宋梓豪 石會(huì)娟 王 鵬 趙 文 張金振 黃京平 金 玥

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093）

磺胺類藥物是一類具有對(duì)氨基苯磺酰結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌類藥物，目前約有150 種[1]。由于其價(jià)格低廉、穩(wěn)定、高效等特點(diǎn)，在畜牧業(yè)和獸醫(yī)臨床中已廣泛用于預(yù)防和治療細(xì)菌感染[2～4]。在養(yǎng)蜂業(yè)中，磺胺及其增效劑可用于防治蜂群高發(fā)病美洲幼蟲腐臭病、歐洲幼蟲腐臭病等細(xì)菌性幼蟲病，有利于降低蜜蜂死亡率[5～6]。但是由于磺胺類藥物在動(dòng)物體內(nèi)代謝、降解緩慢，大量違規(guī)用藥，會(huì)造成磺胺類藥物在蜜蜂體內(nèi)殘留，并遷移至蜂產(chǎn)品中[3，7～10]。長(zhǎng)期食用此類蜂產(chǎn)品，會(huì)引發(fā)過敏、抗藥性，甚至導(dǎo)致造血紊亂等問題，直接危害人體健康。同時(shí)磺胺增效劑三甲氧芐氨嘧啶在人體內(nèi)蓄積會(huì)引起骨髓微核抑制，偶發(fā)有白細(xì)胞、血小板的減少等癥狀；磺胺增效劑二甲氧芐氨嘧啶現(xiàn)已確定具有遺傳毒性[11]。目前，大多數(shù)國家都禁止在蜜蜂飼養(yǎng)過程中使用磺胺類藥物。

我國已建立多個(gè)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)用于蜂產(chǎn)品中磺胺類藥物的殘留檢測(cè)，主要包括GB/T 18932.17-2003

《蜂蜜中16 種磺胺殘留量的測(cè)定方法 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》 和GB/T 22943-2008 《蜂蜜中三甲氧芐氨嘧啶殘留量的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》。這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)前處理方法均采用固相萃取法，其中GB/T 18932.17-2003 需采用陽離子交換柱、親水親脂平衡（HLB）固相萃取柱，兩步固相萃取方法對(duì)蜂蜜樣品進(jìn)行凈化，前處理過程較為復(fù)雜。目前，已用于食品中磺胺類藥物檢測(cè)的前處理方法主要有液液萃取[7，12]、固相萃取[13～14]和固相微萃取方法[15～16]?；诠滔辔⑤腿〉?QuEChERS 方法由于其簡(jiǎn)便、快速、高效等特點(diǎn)，目前被廣泛用于食品中農(nóng)藥和獸藥的檢測(cè)[17～21]。本文采用QuEChERS前處理方法和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS/MS）檢測(cè)技術(shù)，研究建立蜂蜜中23 種磺胺和3 種磺胺增效劑類藥物的快速、高效、高通量檢測(cè)方法，并與混合型強(qiáng)陽離子交換（MCX）和非極性/ 陽離子交換（PCX）固相萃取前處理方法進(jìn)行比較。

