張超杰 閆紅娟 趙舉紅 張杰 李朝陽(yáng) 徐江

1石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院（新疆石河子832003）；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院（新疆石河子832008）；3廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（廣州510095）

口腔鱗癌即口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔頜面部最常見(jiàn)的惡性腫瘤，全球發(fā)病率達(dá)到40萬(wàn)/年［1］，近年對(duì)OSCC的篩查、診斷、治療等方面取得了進(jìn)展，許多潛在的分子標(biāo)志物和靶點(diǎn)也被逐漸發(fā)現(xiàn)，但在過(guò)去的幾十年里，整體5年生存率等指標(biāo)徘徊在55%～65%，腫瘤的局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致其預(yù)后差及生存率下降的主要原因［2-4］。深入探究影響OSCC 預(yù)后的相關(guān)因子，尋找新的腫瘤標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)來(lái)提高患者的生存率至關(guān)重要。

FOXP3 是叉形翼螺旋家族成員之一，位于染色體Xp11.23 上，由11 個(gè)外顯子和10 個(gè)內(nèi)含子組成［5］。FOXP3 是Treg 的特異性標(biāo)記分子，在調(diào)節(jié)T 細(xì)胞的形成及免疫抑制功能中起著關(guān)鍵作用［6］。FOXP3 在癌細(xì)胞中的表達(dá)已被證明與腫瘤生物學(xué)行為的調(diào)控有關(guān)［7］，且不同的腫瘤組織FOXP3 的表達(dá)及功能不同。在胃癌、乳腺癌中FOXP3可以作為腫瘤抑制因子，且與腫瘤較好的預(yù)后有關(guān)，而在結(jié)直腸癌中，F(xiàn)OXP3 可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，但關(guān)于FOXP3與OSCC的關(guān)系尚不明確。本研究首先通過(guò)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出FOXP3在OSCC 中的表達(dá)情況，并與免疫組化法驗(yàn)證OSCC 及癌旁組織中FOXP3 蛋白的表達(dá)情況進(jìn)行對(duì)比，進(jìn)一步探究FOXP3 表達(dá)與OSCC 臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料納入研究的對(duì)象為2008-2020年在新疆石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院口腔頜面外科治療的82 例男性和74 例女性口腔鱗癌患者。對(duì)納入研究的156 例OSCC 組織制作組織芯片，并選取癌旁組織96 例作為對(duì)照組。TNM 分類的確定以第八版國(guó)際癌癥控制聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)（AJCC）為基礎(chǔ)［8］。收集156 例患者完整的臨床病理資料，其中有隨訪信息102 例，隨訪截止日期為2020年7月30日。

1.2 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)樣本從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)檢索下載OSCC 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集375 例，其中正常組織32 例。篩選出FOXP3 表達(dá)量及臨床信息，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 方法免疫組織化學(xué)染色采用EnVision 兩步法，F(xiàn)OXP3 單克隆抗體購(gòu)自ABCAM 公司，工作濃度為1∶200。腫瘤細(xì)胞中FOXP3 胞漿或（和）細(xì)胞核染色，呈棕黃色、黃褐色。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由2 名病理醫(yī)師采用雙盲方法進(jìn)行評(píng)價(jià)，免疫反應(yīng)積分（IRS）計(jì)算為陽(yáng)性細(xì)胞百分比乘以細(xì)胞著色強(qiáng)度（表1）［9］。根據(jù)IRS 值，結(jié)果分為兩組，其中低表達(dá)組（≤4 分），高表達(dá)（＞4 分）。組織芯片染色不典型時(shí)進(jìn)行切片重復(fù)操作。

表1 免疫組化染色評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Tab.1 Scoring criteria for immunohistochemical staining

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 21.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，采用χ2檢驗(yàn)分析FOXP3 的表達(dá)其他變量的關(guān)系，Kaplan-Meier 法進(jìn)行生存評(píng)估分析，生存資料中不同變量的風(fēng)險(xiǎn)比采用Cox 回歸分析。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中口腔鱗癌和正常組織中FOXP3的表達(dá)差異對(duì)TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中OSCC 組織與癌旁正常組織樣本相比，F(xiàn)OXP3 呈高表達(dá)（P＜0.05，圖1），提示FOXP3 可能是OSCC 患者診斷的潛在標(biāo)志物。

