張黎莎 楊賢苗 錢粉紅

江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸科（江蘇鎮(zhèn)江212001）

支氣管哮喘（簡稱哮喘），是一種由多種細(xì)胞及細(xì)胞因子參與的慢性炎癥性疾病，在全球范圍內(nèi)發(fā)病率較高，目前已影響超過3億人［1］。其發(fā)病與遺傳及環(huán)境因素等表觀遺傳學(xué)因素密切相關(guān)［2-3］。DNA 甲基化作為表觀遺傳調(diào)控的重要內(nèi)容，在轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)、免疫相關(guān)通路調(diào)控、細(xì)胞分化等方面起重要作用［4］。目前研究多關(guān)注于DNA 啟動(dòng)子區(qū)甲基化對(duì)基因表達(dá)的影響，一般認(rèn)為啟動(dòng)子區(qū)低甲基化上調(diào)基因表達(dá)，反之抑制基因表達(dá)，起到類似基因沉默的作用［5］。啟動(dòng)子的甲基化調(diào)控已被證實(shí)具有一定生物學(xué)價(jià)值，不僅與多種癌癥的發(fā)生密切相關(guān)［6-7］，也與哮喘發(fā)病存在一定關(guān)聯(lián)，已有學(xué)者發(fā)現(xiàn)多個(gè)與發(fā)病相關(guān)的低甲基化位點(diǎn)，且證明其與嗜酸性粒細(xì)胞活化、原始T 細(xì)胞數(shù)量減少等環(huán)節(jié)相關(guān)，亦有研究證明特定基因甲基化改變與交通尾氣引起的哮喘密切相關(guān)［8-9］。

組織蛋白酶Z 基因（cathepsin Z gene，CTSZ）位于20 號(hào)染色體上一個(gè)頻繁擴(kuò)增區(qū)域［10］。其可通過影響單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等免疫細(xì)胞的遷移和吞噬、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞間通訊、增殖等功能在宿主免疫防御中起關(guān)鍵作用［11］。同時(shí)，CTSZ 基因被證實(shí)可調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase2，MMP2）及基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase9，MMP9）等在氣道重塑中的關(guān)鍵基因及蛋白表達(dá)［12-13］。但CTSZ 基因及其甲基化水平與哮喘發(fā)病是否相關(guān)尚不明確。因此，本研究通過對(duì)哮喘患者鼻黏膜上皮細(xì)胞中CTSZ 啟動(dòng)子區(qū)兩位點(diǎn)甲基化水平進(jìn)行檢測，分析其甲基化程度與患者哮喘控制情況和肺功能的是否存在關(guān)聯(lián)，進(jìn)而為哮喘的診斷提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象選取2017年9月至2020年6月于江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科門診就診的哮喘患者30 例，其中男20 例，女10 例，平均年齡（41.5 ±10.1）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18 ～65 歲，無吸煙史有自主行為能力；（2）有明確哮喘診斷病史，符合支氣管哮喘防治指南［14］；（3）無過敏性鼻炎病史，無明顯流涕、鼻塞等鼻部癥狀，近期無鼻腔給藥史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有腫瘤、血液病、自身免疫病病史；（2）近1 個(gè)月內(nèi)有上呼吸道感染病史；（3）有除哮喘外的其他呼吸道疾病病史等；（4）糖尿病，高血壓等慢性疾病病史；（5）妊娠狀態(tài)；（6）近1 個(gè)月內(nèi)有糖皮質(zhì)激素應(yīng)用史。對(duì)照組選取30 例同期、同居住地、年齡相近、性別比例相近，無吸煙史及過敏性病史且與哮喘患者無直接血緣關(guān)系的健康體檢者，其中男18 例，女12 例。平均年齡（44.8±8.3）歲。本研究通過江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)SWYXLL20200121-6）且全部受試者均已簽署知情同意書。

1.2 分組標(biāo)準(zhǔn)由呼吸科醫(yī)生按照哮喘控制測試問卷進(jìn)行評(píng)分，根據(jù)評(píng)分結(jié)果將患者分為三組。25 分為控制組、20 ～24 分為部分控制組、19 分以下為未控制組。

1.3 樣本采集及檢測

1.3.1 鼻腔樣本采集清潔鼻腔，少量生理鹽水濕潤鼻腔后以鼻刮匙于下鼻甲處反復(fù)輕刮5 ～10 次，將刮匙下端置入預(yù)先配置好的0.1%膠原酶溶液中，震蕩數(shù)分鐘，37 ℃水浴消化至無明顯絮狀物，12 000 r/min 離心5 min，PBS 清洗后再次離心置于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 DNA 提取及甲基化水平檢測凍存細(xì)胞放至室溫后再次離心，按照DNA 提取試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）使用說明書提取DNA，檢測其質(zhì)量合格后使用重亞硫酸鹽法處理DNA，以Methyl Target 測序法檢測甲基化水平，測序?qū)嶒?yàn)委托上海天昊生物科技有限公司完成。

