李正男 馬強(qiáng) 張磊 孫平平 趙文軍 周洪友

關(guān)鍵詞馬鈴薯僵頂植原體;16S rRNA基因;rp基因

馬鈴薯是我國(guó)主要糧食作物之一，是世界上僅次于水稻、玉米、小麥之后的第四大糧食作物，對(duì)我國(guó)糧食安全具有重要戰(zhàn)略意義。我國(guó)馬鈴薯種植區(qū)主要?jiǎng)澐譃槲鞅?、西南、?nèi)蒙古和東北四大優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)。寧夏屬于西北馬鈴薯優(yōu)勢(shì)產(chǎn)區(qū)，2016年，我國(guó)馬鈴薯種植面積為554.52萬(wàn)h㎡，寧夏馬鈴薯種植面積為16.88萬(wàn)h㎡，馬鈴薯種植業(yè)已經(jīng)發(fā)展成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民脫貧致富的主導(dǎo)產(chǎn)業(yè)。隨著馬鈴薯種植面積的擴(kuò)大，病害的發(fā)生已經(jīng)發(fā)展成為制約我國(guó)馬鈴薯高產(chǎn)、優(yōu)產(chǎn)的主要因素，除傳統(tǒng)的晚疫病Phytophthora in fstarts、黑脛病Pectobacte-rium spp.、環(huán)腐病Clavibacter michiganensis sub-sp.sepedonicus和病毒病外，由植原體引起的馬鈴薯僵頂病（potato stolbur）日益發(fā)展成為主要病害。

馬鈴薯僵頂病是一種植原體病害，發(fā)生普遍、傳播迅速、危害嚴(yán)重。其癥狀主要表現(xiàn)為葉片上卷、紅葉或紫葉、節(jié)點(diǎn)膨大、節(jié)間縮短、芽增殖、氣生薯和早衰，部分發(fā)病輕的植株地下薯塊雖然無(wú)肉眼可見(jiàn)癥狀，但質(zhì)地蓬松（海綿薯），在加工過(guò)程中品相變差，如制作炸薯片時(shí)，會(huì)出現(xiàn)薯片褐變，喪失食用和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。馬鈴薯僵頂病的流行主要有以下兩方面原因，第一，由介體昆蟲(chóng)甜菜葉蟬Circuli fer tenel-lus傳播，散布迅速;第二，通過(guò)薯塊營(yíng)養(yǎng)繁殖傳播。據(jù)報(bào)道，該病害在北美、南美、歐洲、新西蘭、俄羅斯和伊朗均有發(fā)生，并且引起嚴(yán)重的馬鈴薯減產(chǎn)。已經(jīng)確認(rèn)馬鈴薯僵頂病可由16SrⅠ、16SrⅡ、16SrⅢ、16SrⅥ、16Sr X、16SrⅫ、16SrXⅢ和16SrXⅧ組植原體引起。在我國(guó)云南和內(nèi)蒙古個(gè)別馬鈴薯種植區(qū)內(nèi)，馬鈴薯僵頂病的發(fā)生率達(dá)80%～100%，由16SrⅠ和16SrⅫ組植原體引起。

寧夏作為我國(guó)馬鈴薯的主產(chǎn)區(qū)之一，是否有馬鈴薯僵頂病發(fā)生，其病原的分類(lèi)地位等尚不清楚。為此，我們開(kāi)展了寧夏馬鈴薯僵頂病調(diào)查和病原鑒定，以期為馬鈴薯僵頂病的預(yù)測(cè)及病原菌研究奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

