魏 超 李 曦 郭靈安 代曉航 蔡寅川

（1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，成都610066； 2.四川省阿壩州工業(yè)經(jīng)濟(jì)研究所，四川阿壩藏族羌族自治州624000）

芽苗菜指利用植物種子或其他營養(yǎng)貯存器官，在黑暗或弱光條件下直接生長出可供食用的芽、芽苗、芽球、幼梢或幼莖類蔬菜，是一種典型的水培蔬菜[1]。芽苗菜水培中極易受到食源性微生物污染,尤其是蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）[2]的污染。該細(xì)菌對外界有害因子抵抗力強(qiáng)，分布廣，是典型的菌體細(xì)胞，有部分菌株能產(chǎn)生腸毒素[3]。蠟樣芽孢桿菌食品污染有嘔吐型和腹瀉型兩種公認(rèn)類型[4]，而嘔吐毒素具有耐熱性[5]。蠟樣芽孢桿菌在我國的產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)中少有限量，但在多數(shù)國外標(biāo)準(zhǔn)中有限量要求。劉芳等[6]對國際食品法典委員會、歐盟、澳大利亞和新西蘭、英國、韓國、中國等國家和地區(qū)的即食食品微生物限量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了比較，雖然不同國家或是地區(qū)對蠟樣芽孢桿菌污染評判標(biāo)準(zhǔn)解釋略有差異，但綜合各國標(biāo)準(zhǔn)，蠟樣芽孢桿菌在即食食品中安全限量范圍為≤3 logCFU/g。對蠟樣芽孢桿菌的具體安全評價(jià)還需要關(guān)注其具體附著的產(chǎn)品及在產(chǎn)品中生長消亡的情況等綜合評價(jià)[7～8]。

本研究從芽苗菜種子著手，采用電鏡的方法觀察蠟樣芽孢桿菌對其的附著與內(nèi)化，并跟蹤蠟樣芽孢桿菌在芽苗菜生長過程中的變化量，然后建立各溫度下蠟樣芽孢桿菌預(yù)測模型，旨在對芽苗菜蠟樣芽孢桿菌的污染存活情況進(jìn)行定量評估和科學(xué)預(yù)測，為芽苗菜的貯存方式及貨架期的科學(xué)引導(dǎo)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

一、材料與方法

（一）材料、試劑與儀器

1.材料。芽苗菜 （包括豌豆苗50 份、麻子豆苗35 份，松柳苗35 份，金絲柳苗10 份，花生芽苗10 份，空心菜苗10 份），150 份樣品購于成都大型超市及成都某生產(chǎn)基地，每年度50 份樣品，芽苗菜樣品為成都市芽苗菜污染水平調(diào)查樣品。豌豆豆苗種子購于生產(chǎn)基地，用于芽苗菜人工污染及伴隨生長微生物統(tǒng)計(jì)研究樣品。

蠟樣芽孢桿菌 （ATCC11778），購于中國科學(xué)院微生物研究所。將菌株保存于含有50%甘油生理鹽水溶液浸潤的納米磁珠中，存于－80℃冰箱。

2.試劑。甘露醇卵黃多黏菌素（MYP）瓊脂、緩沖蛋白胨水 （BPW）、營養(yǎng)瓊脂，購于廣東環(huán)凱生物科技有限公司； 0.75%NaCl （法國梅里埃公司）； 乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Scientific 公司）； 乙醇（色譜純，F(xiàn)isher Scientific 公司）； 甲酸 （色譜純，TEDIA）； α－氰基－4－羥基肉桂酸 （α－cyano－4－h(huán)ydroxycinnamic acid CHCA）（suitable for MALDITOF－MS，SIGMA 公司），實(shí)驗(yàn)用水均為ddH2O。

3.儀器。AXIMA Confidence MALDI－TOFMS （日本島津），ATB 微生物鑒定儀 （法國梅里埃），DHP－9082 生化培養(yǎng)箱（寧波東南），全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)器（杭州訊數(shù)），SU3500 掃描電鏡（日本HITACHI）。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.芽苗菜中蠟樣芽孢桿菌的計(jì)數(shù)。芽苗菜樣品中蠟樣芽孢桿菌污染調(diào)查的計(jì)數(shù)方法參照GB 4789.14－2014 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》[9]中法一。確定性驗(yàn)證采用基質(zhì)輔助解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法 （MALDI－TOF MS）。

