)性克隆進(jìn)行分子鑒定，并以空載體為對(duì)照。結(jié)果顯示，構(gòu)建的誘餌載體擴(kuò)增出的條帶與空載體擴(kuò)增出的條帶差值大小與VCR1片段大小相近，約580bp，進(jìn)一步提取構(gòu)建好的誘餌載體質(zhì)粒，用EcoRI內(nèi)切酶進(jìn)行酶切驗(yàn)證，并進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果與預(yù)期一致，表明大麗輪枝菌VCR1基因成功整合到誘餌載體pGBKT7（pGBKT7-VCR1）（圖3a，3b）。為驗(yàn)證VCR1的自激活性，將pGBKT7-VCR1轉(zhuǎn)化至Y2H酵母并涂布于相應(yīng)培養(yǎng)基上，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)化pGBKT7-VCR1誘餌載體與pGBKT7載體的酵母在SD/-Trp培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，在SD/-Trp-His和SD/-Trp-His-Ade培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)（圖3c），表明VCRl基因在酵母菌株中沒(méi)有自激活性。同時(shí)，含有pGBKT7-VCR1誘餌載體和pGBKT7載體的酵母菌株在YPDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)一致（圖3d），表明VCR1對(duì)Y2H酵母菌株沒(méi)有毒性。因此，大麗輪枝菌VCR1可以用于下一步與酵母雙雜交文庫(kù)互作蛋白的篩選。

2.4大麗輪枝菌效應(yīng)蛋白VCR1的候選互作蛋白篩選

使用上述誘餌載體pGBKT7-VCR1篩選文庫(kù)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)SD/-Leu培養(yǎng)基上稀釋100倍的菌落數(shù)為415個(gè)，1000倍的48個(gè)，SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上稀釋10倍的菌落數(shù)為55個(gè)，100倍的10個(gè)，計(jì)算得出酵母雙雜交結(jié)合效率約為1.33%（圖4a）。進(jìn)一步從SD/-Trp-Leu-His培養(yǎng)基上篩選出生長(zhǎng)正常的克隆480個(gè)接種于SD/-Trp-Leu-His-Ade培養(yǎng)基上二次篩選，最終獲得生長(zhǎng)正常的克隆422個(gè)，使用pGADT7通用引物對(duì)422個(gè)克隆進(jìn)行PCR鑒定，獲得插入片段大于500 bp的克隆201個(gè)（圖4b）。

2.5大麗輪枝菌效應(yīng)蛋白VCR1的候選互作蛋白驗(yàn)證

根據(jù)上述克隆測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，本研究共篩選到了與大麗輪枝菌效應(yīng)蛋白VCRl潛在互作的蛋白27個(gè)（表1）。通過(guò)序列比對(duì)與功能注釋表明，其中18個(gè)為假定蛋白（功能未知）。結(jié)果顯示，效應(yīng)蛋白VCR1與其中4個(gè)潛在互作蛋白（VCR1-IP001、VCR1-IP005、VCR1-IP009和VCR1-IP027）與陰性對(duì)照（pGADT7-T+pGBKT7-Lam）僅在SD/-Trp-Leu培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，在SD/-Trp-Leu-His-Ade和SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-a-gal培養(yǎng)基上皆不生長(zhǎng);而效應(yīng)蛋白VCRl和VCRl一IP003與陽(yáng)性對(duì)照（pGADT7-T+pGBKT7-53），在SD/-Trp-Leu、SD/-Trp-Leu-His-Ade和SD/-Trp-Leu-His-Ade/X-a-gal培養(yǎng)基上均能夠正常生長(zhǎng)，表明VCRl可以與VCR1-IP003互作（圖5）。