2018年9月10日-17日自寧夏回族自治區(qū)固原市彭陽(yáng)縣紅河鎮(zhèn)采集表現(xiàn)葉片上卷、紅葉、節(jié)問(wèn)縮短、氣生薯、根系壞死等癥狀的馬鈴薯樣品，馬鈴薯品種為‘費(fèi)烏瑞它。用于分子檢測(cè)的樣品采樣方法如下：每株取5～8片新葉，以錫箔紙包裹后迅速液氮冷凍，通過(guò)干冰運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，保存于超低溫冰箱（-86℃）備用，其中有癥狀樣品10個(gè)，無(wú)癥狀樣品3個(gè)。用于透射電鏡觀察的樣品采樣方法如下：取10～15cm有癥狀植株莖尖，用打濕的報(bào)紙迅速包起來(lái)，保存在泡沫塑料盒中，帶回實(shí)驗(yàn)室。在分類(lèi)上屬于16SrⅠ-B亞組的苦楝叢枝樣品為本實(shí)驗(yàn)室保存。

Ex Taq DNA Polymerase.dNTPs（2.5 retool/L）、克隆載體PMDl9-T simple vector、DH5a感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。瓊脂糖凝膠回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小量快速提取試劑盒購(gòu)自艾德萊生物技術(shù)有限公司。1 kb DNA Ladder購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.2透射電子顯微鏡觀察

從顯癥馬鈴薯葉脈取2mm×2mm大小的韌皮部組織，將樣品先用3%的戊二醛和4%的多聚甲醛混合物固定4h，然后用1%鋨酸再次固定2h，10%～70%的乙醇和0～100%的丙酮逐級(jí)脫水，用812環(huán)氧樹(shù)脂包埋，在烘箱內(nèi)烘干72h后取出修塊，修塊完成后切半薄切片，定位到韌皮部組織后進(jìn)行超薄切片，將超薄切片以醋酸鈾酰及檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色，用JEM-1200X透射電鏡觀察并拍照。

1.3總DNA提取

采用CTAB法提取凍存的13個(gè)馬鈴薯葉片樣品總DNA，溶解于50μL滅菌雙蒸水中，采用Eppendorf BioPhotometer D30核酸蛋白測(cè)定儀測(cè)定DNA濃度，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的完整性后將總DNA保存于超低溫冰箱（-86℃）中備用?？嚅瑓仓悠稤NA提取方法同上。

1.4馬鈴薯僵頂病的PCR檢測(cè)

16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增：以提取的總DNA為模板，用植原體16S rRNA基因通用引物P1（5，-AAGAGTTATCCTGGCTCAGGATT-3）和P7進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性3min;98℃ 1 min，50℃2min，72℃ 3min，35個(gè)循環(huán);72℃10min。將第一輪PCR產(chǎn)物稀釋30倍作為模板，用引物R16F2n進(jìn)行第二輪PCR，擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性3min;98℃1min，52℃1 min，72℃1min，先進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，然后以94℃30 s，50℃1min，72℃2min，進(jìn)行25個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。

rp基因的PCR擴(kuò)增：使用植原體rp基因通用引物rpF1C（5，-ATGGTDGGDCAYAARTTAGG-3）和rp（I）RIA（5-GTTCTTTTTGGCATTAA-CAT-3）進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性11min;98℃ 1min，50℃2min，72℃3min，38個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。

取5μL PCR產(chǎn)物，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，EB染色后在凝膠成像系統(tǒng)下成像。PCR反應(yīng)以健康馬鈴薯總DNA為陰性對(duì)照，采集自陜西省楊凌區(qū)西北農(nóng)林科技大學(xué)校園的苦楝叢枝樣品DNA為陽(yáng)性對(duì)照。

1.5PCR產(chǎn)物的純化、克隆及序列測(cè)定

采用快捷型瓊脂糖DNA回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，純化產(chǎn)物與PMDl9-T simple vector 16℃連接1h，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過(guò)藍(lán)白斑篩選后，挑取篩選平板上的白色菌落，在3 mL Amp抗性的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，經(jīng)過(guò)PCR鑒定為陽(yáng)性的菌液提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6序列一致性比較分析

采用Vector NTI Advancell（Invitrogen Corp.）軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行校正和拼接;將獲得的16S rRNA和rp基因序列進(jìn)行BLASTn比對(duì)檢索同源序列并提交GenBank;通過(guò)DNAMAN軟件將測(cè)定的16SrRNA基因和rp基因序列與同組植原體代表株系進(jìn)行核酸一致性比較;通過(guò)MEGA 6.0軟件分別構(gòu)建16S rRNA基因和rp基因系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