圖1 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)中口腔鱗癌和正常組織中FOXP3 的表達(dá)差異Fig.1 The expression difference of FOXP3 in oral squamous cell carcinoma and normal tissues in the TCGA database

2.2 FOXP3 在OSCC 中表達(dá)情況及與臨床病理特征的關(guān)系FOXP3 主要分布在OSCC 細(xì)胞胞漿或（和）細(xì)胞核上，呈棕黃色或黃褐色（圖2）。156例OSCC 組織及96 癌旁正常組織中，F(xiàn)OXP3 的表達(dá)率分別為57.69%（90/156）、20.83%（20/96），兩組陽(yáng)性率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，表2），這與TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果一致。患者確診時(shí)的中位年齡為70.5 歲，平均隨訪3.29年。FOXP3 表達(dá)與OSCC患者T 分期、TNM 分期均相關(guān)（P＜0.05，表3）。而與年齡、性別、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均無(wú)關(guān)（P＞0.05，表3）。

表2 OSCC 及癌旁正常組織中FOXP3 的表達(dá)Tab.2 Expression of FOXP3 in OSCC and adjacent normal tissues 例

圖2 FOXP3 在OSCC 中表達(dá)情況（×40；×200）Fig.2 Expression of Foxp3 in OSCC（×40；×200）

表3 OSCC 中FOXP3 表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.3 Relationship between FOXP3 expression in OSCC and clinicopathological characteristics 例

2.3 OSCC 中FOXP3表達(dá)與患者的預(yù)后關(guān)系采用Kaplan-Meier分析FOXP3表達(dá)是否可以作為預(yù)測(cè)OSCC 預(yù)后的指標(biāo)，并繪制存活曲線，檢測(cè)了102 例有完整隨訪資料的OSCC 患者的FOXP3 表達(dá)水平與預(yù)后的關(guān)系。分析結(jié)果顯示FOXP3 高表達(dá)的生存時(shí)間與FOXP3 低表達(dá)患者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.008，圖3），即FOXP3高表達(dá)組患者術(shù)后病死率更高。Cox 單因素分析顯示OSCC 中FOXP3 表達(dá)量（HR= 2.32，P= 0.012）和T 分期（HR= 1.886，P= 0.031；）及TNM 分期（HR= 1.901，P= 0.032）增加患者死亡風(fēng)險(xiǎn)（表4）。Cox 多因素生存分析表明FOXP3 高表達(dá)（HR=2.415，P=0.009）與死亡有關(guān)，F(xiàn)OXP3 高表達(dá)是影響OSCC 患者預(yù)后的獨(dú)立因素（表4）。

圖3 FOXP3 表達(dá)與OSCC 患者預(yù)后的生存分析Fig.3 Survival analysis of FOXP3 expression and prognosis of OSCC patients

3 討論

腫瘤微環(huán)境中存在CD4+CD25+Tregs，可通過(guò)與細(xì)胞直接接觸或依賴相關(guān)細(xì)胞因子來(lái)一致T 細(xì)胞的免疫反應(yīng)，因而不僅能維持自身的免疫耐受還能阻止機(jī)體對(duì)自體同源腫瘤細(xì)胞的免疫。FOXP3是Tregs 生長(zhǎng)、分化及功能維持中的關(guān)鍵因子，可用于Tregs 細(xì)胞的測(cè)定和分離［10］，人類Treg 具有高度多樣性的表型和功能，在腫瘤微環(huán)境（TME）中，Treg 被腫瘤重新編程，可獲得激活的表型和抑制功能的增強(qiáng)，但Tregs 細(xì)胞中FOXP3 的缺失或突變可能會(huì)導(dǎo)致可能導(dǎo)致高比例的腫瘤形成［11］。一系列研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、胃癌、非小細(xì)胞肺癌和食管鱗癌中FOXP3 的表達(dá)與腫瘤的惡性程度有關(guān)，可能是由于Tregs 細(xì)胞阻止活化的CD4+、CD25+和CD8+細(xì)胞增殖，減輕對(duì)腫瘤抗原的免疫反應(yīng)［12］。在胰腺癌中［13］，F(xiàn)OXP3 陽(yáng)性的胰腺癌細(xì)胞能夠抑制活化T 細(xì)胞的增殖及相關(guān)因子的表達(dá)分泌，能夠介導(dǎo)免疫抑制和腫瘤的免疫逃逸。