一、材料與方法

（一）材料與儀器

1.測(cè)試樣品。本試驗(yàn)測(cè)試所用蜂蜜樣品購買于超市。

2.材料與試劑。23 種磺胺類藥物： 磺胺醋酰（ sulfacetamide，CAS： 144 -80 -9），磺 胺 脒（sulfaguanidine，CAS： 57-67-0）、磺 胺 吡 啶（sulfapyridine，CAS： 144 -83 -2）、磺 胺 嘧 啶（sulfadiazine，CAS： 68-35-9）、磺胺甲基異噁唑（sulfamethoxazole，CAS： 723-46-6）、磺胺噻唑（sulfathiazole，CAS： 72-14-0）、磺胺甲基嘧啶（sulfamerazine，CAS： 127-79-7）、磺胺二甲異噁唑（sulfisoxazole，CAS： 127 -69 -5）、磺 胺 惡 唑（sulfamoxole，CAS： 729-99-7）、磺胺甲噻二唑（sulfamethizole，CAS： 144-82-1）、磺 胺 苯 酰（sulfabenzamide，CAS： 127-71-9）、磺胺二甲嘧啶（sulfamethazine，CAS： 57-68-1）、磺胺二甲異嘧啶（sulfisomidine，CAS： 515-64-0）、磺胺間甲氧嘧啶 （sulfamonomethoxine，CAS： 1220-83-3）、磺胺對(duì)甲氧嘧啶 （sulfameter，CAS： 651-06-9）、磺 胺 甲 氧 噠 嗪 （sulfamethoxypyridazine，CAS：80-35-3）、磺 胺 氯 吡 嗪 （sulfachloropyrazine，CAS： 102-65-8）、磺胺氯噠嗪 （sulfachloropyrid azine，CAS： 80-32-0）、磺胺喹噁啉 （sulfaquinoxaline，CAS： 59-40-5）、磺胺鄰二甲氧嘧啶 （sulfadoxin，CAS： 2447-57-6）、磺胺間二甲氧嘧啶（sulfadimethoxine，CAS： 122-11-2）、磺胺苯吡唑 （sulfaphenazole，CAS： 526-08-9）、磺胺硝苯（sulfanitran、CAS： 122-16-7），3 種磺胺增效劑：二甲氧芐氨嘧啶 （diaveridine，CAS： 5355-16-8）、二甲氧甲基苯氨嘧啶 （ormetoprim，CAS： 6981-18-6）、三甲氧芐氨嘧啶 （trimethoprim，CAS：738-70-5），所有標(biāo)準(zhǔn)品純度均≥98%，均購于阿爾塔科技有限公司 （First Standard）； 乙腈、甲酸，色譜純，購于美國 Fisher Scientific； 氯化鈉 （分析純）、無水硫酸鈉 （分析純）、乙二胺-N-丙基硅烷（primary secondary amine，PSA，40～60 μm）吸附劑、十八烷基硅烷鍵合硅膠 （C18，40～60 μm）吸附劑、PCX 固相萃取柱（60 mg，3 mL）均購于美國安捷倫公司； MCX 固相萃取柱 （60 mg，3 mL），購于美國沃特世公司； 試驗(yàn)用水均為超純水。

3.儀器與設(shè)備。UHPLC-MS/MS，電噴霧電離源 （ESI）（6495，安捷倫，美國）； 分析天平 （萬分之一天平，梅特勒-托利多，上海）； 高速離心機(jī)（CR22GⅡ，日立，日本）； 超純水儀（Integral5，Milli-Q，美國）。

4.標(biāo)準(zhǔn)溶液配制。（1）26 種磺胺類藥物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 （0.1 mg/mL）的配制： 準(zhǔn)確稱取適量的每種磺胺標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇配成0.1 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，該溶液在-20℃保存，可使用 6 個(gè)月。（2）基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液： 用空白樣品提取液稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配成不同濃度的基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，在4℃保存，當(dāng)天配制。

（二）實(shí)驗(yàn)方法

1.色譜條件。色譜柱為安捷倫 Poroshell 120EC-C18 色譜柱 （2.1×100 mm，2.7 μm）； 流動(dòng)相： A 相為 0.1%甲酸溶液，B 相為乙腈； 柱溫為35℃； 流速為 0.3 mL/min； 進(jìn)樣量為 5 μL。梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序

2.質(zhì)譜條件。離子源為電噴霧離子源，正離子模式； 掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè) （MRM）； 干燥氣溫度為350℃； 干燥氣流速為7 L/min； 霧化器壓力為 40 psi； 鞘氣溫度為350℃； 鞘氣流速為 12 L/min； 毛細(xì)管電壓為 3 500 V； 噴嘴電壓為 0 V；選擇離子參數(shù)設(shè)定見表2。