1.3.3 FEV1及FVC測定使用日本CHEST HI-101肺功能儀檢測進(jìn)行測定，由同一技術(shù)人員操作以保證操作符合歐洲呼吸學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)［15］。患者測試前未吸入支氣管擴(kuò)張劑，重復(fù)測定3 次，誤差＜5%，取最佳測量值，記錄FEV1pred%及FEV1/FVC。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，正態(tài)分布計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較差異性。非正態(tài)分布計(jì)量資料以中位數(shù)及四分位數(shù)間距［M（P25，P75）］表示，以U 檢驗(yàn)比較兩組間差異性。DNA 甲基化水平與哮喘患者肺功能水平相關(guān)性采用Spearman相關(guān)分析。采用MedCalc 軟件繪制受試者工作特征曲線（ROC 曲線），通過曲線下面積（AUC）、敏感性、特異性、約登指數(shù)等來判斷甲基化水平用于哮喘診斷的效能。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 入組患者基本資料哮喘患者與對(duì)照組在年齡、性別、BMI等方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），入組時(shí)肺功能顯著低于正常對(duì)照組（P＜0.05）。

表1 哮喘組及健康對(duì)照組一般臨床資料Tab.1 Characteristics of patients and healthy controls ±s

表1 哮喘組及健康對(duì)照組一般臨床資料Tab.1 Characteristics of patients and healthy controls ±s

年齡（歲）女性［例（%）］BMI FEV1/FVC［M（P25，P75），%］FEV1pred［M（P25，P75），%］哮喘組（n=30）41.5±10.1 10（33.3）25.2±2.1 85.7（78.4，88.9）66.6（62.5，77.1）對(duì)照組（n=30）44.8±8.3 12（40.0）24.9±2.4 96.8（95.8，98.3）95.2（92.8，97.8）P 值0.164 0.595 0.652＜0.001＜0.001

2.2 兩組間甲基化差異如圖1 所示，哮喘患者CTSZ 啟動(dòng)子區(qū)域兩位點(diǎn)均呈顯著低甲基化，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 甲基化水平定量分析Fig.1 Quantitative detection of methylation level

2.3 甲基化水平與哮喘控制情況兩位點(diǎn)均在控制組中呈明顯低甲基化表達(dá)，且甲基化水平隨哮喘控制情況好轉(zhuǎn)逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（cg01623438 位 點(diǎn)P＜0.001，cg02744249 位 點(diǎn)P=0.001）。如圖2。

圖2 按控制情況分組后甲基化水平對(duì)比Fig.2 Differential methylation in different asthma control groups

2.4 肺功能相關(guān)性分析CTSZ啟動(dòng)子中兩位點(diǎn)甲基化水平均與肺功能呈負(fù)相關(guān)，位點(diǎn)cg01623438中FEV1pred%及FEV1/FVC 相關(guān)系數(shù)分別為-0.706（P＜0.001）及-0.643（P＜0.001）；位點(diǎn)cg02744249中FEV1pred%及FEV1/FVC 相關(guān)系數(shù)分別為-0.692（P＜0.001）及-0.554（P=0.002）。見圖3。

圖3 肺功能相關(guān)性分析Fig.3 Correlation analysis of lung function

2.5 ROC曲線分析如圖4，cg01623438用于輔助哮喘診斷時(shí)AUC 為0.806（95%CI：0.683 ～0.896），cut-off 值為0.882 2，敏感性為100%，特異性為50%，P＜0.000 1；cg02744249 用于輔助哮喘診斷時(shí)AUC 為0.749（95%CI：0.620 ～0.852），cut-off 值為≤0.600 3，敏感性為43.3%，特異性為100%，P=0.000 1。當(dāng)進(jìn)行兩位點(diǎn)聯(lián)合分析時(shí)，如圖5 所示，AUC 為0.827（95%CI：0.707 ～0.912），cut-off值為≤0.460 3，敏感性為66.7%，特異性為83.3%，P＜0.000 1。