2結(jié)果與分析

2.1馬鈴薯僵頂病癥狀

2018年9月10日-17日，對(duì)寧夏回族自治區(qū)固原市彭陽(yáng)縣紅河鎮(zhèn)馬鈴薯僵頂病進(jìn)行了調(diào)查，調(diào)查標(biāo)準(zhǔn)主要是看馬鈴薯田里是否存在葉片上卷、紅葉、節(jié)問(wèn)縮短、氣生薯和根系壞死癥狀的植株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)上述癥狀的馬鈴薯植株在薯田內(nèi)零星發(fā)生，共采集了10株有癥狀的馬鈴薯葉片樣品，3株無(wú)癥狀馬鈴薯葉片樣品（圖1）。

2.2電鏡結(jié)果

通過(guò)透射電子顯微鏡在感病馬鈴薯韌皮部篩管細(xì)胞內(nèi)觀察到大量球形的植原體粒子，大小在500～700nm（圖2）。

2.3 PCR鑒定結(jié)果

利用植原體16S rRNA基因和rp基因通用引物從有癥狀的10個(gè)馬鈴薯樣品和陽(yáng)性對(duì)照中均擴(kuò)增出長(zhǎng)度約1.2 kb的16S rRNA基因和rp基因，而3個(gè)無(wú)癥狀馬鈴薯樣品中未擴(kuò)增出特異性條帶。證明了表現(xiàn)葉片內(nèi)卷、紅葉、節(jié)問(wèn)短縮、氣生薯和根系壞死癥狀的馬鈴薯中有植原體存在。

2.4一致性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析

從10個(gè)PCR鑒定為植原體陽(yáng)性的馬鈴薯樣品中隨機(jī)選擇2、4、7、9號(hào)樣品進(jìn)行16S rRNA基因和rp基因克隆，16S rRNA基因和rp基因均選擇3個(gè)陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序，4個(gè)樣品彼此問(wèn)16S rRNA基因和rp基因的一致性為100.0 %，我們將該植原體命名為馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系（potato stolburphytoplasma strain Ningxia，PSp-Nx），16S rRNA片段長(zhǎng)度為1246 bp，G+C含量為46.79%，登錄號(hào)為MK696087;rp基因長(zhǎng)度為1182 bp，登錄號(hào)為MK695939。通過(guò)BLASTn程序，將獲得的馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系16S rRNA基因序列和rp基因序列在GenBank中進(jìn)行同源序列搜索，分別搜索到99條同源序列，99條序列均屬于僵頂組（16SrⅫ組）成員，其16Sr RNA基因與‘Ca.P.ffagariae槭樹(shù)株系（MK501642）16S rRNA基因一致性最高，為99.70%，rp基因與‘P.fragariae云南馬鈴薯YN-2G株系（KJl44889）rp基因一致性最高，達(dá)到100.0%。

利用MEGA 6.0軟件將馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系16S rRNA基因序列與僵頂組植原體11個(gè)亞組（A-K）代表及其他各植原體組代表的16SrRNA基因序列進(jìn)行比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖3）。從圖中可以看出馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系與僵頂組植原體11個(gè)亞組代表株系聚集在一起形成一個(gè)大的分支，其中又與16SrⅫ-E亞組的代表株系‘ca.P.fragariae草莓株系（DQ086423）聚集在一起形成獨(dú)立分支。馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系rp基因序列與僵頂組植原體5個(gè)代表及其他各植原體組代表的rp基因序列進(jìn)行比較，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖4）。從圖中可以看出馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系與僵頂組植原體5個(gè)代表株系聚集在一起形成一個(gè)大的分支，其中又與分類(lèi)屬于16SrⅫ-E亞組的‘ca.P.fragariae云南馬鈴薯YN-2G株系（KJl44889）聚集在一起。

基于對(duì)16S rRNA基因和rp基因的核酸一致性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析，均證明馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系屬于16SrⅫ組，并且該分離物與16SrⅫ-E亞組親緣關(guān)系最近。