3.樣品前處理方法。（1）QuEChERS： 稱取蜂蜜樣品 5.0 g （精確至±0.05 g）于 50 mL 塑料離心管中，加入 5 mL 水渦旋混勻。加入 10 mL 乙腈渦旋振蕩 5 min，加入 4 g Na2SO4和 1 g NaCl 渦旋振蕩 1 min，于 4℃下 8 000 r/min 離心 5 min。吸取 6 mL 上清液加入含有 50.0 mg PSA、150.0 mg C18和900.0 mg Na2SO4的15 mL 離心管中，渦旋混勻1 min。于 4℃下 8 000 r/min 離心 5 min，準(zhǔn)確吸取2 mL 上清液于10 mL 離心管中，40℃水浴中氮吹至近干。加入 1 mL 乙腈-水溶液復(fù)溶 （1∶9，v/v），經(jīng) 0.22 μm PES 濾膜過濾后待測(cè)。（2）固相萃?。?主要參考國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 22947-2008 和GB/T 18932.17-2003 的前處理方法并進(jìn)行了優(yōu)化。稱取蜂蜜樣品5.0 g 于50 mL 具塞的聚丙烯試管中，加入20 mL 水，加入0.5 mL 50%三氯乙酸溶液，快速振搖 1 min，以 8 000 r/min 離心 5 min，移取上清液至三角瓶中，再向殘?jiān)屑尤?5 mL三氯乙酸溶液（1%），重復(fù)提取1 次，合并上清液，待凈化。取PCX 固相萃取柱 （或MCX 固相萃取柱），依次用 5 mL 甲醇、5 mL 水活化固相萃取柱，將上述待凈化樣品以＜3 mL/min 流速通過小柱，待樣液完全流出后，依次用 5 mL （0.1 mol/L）鹽酸溶液和5 mL 純甲醇洗柱，棄去全部流出液。用6 mL 氨水-甲醇 （1∶19）溶液洗脫，收集洗脫液于10 mL 濃縮管中，40℃下氮吹濃縮至近干，準(zhǔn)確加入 1.0 mL 乙腈-水溶液（1∶9，v/v）溶解殘?jiān)?，樣液過 0.2 μm 濾膜后，供 UHPLC-MS/MS 測(cè)定。

表2 MRM 監(jiān)測(cè)模式下26 種磺胺及磺胺增效劑的質(zhì)譜采集參數(shù)

二、結(jié)果與分析

（一）QuEChERS 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化QuECh-ERS 包含液液萃取和固相微萃取凈化兩步。提取溶劑和吸附劑的選擇是決定QuEChERS 前處理方法提取效率和凈化效率的關(guān)鍵參數(shù)。目前常用于蜂蜜中獸藥殘留提取的溶劑有乙腈、甲醇和乙酸乙酯。已有研究表明，乙腈可有效提取蜂蜜[5，16]、蛋及蛋制品[21]等樣品中的磺胺類藥物。因此，本文選用乙腈作為提取溶劑。

QuEChERS 常用的吸附劑主要是C18、PSA。C18 具有去除脂肪的功能，而PSA 主要可以去除脂肪酸、糖、有機(jī)酸、酯類以及少量色素[19]。C18和PSA 聯(lián)合使用已廣泛用于食品中多種獸藥、農(nóng)藥的凈化提取。由于蜂蜜中主要含有糖 （80%，果糖+ 葡萄糖）以及少量的氨基酸、蛋白質(zhì)和脂肪，因此選用C18+PSA 吸附劑組合對(duì)樣品基質(zhì)進(jìn)行凈化，更有利于減少基質(zhì)干擾。為優(yōu)化吸附劑的使用劑量，本研究選取兩組不同劑量的吸附劑：（1）50 mg 的 C18 和 150 mg 的 PSA；（2）400 mg 的 C18和400 mg 的PSA。兩組不同劑量組合的吸附劑處理下，添加樣品 （5.0 μg/kg）中 26 種化合物的回收率分布情況如圖1 所示，可以看出，增加吸附劑的使用劑量并未能提高待測(cè)組分的回收率，反而會(huì)引起過量吸附劑吸附樣品中的待測(cè)組分，從而導(dǎo)致回收率偏低。因此，本文選用 50 mg C18、150 mg PSA 作為吸附劑的最優(yōu)化劑量。

容裕棠等[16]利用胺丙基鍵合硅膠 （NH2），建立了蜂蜜中21 種磺胺的QuEChERS 前處理方法。與該方法相比，本研究利用PSA 和C18 作為吸附劑建立的QuEChERS 方法進(jìn)一步拓展了磺胺類藥物的檢測(cè)范圍，不僅增加了二甲氧芐氨嘧啶、二甲氧甲基芐氨嘧啶兩種常見的磺胺增效劑，同時(shí)該方法還能夠有效提取磺胺脒和磺胺醋酰這類極性較強(qiáng)的磺胺類藥物。并且由于PSA 和C18 凈化范圍廣、適用性強(qiáng)，采用其作為吸附將有利于此方法推廣至其他蜂產(chǎn)品和畜產(chǎn)品檢測(cè)中。