3討論

植物在病原菌侵染時(shí)會(huì)誘導(dǎo)抗性基因表達(dá)來(lái)抵御病原菌的侵染。此外，植物激素也可以作為免疫信號(hào)分子激活防御反應(yīng)，如茉莉酸、水楊酸、乙烯等。水楊酸能夠激活針對(duì)活體、半活體營(yíng)養(yǎng)寄生物的抗性防衛(wèi)反應(yīng);茉莉酸能夠與乙烯協(xié)同發(fā)揮作用，激活對(duì)死體營(yíng)養(yǎng)病原菌的防御反應(yīng)。定位于細(xì)胞膜上的棉花枯草桿菌酶（subtilase）GbSBT1同時(shí)受大麗輪枝菌、茉莉酸和乙烯誘導(dǎo)，并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮功能。因此，參與病原與寄主互作的基因往往在病原侵染、激素處理?xiàng)l件下被大量誘導(dǎo)表達(dá)。海島棉對(duì)黃萎病具有較高的抗性，部分品種對(duì)黃萎病菌免疫，與陸地棉相比，更適用于篩選抗病基因;‘海7124是抗病基因鑒定與功能研究的常用材料。因此，本研究綜合采用大麗輪枝菌侵染、激素處理等條件誘導(dǎo)‘海7124抗病相關(guān)基因表達(dá)，對(duì)處理的樣品提取RNA并混合構(gòu)建酵母雙雜文庫(kù)。本研究所構(gòu)建的文庫(kù)可以覆蓋多種誘導(dǎo)條件下的抗病相關(guān)基因，文庫(kù)抗性相關(guān)基因種類和豐度優(yōu)于單一處理?xiàng)l件下構(gòu)建的酵母雙雜交文庫(kù)，從而提高了篩選到與大麗輪枝菌效應(yīng)子互作蛋白的概率。應(yīng)用本研究構(gòu)建的酵母文庫(kù)，成功篩選到誘餌蛋白VCR1的27個(gè)潛在互作蛋白。

高質(zhì)量cDNA文庫(kù)構(gòu)建是利用酵母雙雜交篩選互作蛋白的關(guān)鍵，酵母文庫(kù)的好壞直接影響互作蛋白的篩選效率。良好的酵母文庫(kù)需要有較高的轉(zhuǎn)化效率（>1×10。/3μg pGADT7-Rec）、重組率、較長(zhǎng)的插入片段以及足夠的文庫(kù)滴度（>1×10cfu/mL）。有研究報(bào)道利用水稻構(gòu)建的酵母雙雜交文庫(kù)，轉(zhuǎn)化效率達(dá)到6.65×10/3μg pGADT7-Rec，重組率為100%。經(jīng)質(zhì)量檢測(cè)，本研究構(gòu)建酵母文庫(kù)轉(zhuǎn)化效率為5.9×10/3μg pGADT7-VCRl，連接片段檢測(cè)重組率為100%，且插入片段分布在300～2000bp;此外，本研究構(gòu)建的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)滴度為1.18×10cfu/mL，約為標(biāo)準(zhǔn)量的10倍。綜上結(jié)果，本研究利用大麗輪枝菌及激素處理下的混合樣品，成功建立了高效的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，這為后續(xù)篩選與大麗輪枝菌效應(yīng)子互作的靶標(biāo)蛋白提供了重要的材料基礎(chǔ)。

酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核酵母細(xì)胞內(nèi)研究蛋白之問(wèn)相互作用的一種方法，此方法靈敏度高，應(yīng)用廣泛。本研究應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)成功篩選到27個(gè)與VCR1潛在互作的蛋白，這表明構(gòu)建的酵母雙雜交文庫(kù)具有較好的篩選效果。利用棉花測(cè)序的基因組信息，分析獲得對(duì)應(yīng)基因的全長(zhǎng)序列并進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)鑒定的27個(gè)潛在互作蛋白中，18個(gè)為未知蛋白，其功能尚不明確;其中24個(gè)蛋白質(zhì)均無(wú)信號(hào)肽。16個(gè)潛在互作蛋白預(yù)測(cè)定位于細(xì)胞核，與效應(yīng)子VCR1在寄主植物的亞細(xì)胞定位（細(xì)胞核）相同，具有很高的可信度。隨機(jī)選取5個(gè)定位于細(xì)胞核的潛在互作蛋白進(jìn)行回轉(zhuǎn)驗(yàn)證，確證了與效應(yīng)子VCR1互作的候選蛋白（VCR1-IP003）。上述結(jié)果一定程度上客觀反映了酵母雙雜交技術(shù)自身存在假陽(yáng)性高的局限性，但也說(shuō)明本研究構(gòu)建的酵母雙雜交文庫(kù)可以有效應(yīng)用于病原與寄主互作蛋白的篩選。

綜上，本試驗(yàn)成功構(gòu)建了海島棉‘海7124在大麗輪枝菌侵染和激素處理下的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)，文庫(kù)具有較高的轉(zhuǎn)化效率和重組效率，并通過(guò)大麗輪枝菌效應(yīng)子VCR1互作蛋白的篩選系統(tǒng)評(píng)價(jià)了構(gòu)建的棉花酵母雙雜交文庫(kù)，為后續(xù)篩選與大麗輪枝菌胞外蛋白（效應(yīng)子）互作的靶標(biāo)蛋白及其互作機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。