質(zhì)譜前處理： 取菌適量加入乙醇水溶液 （V∶V＝70∶30）0.75 mL，震蕩40 s，常溫40 kHz 超聲10 min，離心1 min 棄去上清液，用滅菌牙簽蘸取菌量約0.5 μL 將其薄涂于金屬靶板接種于φ2.5 mm 孔中，微生物上面覆蓋1.0 μL CHCA。

質(zhì)譜條件： 模式Mode liner SARAMIS，能量轉(zhuǎn)角78～82，收集范圍2000～20000 （m/z），每樣品100 次收集峰疊加，校準(zhǔn)品ATCC 8739 大腸桿菌。收集質(zhì)譜圖譜導(dǎo)入SARAMIS 數(shù)據(jù)庫，與數(shù)據(jù)庫中標(biāo)準(zhǔn)菌株的譜圖進(jìn)行多重比較，獲得鑒定相關(guān)結(jié)果。

2.種子的人工污染與生長中蠟樣芽孢桿菌檢驗(yàn)。種子預(yù)處理： 將芽苗菜種子置于75%酒精水溶液中浸泡1 min 并揉搓，無菌水沖洗，1 h 重復(fù)1次，反復(fù)操作3 次，在無菌環(huán)境下將種皮上水分揮干。

蠟樣芽孢桿菌侵染： 將蠟樣芽孢桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上活化，36℃培養(yǎng)24 h，用接種環(huán)挑取單菌落菌量若干，在無菌生理鹽水中調(diào)至0.5 麥?zhǔn)蠞岫龋∕cF），取2 mL 菌液接種于200 mL BPW 培養(yǎng)基，并稱取150 g 種子混合均勻，進(jìn)行侵染，36℃培養(yǎng)2 h，除去浸泡液，在無菌情況下將種皮表面水分揮干。測定此時(shí)芽苗菜種子上所帶蠟樣芽孢桿菌菌量，為第1 次計(jì)數(shù)，并按照芽苗菜培養(yǎng)規(guī)律進(jìn)行泡豆、出芽發(fā)芽培養(yǎng)。無菌水泡豆，在48 h 后出小芽，對此時(shí)蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行第2次計(jì)數(shù)； 出小芽后排水晾干，12 h 后芽頭整齊，對蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行第3 次計(jì)數(shù)； 無菌水進(jìn)行噴淋，27 h 后芽苗菜生長大概為15 cm，對其進(jìn)行第4 次蠟樣芽孢桿菌計(jì)數(shù)； 待芽苗菜生長為30 cm 左右時(shí)，對其進(jìn)行第5 次蠟樣芽孢桿菌計(jì)數(shù)，每次計(jì)數(shù)進(jìn)行5 次生物學(xué)重復(fù)。

3.蠟樣芽孢桿菌的附著與內(nèi)化觀察。將上文中感染蠟樣芽孢桿菌種子PBS 緩沖液 （pH 值為7.2）漂洗樣品10 min，共3 次； 梯度脫水，分別用30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇，充分浸泡樣品，每次10 min ，最后用無水乙醇充分浸泡樣品，每次15 min，共2 次。戊二醇固定冷藏過夜，10%乙醇+CO2臨界點(diǎn)交換1 h后噴金，送入掃描電鏡進(jìn)行觀察。

4.生長模型的建立與驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)在4 ℃、15℃、20℃、25℃、35℃條件下設(shè)置溫度點(diǎn)，在0、2、4、6、8、16、20、24、28、36、48、60、72、84、96 h 選擇溫度點(diǎn)采用上文的方法進(jìn)行蠟樣芽孢桿菌計(jì)數(shù)，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入ComBase 數(shù)據(jù)庫的在線軟件DMFit （version2018）[10]的非線性擬合模塊，選取Baranyi 模型作為一級模型進(jìn)行曲線擬合，方程式見公式（1）～（3）。

上述公式中，t為時(shí)間 （h）；Y（t）為t時(shí)的菌數(shù) （CFU/g）；Y0為初始菌數(shù) （CFU/g）；Ymax為最大菌數(shù) （CFU/g）；μmax為最大比生長速率；λ表示遲滯時(shí)間（h）；h0表示初始時(shí)細(xì)胞的生理狀態(tài)。