3討論

在本研究中透射電鏡和分子檢測(cè)結(jié)果均證明在寧夏發(fā)生的馬鈴薯僵頂病與植原體有關(guān);其16SrRNA基因和rp基因的一致性分析和系統(tǒng)發(fā)育分析證明該植原體屬于16SrⅫ組，并且與16SrⅫ-E亞組親緣關(guān)系最近。

之前的研究表明在我國(guó)北方地區(qū)16SrⅠ組和16SrV組植原體發(fā)生最為普遍，南方地區(qū)16SrⅠ組和16SrⅡ組植原體發(fā)生最為普遍_(kāi)2，但近年來(lái)越來(lái)越多的研究報(bào)道僵頂組（16SrⅫ組）植原體在我國(guó)的發(fā)生，其中Gao等報(bào)道了16SrⅫ組一個(gè)新的亞組在山東牡丹上的發(fā)生，Yang等報(bào)道了16SrⅫ-A亞組在陜西丹參上的發(fā)生，Wu等報(bào)道了16SrⅫ-c亞組在云南黃槐樹(shù)上的發(fā)生，Cheng等報(bào)道了16SrⅫ-E、16SrⅫ-I亞組在我國(guó)云南和內(nèi)蒙古馬鈴薯上的發(fā)生，由此，我們可以看到16Sr組植原體在我國(guó)不同地區(qū)正在廣泛發(fā)生。由16Sr組植原體引起的病害已經(jīng)發(fā)展成為北歐最嚴(yán)重的植原體病害，因此16Sr組植原體在我國(guó)的發(fā)生值得引起重視。

在我國(guó)西北馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的陜西、西南馬鈴薯產(chǎn)區(qū)的云南、內(nèi)蒙古馬鈴薯產(chǎn)區(qū)分別有16SrⅠ-B、16SrⅥ-A、16SrⅫ-E、16SrⅫ-I亞組植原體侵染馬鈴薯引起僵頂病的報(bào)道，但在寧夏和黑龍江等馬鈴薯產(chǎn)區(qū)還沒(méi)有馬鈴薯僵頂病發(fā)生的報(bào)道，本研究對(duì)寧夏馬鈴薯產(chǎn)區(qū)進(jìn)行了調(diào)查，并證明在寧夏有16SrⅫ-E亞組植原體引起的馬鈴薯僵頂病。結(jié)合上面研究結(jié)果證明與植原體相關(guān)的馬鈴薯僵頂病在我國(guó)馬鈴薯產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生。雖然在本研究中鑒定到的馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系與在云南和內(nèi)蒙古鑒定到的馬鈴薯僵頂植原體均屬于16SrⅫ-E亞組，但馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系16S rRNA基因卻與在比利時(shí)發(fā)生的‘ca.P.fragariae槭樹(shù)株系（MK501642）一致性最高，為99.70%，說(shuō)明馬鈴薯僵頂植原體寧夏株系與云南和內(nèi)蒙古株系存在一定變異。在世界范圍內(nèi)已經(jīng)有16SrI、16SrII、16SrIII、16SrVI、16SrX、16SrⅫ、16SrⅫ在馬鈴薯上引起僵頂病的報(bào)道，結(jié)合我國(guó)的研究結(jié)果可以看出引起馬鈴薯僵頂病的植原體病原多樣，植原體由刺吸式口器昆蟲(chóng)傳播，這類(lèi)昆蟲(chóng)食性廣泛，它們可能會(huì)在感染了不同組植原體或者同組不同亞組植原體的植株上取食，這可能是導(dǎo)致馬鈴薯僵頂病植原體病原多樣性的原因，在油菜、葡萄、長(zhǎng)春花等植物上也存在分類(lèi)上屬于不同組的多個(gè)植原體組植原體侵染的報(bào)道。我國(guó)不同馬鈴薯產(chǎn)區(qū)僵頂病的發(fā)生情況、病原多樣性和效應(yīng)因子鑒定將是我們后續(xù)工作的重點(diǎn)。