（二）QuEChERS 方法與固相萃取法相比較目前國家標(biāo)準(zhǔn)方法對(duì)動(dòng)物源性食品 （蜂蜜、蜂王漿、牛奶、肉等）中磺胺類藥物以及磺胺增效劑的前處理方法主要為固相萃取法[22]。梁兆斌等[23]采用MCX 固相萃取柱成功實(shí)現(xiàn)蜂蜜中13 種磺胺類藥物的有效提取。本研究將已建立的QuEChERS 方法與固相萃取法進(jìn)行比較。通過使用PCX、MCX 和QuEChERS 分別處理已知濃度（5 μg/kg）的空白添加樣品，對(duì)比其回收率，比較了不同前處理方法的有效性和準(zhǔn)確性。從圖1 可以看出，PCX 和MCX固相萃取方法回收率分布相似。然而，極性較強(qiáng)的磺胺脒、磺胺醋酰以及磺胺嘧啶、磺胺氯吡嗪、磺胺苯吡唑、磺胺苯酰等藥物的回收率均低于70%。而使用本研究建立的QuEChERS 方法，26 種藥物的回收率均為 80%～120%。由此可見，采用QuEChERS 方法，上述極性較強(qiáng)的藥物均獲得了較好的回收率，可以更有效地同時(shí)提取蜂蜜中26種磺胺及其增效劑類藥物。

（三）方法學(xué)評(píng)價(jià)

圖1 不同前處理方法26 種化合物的回收率分布情況

1.基質(zhì)效應(yīng)?；|(zhì)效應(yīng) （ME）是通過比較基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率和純?cè)噭┡渲频臉?biāo)準(zhǔn)溶液獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率來評(píng)估基質(zhì)干擾情況，一般以兩者比值進(jìn)行評(píng)估； 得到的ME＞120%為基質(zhì)增強(qiáng)，ME＜80%為基質(zhì)抑制[24]。從表 3 中結(jié)果可以看出，4 種磺胺藥物存在基質(zhì)抑制 （磺胺脒、磺胺二甲嘧啶、磺胺二甲異嘧啶、磺胺硝苯），1 種藥物 （磺胺間二甲氧嘧啶）表現(xiàn)為基質(zhì)增強(qiáng)，為了消除基質(zhì)帶來的影響，本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)樣品組分進(jìn)行定量測(cè)定。

2.線性?？瞻讟悠方?jīng)前處理，得到空白基質(zhì)溶液，并用空白基質(zhì)溶液配制一系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5、1.0、5.0、10、50 和 100 μg/L），繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果顯示，26 個(gè)目標(biāo)化合物在0.5 ～100 μg/L 范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r2）＞0.999。

3.檢出限與定量限。以3 倍信噪比計(jì)算，得到該方法檢出限 （LOD）； 以10 倍信噪比計(jì)算，得到該方法定量限（LOQ）[25]。26 種磺胺及磺胺增效劑的 LOD 為 0.08～0.57 μg/kg，LOQ 為 0.26 ～1.91 μg/kg。該方法的LOD 均低于現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)（磺胺類為 1～12 μg/kg，三甲氧芐氨嘧啶為 2 μg/kg），具體結(jié)果見表3。

4.回收率和精密度。為考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，進(jìn)行了添加回收試驗(yàn)。按照上述處理和測(cè)定方法，在空白蜂蜜樣品中添加3 個(gè)不同濃度 （1 、5、10 μg/kg），每個(gè)水平設(shè) 5 個(gè)平行，在不同時(shí)間重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 批。26 種藥物的回收率以及批次內(nèi)、批次間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）結(jié)果見表4。試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法在3 個(gè)濃度的添加回收率均為80%～120%，批次內(nèi) RSD 為1.45%～8.89%，批次間RSD 為1.73%～10.73%。方法準(zhǔn)確度和精密度均可滿足檢測(cè)要求。

（四）實(shí)際樣品測(cè)定利用所建立的方法對(duì)市場(chǎng)上購買的50 批次蜂蜜樣品進(jìn)行測(cè)定，未有磺胺類藥物檢出。

表3 26 個(gè)化合物的基質(zhì)效應(yīng)、回歸系數(shù)、定量限與檢出限

表4 蜂蜜中26 種磺胺類藥物添加回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

三、結(jié)論

本文利用QuEChERS 前處理技術(shù)與UHPLCMS/MS 檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了蜂蜜中26 種磺胺及其增效劑的高效、高通量、高靈敏度檢測(cè)。該方法LOD 與LOQ 低于目前現(xiàn)有國家標(biāo)準(zhǔn)方法。與傳統(tǒng)的固相萃取方法相比，不僅簡(jiǎn)化了前處理過程，縮短檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)拓展了目標(biāo)化合物的檢測(cè)范圍，增加了檢測(cè)方法通量，提高了檢測(cè)方法效率。