采用二級模型描述比生長速率μ與貯藏溫度的關(guān)系，方程式見公式（4）。

公式 （4）中，μmax表示比生長速率 （h－1），T表示實(shí)測溫度 （℃），T0表示微生物生長的理論最低溫度 （℃）。

為了評價(jià)建立的動(dòng)力學(xué)模型預(yù)測值的可靠性，實(shí)驗(yàn)采用內(nèi)部驗(yàn)證，采用均方根誤差 （root Mean square error，RMSE）、準(zhǔn)確因子 （accuracy factor，Af）和偏差因子 （bias factor，Bf）對預(yù)測值和實(shí)測值進(jìn)行分析檢驗(yàn)[15]。RMSE、Af和Bf表達(dá)式見公式（5）～（7）。

公式（5）～（7）中，Nobs表示實(shí)測值，Npre表示應(yīng)用模型得到的預(yù)測值，n是觀測值個(gè)數(shù)。

二、結(jié)果與分析

（一）蠟樣芽孢桿菌在芽苗菜中的調(diào)查情況采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法連續(xù)3年對成都地區(qū)的芽苗菜的蠟樣芽孢桿菌的污染狀況進(jìn)行調(diào)查，結(jié)果見表1，蠟樣芽孢桿菌鑒定質(zhì)譜圖見圖1，其中陽性檢出的定量分析的比率見圖2。綜合表1 中本次調(diào)查蠟樣芽孢桿菌的陽性比率雖然高達(dá)25.3%，但對其定量計(jì)數(shù)結(jié)果中只有2%的樣品中蠟樣芽孢桿菌＞103（CFU/g）。圖2 為蠟樣芽孢桿菌陽性檢出中定量結(jié)果的分布，由圖2 可以看出，高達(dá)49%的蠟樣芽孢桿菌陽性樣品中定量檢測數(shù)目范圍在1＜檢出值≤2 （logCFU/g），其次的分布范圍為2＜檢出值≤3（logCFU/g），但仍有8%的陽性樣品＞3 （logCFU/g）。調(diào)查結(jié)果表明，芽苗菜中存在蠟樣芽孢桿菌污染的安全隱患，需要對其進(jìn)行進(jìn)一步研究。

表1 芽苗菜中蠟樣芽孢桿菌篩查結(jié)果

（二）蠟樣芽孢桿菌在芽苗菜種子表面的附著與內(nèi)化觀察有研究表明，芽菜類的微生物污染主要來源于種子[11]。電鏡觀察下芽苗菜種子表皮上的蠟樣芽孢桿菌見圖3，可以看出，豌豆苗的種子微觀結(jié)構(gòu)下具有很多皺褶，在一定程度上有助于蠟樣芽孢桿菌的附著，且在電鏡前處理的不同濃度的乙醇水溶液的層次洗脫下，蠟樣芽孢桿菌仍保有一定數(shù)量的附著且較明顯地被觀察到，可見蠟樣芽孢桿菌極易附著在芽苗菜種皮上且不易被消除。此外，對種皮內(nèi)側(cè)進(jìn)行觀察時(shí)也發(fā)現(xiàn)了蠟樣芽孢桿菌（見圖4），表明蠟樣芽孢桿菌有可能產(chǎn)生內(nèi)化現(xiàn)象，成為芽苗菜微生物污染的主要來源和不可消除危害。

圖1 蠟樣芽孢桿菌的鑒定質(zhì)譜圖

圖2 蠟樣芽孢桿菌陽性分布情況

圖3 電鏡下芽苗菜種子表皮上的蠟樣芽孢桿菌

圖4 電鏡下芽苗菜種皮內(nèi)側(cè)的蠟樣芽孢桿菌

（三）蠟樣芽孢桿菌在芽苗菜生長過程中的動(dòng)態(tài)變化根據(jù)芽苗菜生長發(fā)育的不同時(shí)期，選取5個(gè)時(shí)間點(diǎn)對芽苗菜中蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量進(jìn)行監(jiān)控，其蠟樣芽孢桿菌變化的數(shù)量見圖5，可以看出，在泡豆時(shí)期，蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量略有上升，在出芽后，隨著芽苗體的生長，蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量在逐漸下降，到達(dá)收割期，蠟樣芽孢桿菌降低的數(shù)量級大概為2 個(gè)對數(shù)單位，但其總數(shù)目仍＞3 logCFU/g，在不可接受的范圍內(nèi)。可見種子的總污染量會影響出苗甚至產(chǎn)品中微生物污染的總量，芽苗菜的種子種植為水培環(huán)境，水分活度較高，但相對營養(yǎng)貧瘠，蠟樣芽孢桿菌在芽苗菜生長后有一個(gè)明顯衰減過程，但其對環(huán)境抗逆性較好，90 h 內(nèi)衰減數(shù)量達(dá)不到可以安全接受的數(shù)量。