本組實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXP3 在OSCC 組織中的表達(dá)率為57.69%、癌旁組織中的表達(dá)率20.83%，且兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義與TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)結(jié)果一致，提示FOXP3 在OSCC 的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中可能有一定的促進(jìn)作用。前期在胃癌、乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌和食管鱗狀細(xì)胞癌中研究發(fā)現(xiàn)［14-15］，F(xiàn)OXP3 的表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)。如在卵巢癌中，F(xiàn)OXP3 可以抑制癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲；乳腺癌中，F(xiàn)OXP3 通過(guò)下調(diào)CD44 的表達(dá)來(lái)抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［16］；在大腸癌中，KUWAHARA 等［17］發(fā)現(xiàn)FOXP3陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤侵襲性相關(guān)。侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的兩大特征，是涉及多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑及多種因素的復(fù)雜過(guò)程，F(xiàn)OXP3 在不同的腫瘤組織中發(fā)揮的作用不同，這與腫瘤的惡性程度及進(jìn)展密切相關(guān)［18-20］。但目前，關(guān)于FOXP3 的表達(dá)與OSCC患者的臨床病理關(guān)系較少，SONG 等［21］等發(fā)現(xiàn)FOXP3 與OSCC 患者的臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有一定的相關(guān)性。本組結(jié)果表明，F(xiàn)OXP3 的表達(dá)與OSCC 患者的T 分期及臨床分期顯著相關(guān)，且隨著T 分期及臨床分期的增加，F(xiàn)OXP3 的高表達(dá)率顯著增強(qiáng)趨勢(shì)，提示FOXP3 可能在OSCC 的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用，但其具體機(jī)制尚不清楚。

表4 COX 單因素及多因素分析Tab.4 COX single factor and multiple factor analysis

對(duì)本研究中納入的患者進(jìn)行隨訪后用Kaplan-Meier 法對(duì)兩組患者的生存率分析比較顯示，F(xiàn)OXP3 高表達(dá)組患者的術(shù)后生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)組，同時(shí)對(duì)OSCC 患者預(yù)后的影響因素進(jìn)行Cox 回歸分析，單因素回歸分析顯示，F(xiàn)OXP3 表達(dá)量和T 分期及TNM 分期均是影響OSCC 患者預(yù)后的危險(xiǎn)因素。多因素分析表明，F(xiàn)OXP3 的表達(dá)量是影響患者預(yù)后的獨(dú)立因素，且FOXP3 表達(dá)量與患者的生存時(shí)間密切相關(guān)，F(xiàn)OXP3 表達(dá)越高，患者預(yù)后越差，提示FOXP3 可能是潛在的預(yù)后標(biāo)志物，相似的在舌鱗狀細(xì)胞癌［22］和口下咽鱗狀細(xì)胞癌［9］患者中，F(xiàn)OXP3 高表達(dá)與總體生存率低相關(guān)。以上表明，F(xiàn)OXP3 的表達(dá)與OSCC 患者的術(shù)后生存時(shí)間密切相關(guān)，對(duì)患者的預(yù)后有重要意義。

綜上，本組實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)FOXP3 在OSCC 中高表達(dá)，且與OSCC 患者的預(yù)后顯著相關(guān)。但還需要大量臨床資料及長(zhǎng)期隨訪信息結(jié)合相關(guān)分子生物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證，目前關(guān)于FOXP3 在OSCC 發(fā)生發(fā)展中扮演的作用以及在相關(guān)免疫細(xì)胞及腫瘤微環(huán)境相互作用中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)移行為需要更深入的研究進(jìn)行探討。