圖4 兩位點(diǎn)ROC 曲線分析Fig.4 ROC curve analysis of two sites

圖5 兩位點(diǎn)聯(lián)合ROC 曲線分析Fig.5 ROC curve analysis of combined sites

3 討論

哮喘作為常見的呼吸系統(tǒng)慢性疾病，目前診斷主要依賴于呼吸道癥狀及可變呼氣氣流受限的生理證據(jù)［16］。由于其癥狀表現(xiàn)較復(fù)雜，各地區(qū)中存在最高達(dá)70%的哮喘患者未被確診［17］。近年來DNA 甲基化研究理論及技術(shù)快速發(fā)展，為哮喘診治提供了新方向。目前已有較多基因及相關(guān)位點(diǎn)的甲基化被證明與哮喘發(fā)病相關(guān)。例如有研究對(duì)兒童哮喘病例進(jìn)行全基因組甲基化測序分析，在哮喘兒童的不同組織樣本共尋找到多個(gè)與哮喘發(fā)病相關(guān)聯(lián)的甲基化位點(diǎn)及區(qū)域［18］。同時(shí)，甲基化改變也被證明與哮喘患者肺功能下降相關(guān)，并可將其用于肺功能不良和加速衰退期的臨床鑒別［19］。此外，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)母體哮喘可影響特定基因甲基化水平，增加子代哮喘的發(fā)生率［20］。以上研究說明，DNA 甲基化密切參與環(huán)境和遺傳這兩個(gè)引起哮喘發(fā)生的重要環(huán)節(jié)，可能是哮喘診斷的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)CTSZ 基因啟動(dòng)子區(qū)域的兩個(gè)甲基化位點(diǎn)cg01623438 及cg02744249 在哮喘患者中均呈現(xiàn)低甲基化表達(dá)，并且在按哮喘控制情況進(jìn)行分組后發(fā)現(xiàn)未控制組甲基化水平最低，隨控制情況改善而逐漸升高，提示CTSZ 基因在哮喘患者中存在差異性甲基化修飾，并且哮喘組甲基化程度受控制情況影響。哮喘患者目的位點(diǎn)甲基化水平與肺功能均呈負(fù)相關(guān)，結(jié)合其與控制情況關(guān)系可推測出在哮喘組中，甲基化水平降低指向不良預(yù)后，因此在臨床工作中，可對(duì)患者一段時(shí)期治療前后甲基化水平進(jìn)行監(jiān)測，有助于客觀判斷此治療方案對(duì)患者的有效程度，以便于及時(shí)調(diào)整。ROC 曲線分析顯示，兩位點(diǎn)在單獨(dú)用于哮喘診斷時(shí)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，cg01623438 敏感性較高，而cg02744249 特異性較高，當(dāng)結(jié)合兩位點(diǎn)后再次用于哮喘診斷時(shí)，總體敏感性及特異性均有改善，提示CTSZ 啟動(dòng)子甲基化水平在哮喘診斷中具有一定價(jià)值。因此，綜上所述，筆者認(rèn)為本研究中所涉及的CTSZ 啟動(dòng)子區(qū)域兩個(gè)相關(guān)位點(diǎn)均與哮喘發(fā)病密切相關(guān)，且其可能是與肺功能改變相關(guān)的功能性位點(diǎn)，能較為客觀地反應(yīng)哮喘患者肺功能水平。在用于哮喘診斷、用藥反應(yīng)監(jiān)測、肺功能監(jiān)測等方面都有一定價(jià)值。

本研究是首次對(duì)CTSZ 基因啟動(dòng)子甲基化與哮喘的關(guān)聯(lián)性進(jìn)行分析，并且證明其在哮喘診斷及預(yù)后檢測中均具有一定價(jià)值。并且由于已有大量研究證實(shí)鼻黏膜細(xì)胞與支氣管上皮細(xì)胞在結(jié)構(gòu)、功能、應(yīng)激反應(yīng)方面均有一定同一性［21-23］，因此本研究選取了更易被接受且快捷的鼻腔標(biāo)本進(jìn)行研究，為日后擴(kuò)大研究數(shù)目提供可能。

但本研究尚不能說明甲基化改變是哮喘發(fā)生的原因還是結(jié)果，需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。此外，本研究納入樣本量較少，仍需繼續(xù)擴(kuò)大樣本量驗(yàn)證。

綜上，哮喘患者鼻腔細(xì)胞中CTSZ 啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生低甲基化，且其甲基化程度與肺功能改變和控制狀態(tài)具有一定相關(guān)性，在用于哮喘診斷具有一定的敏感性及特異性，推測CTSZ 啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測也許能夠作為一種輔助診斷和治療監(jiān)測的生物標(biāo)志物，但仍需要進(jìn)一步具體研究其相關(guān)機(jī)制。