圖5 芽苗菜生長過程中蠟樣芽孢桿菌的數(shù)量變化

圖6 不同溫度下蠟樣芽孢桿菌在芽苗菜中擬合變化趨勢

（四）芽苗菜貯藏過程中蠟樣芽孢桿菌生長模型的建立與驗(yàn)證

1.一級模型的建立。芽苗菜在不同貯藏溫度下，蠟樣芽孢桿菌在貯藏期內(nèi)的變化趨勢擬合生長如圖6 所示，可以看出，4℃貯藏時(shí)，基本沒有明顯的生長。15℃貯藏時(shí)，細(xì)菌生長較緩慢，遲滯期約24 h，隨后進(jìn)入指數(shù)生長期，70 h 后細(xì)菌增長量超過4.5 （logCFU/g）。20℃貯藏時(shí)，細(xì)菌生長遲滯期約17 h，隨后進(jìn)入指數(shù)生長期，24 h 后細(xì)菌增長量超過4.5 （logCFU/g）。25℃貯藏時(shí)，細(xì)菌生長較快，遲滯期不到1 h ，隨后進(jìn)入指數(shù)生長期，24 h后細(xì)菌增長量超過4.5 （logCFU/g）。35℃條件下，細(xì)菌生長迅速，貯藏開始后細(xì)菌數(shù)量顯著增加，14.4 h 后細(xì)菌增長量超過4.5 （logCFU/g）。結(jié)合調(diào)研情況，四川省規(guī)?；N植戶在芽苗菜采后一般采用冷藏（10℃及以下）和低溫（15℃）通風(fēng)方式保藏，多數(shù)作坊式生產(chǎn)者只能采用常溫通風(fēng)方式保藏。冷藏保存時(shí)長通常不會超過1 周，常溫則視情況不超過2 d 內(nèi)銷售。在運(yùn)輸環(huán)節(jié)，未使用冷鏈，從生產(chǎn)地到流通市場大概需要0.5 至2 h。因此，在非冷藏條件下，收、貯、運(yùn)各環(huán)節(jié)都有可能為病原細(xì)菌的增殖提供條件，從而引發(fā)食品安全問題。從本研究結(jié)果看，冷藏可減少蠟樣芽孢桿菌數(shù)量，是最理想的采后貯藏方式。然而，冷藏成本較高，較難大范圍推廣。低溫通風(fēng)貯藏（15℃）也可在一定時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)菌繁殖，貯藏時(shí)間應(yīng)少于24 h。

采用Baranyi 模型擬合參數(shù)見表2?；貧w系數(shù)（R2）在0.942～0.972，說明此模型對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的擬合度較好。比生長速率 （μmax）較低與芽苗菜表面弱營養(yǎng)條件有關(guān)，但是其比生長速率也規(guī)律性地隨著溫度的增加而增加； 生長遲滯期隨著溫度的升高逐漸降低。

表2 芽苗菜中蠟樣芽孢桿菌Baranyi 模型擬合參數(shù)

2.二級模型的建立。根據(jù)Baranyi 模型擬合后得到各溫度下蠟樣芽孢桿菌在芽苗菜中的最大比生長速率，以溫度為橫坐標(biāo)，最大生長速率平方根為縱坐標(biāo)，在EXCEL 里面建立生長曲線 （見圖7），溫度與μmax1/2呈現(xiàn)較好的線性關(guān)系，模型中R2＝0.981，溫度與μmax的平方根方程為μmax1/2＝0.0057× （T+16.4）

圖7 蠟樣芽孢桿菌平方根線性二級生長曲線

3.模型可靠性評價(jià)。分別在15℃、20℃、25℃、35℃下，在8 個(gè)隨機(jī)時(shí)間點(diǎn)（單位為h）進(jìn)行模型的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，測定該時(shí)間點(diǎn)的菌數(shù)值，并將實(shí)驗(yàn)測定的值與該點(diǎn)模型的預(yù)測值比較，進(jìn)行準(zhǔn)確因子及偏差因子分析，結(jié)果見表3。由結(jié)果可見，Af代表了每一個(gè)預(yù)測值的點(diǎn)與等值線之間的平均距離，可以衡量預(yù)測值和觀測值之間的接近程度[12]，實(shí)驗(yàn)中Af的值在1 附近，表示模型的穩(wěn)定性較高，Bf用來判斷預(yù)測值在等值線的上方還是下方以及評價(jià)預(yù)測值偏離等值線的程度[12]，本實(shí)驗(yàn)中Bf＞1，說明該模型為有效保護(hù)模型。RMSE值一般用來驗(yàn)證預(yù)測模型的離散程度[13]，實(shí)驗(yàn)中RMSE＜0.15，表明實(shí)測數(shù)據(jù)和預(yù)測模型數(shù)據(jù)離散程度較小。

表3 驗(yàn)證結(jié)果

三、討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在連續(xù)3年對芽苗菜蠟樣芽孢桿菌污染調(diào)查的基礎(chǔ)上，從芽苗菜種子開始，對蠟樣芽孢桿菌的附著、生長進(jìn)行研究，并對芽苗菜收割后儲存過程中建立了不同溫度的蠟樣芽孢桿菌在芽苗菜中生長預(yù)測模型。在對芽苗菜蠟樣芽孢桿菌污染調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌以高檢出頻率出現(xiàn)在芽苗菜中，雖然大部分陽性計(jì)數(shù)結(jié)果在可接受的范圍內(nèi)，但仍有2%存在蠟樣芽孢桿菌食用風(fēng)險(xiǎn)。對于蠟樣芽孢桿菌來源，本實(shí)驗(yàn)認(rèn)為種子帶入可為主要來源，電鏡結(jié)果也可看出，蠟樣芽孢桿菌可附著于種皮表面且內(nèi)化到種皮內(nèi)部。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在種子種植的過程中蠟樣芽孢桿菌的總體污染量雖然有所降低，但是因其抗逆性強(qiáng)的特征，分析其污染水平的降低原因，可能是種苗種植過程中芽苗菜總體質(zhì)量的增大，導(dǎo)致每克芽苗菜中蠟樣芽孢桿菌數(shù)目的減少，在后續(xù)產(chǎn)品中，蠟樣芽孢桿菌會隨著貯藏溫度及貯藏時(shí)間的變化而變化，其變化規(guī)律符合微生物生物特征。結(jié)合調(diào)研結(jié)果，在非冷藏條件下，收、貯、運(yùn)各環(huán)節(jié)都有可能為病原細(xì)菌的增殖提供條件，從而引發(fā)食品安全問題。芽苗菜生產(chǎn)后的冷藏可減少蠟樣芽孢桿菌數(shù)量，但冷藏成本較高，低溫通風(fēng)貯藏也可在一定時(shí)間內(nèi)抑制細(xì)菌繁殖，但貯藏時(shí)間應(yīng)少于24 h。即食芽苗菜作為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)品已經(jīng)越來越受到消費(fèi)者肯定，但是在20 世紀(jì)90年代，美國曾爆發(fā)了嚴(yán)重的芽苗菜污染和大規(guī)模食物中毒事件。生鮮果蔬中微生物安全問題主要可以通過4 方面措施得到保證，一是明確即食生鮮果蔬從種植到食用各環(huán)節(jié)可能帶來的微生物污染風(fēng)險(xiǎn)； 二是針對性的對病源微生物進(jìn)行檢測和監(jiān)控； 三是找到污染源頭并進(jìn)行控制； 四是找到合適的加工方式來控制[7，11]。本研究明確了芽苗菜種子環(huán)節(jié)帶來的微生物風(fēng)險(xiǎn)，并提出危害識別微生物蠟樣芽孢桿菌，對整個(gè)生產(chǎn)過程進(jìn)行檢測和監(jiān)控，找到微生物生長規(guī)律，并以科學(xué)研究為基礎(chǔ)對后續(xù)貯藏加工進(jìn)行指導(dǎo)。本研究結(jié)果將為鮮食蔬菜上微生物定量風(fēng)險(xiǎn)評估提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。