王丹，孫學穎，劉建林，趙麗華，靳燁

（內蒙古農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，內蒙古 呼和浩特 010020）

發(fā)酵食品有著古老的歷史，距今可追溯到2 500多年前[1-2]。因其含有豐富的營養(yǎng)物質和特殊的風味在世界各地廣為流傳，發(fā)酵食品在我國也有著重要的意義。中華民族為了便于將肉類儲藏，以及提高其可口性進而世代相傳發(fā)展起來頗具特色的發(fā)酵肉制品。發(fā)酵肉制品在加工制作過程中伴隨一定的微生物來發(fā)酵原料肉，是增加肉類中生物活性成分的天然途徑之一[3]。但由于傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品在自然加工過程中存在加工時間長、脂類氧化變質、風味物質不穩(wěn)定以及有毒有害物質易產(chǎn)生等問題，更加健康有新意的發(fā)酵肉制品的研究與開發(fā)造成了一些傳統(tǒng)肉制品的地域特征風味喪失，傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品的食用和經(jīng)濟價值嚴重受損的同時，消費大眾對發(fā)酵肉制品的安全性、所含營養(yǎng)價值以及風味色澤要求也越來越高。

發(fā)酵肉制品特有的風味主要由于肉類風干進程中的理化變化和微生物（外源性+內源性）參與肉類中脂肪和蛋白質分解、氧化等反應的變化，從而逐漸產(chǎn)生酯、醛、酮、酸等一系列小分子化合物，風干發(fā)酵時間的不斷加長，微生物的作用也變得越來越顯著[4-5]；我國傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品在形成獨特的品質過程中含有大量的微生物菌群，這些微生物菌群起決定性作用。但這些微生物中如果部分有害菌在發(fā)酵過程中成為優(yōu)勢菌，則會影響發(fā)酵肉制品的最終食用品質。目前眾多學者已在微生物多樣性分析及運用微生物改善發(fā)酵肉制品品質等方面獲得了重要進展[6-10]。本文通過綜述發(fā)酵肉制品中微生物（降/不產(chǎn)生物胺菌株和產(chǎn)生物胺菌株）與生物胺形成的聯(lián)系，在提高發(fā)酵肉制品中微生物資源利用率的同時保證發(fā)酵肉制品的品質安全性，為利用發(fā)酵劑調控微生物菌群結構來降低生物胺潛在危害的應用提供科學依據(jù)。

1 發(fā)酵肉制品中的微生物

發(fā)酵肉制品是指在自然或人工控制的低溫條件下，對肉類進行一系列加工再加以輔料，進而生產(chǎn)出的肉制品。這個過程伴隨微生物或酶的發(fā)酵作用，使其發(fā)生各種生物、化學、物理反應，為肉制品提供了不同的質地、顏色、風味以及貯藏條件[11-14]。微生物發(fā)酵是食品加工和保鮮中最古老和最實用的技術之一，因為是自然環(huán)境下發(fā)酵的肉制品，微生物群體區(qū)系比較復雜，肉制品中可能存在著大量的優(yōu)良微生物菌株，肉制品借助部分有益微生物，使得原料肉中的蛋白質分解成為游離氨基酸后形成大量乳酸，導致肉制品的pH值降低，有害微生物的生長繁殖從而得到抑制，大大提高了其消化性、營養(yǎng)性、風味以及貯藏時間。而傳統(tǒng)的肉類腌制工藝，既保留了天然的蛋白質來源，又提高了其感官品質，其中發(fā)酵是肉制品提升品質的措施之一。通過發(fā)酵將食品原料轉化為穩(wěn)定的食物在許多古代文化中很普遍，但未對生產(chǎn)過程中微生物進行成分分析。

目前，許多國家采用高通量測序的宏基因組學或通過16s/18s rDNA，ITS區(qū)域進行擴增測序等現(xiàn)代生物技術分析微生物群落測序、研究并監(jiān)控優(yōu)良發(fā)酵菌株在肉制品發(fā)酵過程中微生物的菌相變化。黃鄭朝等[15]和TALON R等[16]均應用高通量測序技術，對傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品測序后進行了微生物多樣性分析，研究表明發(fā)酵肉制品中微生物菌群多樣性豐富。目前，發(fā)酵肉制品中的優(yōu)勢微生物主要有細菌菌群、霉菌菌群和酵母菌菌群等，這些微生物菌群在發(fā)酵肉制品成熟過程的不同階段形成不同的菌群結構發(fā)揮不同的作用，對于發(fā)酵肉制品產(chǎn)品形成不同品質發(fā)揮著重要作用。自然發(fā)酵的菌群主要來自于產(chǎn)品本身及發(fā)酵時在環(huán)境中偶然獲得的微生物，微生物的來源無法控制，一但有害菌得到繁殖形成優(yōu)勢菌群，將導致產(chǎn)品的質量無法控制，經(jīng)常出現(xiàn)同一批產(chǎn)品在質量上差別很大?，F(xiàn)如今，為了縮短產(chǎn)品生產(chǎn)周期的同時而保證產(chǎn)品的質量安全，在工業(yè)化批量生產(chǎn)中人工接種微生物逐漸取代了早期的自然發(fā)酵。微生物被作為外源發(fā)酵劑廣泛使用，不同菌株間存在拮抗或協(xié)同作用，所以研究者難以明確發(fā)酵肉制品不同階段的優(yōu)勢菌群，無法通過人工調控發(fā)酵肉制品的微生物菌群結構來把控發(fā)酵肉制品的品質安全。鄧展瑞等[17-18]在研究隴西臘肉和哈爾濱風干腸制作過程中微生物存在情況時發(fā)現(xiàn)，在產(chǎn)品制作過程中乳酸菌數(shù)起主導作用，始終保持較高水平，其中主要以乳酸菌屬為主。ELíAS M等[19]研究表明，其中大多數(shù)情況下乳酸菌在發(fā)酵過程中都會成為優(yōu)勢菌，少數(shù)情況下為其它微生物。畢旺來等[20]研究得出煙熏臘肉儲藏過程中主要的微生物為葡萄球菌。如果肉制品在發(fā)酵過程中不能夠嚴格控制微生物，接種發(fā)酵劑從開始直到發(fā)酵結束，始終為優(yōu)勢菌[21]。Holko等[22]接種混合發(fā)酵劑制作羊肉香腸后，結果表明貯藏兩個月后的羊肉香腸中嗜酸乳桿菌始終起主導作用，而動物雙歧桿菌則已檢測不到。賀稚非等[23]檢測浙江金華火腿的微生物菌群結構復雜，火腿表面的霉菌與內部的葡萄球菌與乳酸菌區(qū)系之間互相作用相互影響，再一次證實了菌株間的拮抗或協(xié)同作用。所以發(fā)酵肉制品在自然發(fā)酵過程中，由于環(huán)境復雜發(fā)酵肉制品發(fā)酵及貯藏過程中菌群之間的競爭無法確定，優(yōu)勢菌群也隨之發(fā)生變化，難以保證產(chǎn)品的質量以及安全。

由此可見，發(fā)酵肉制品中微生物菌群多種多樣，菌群結構呈多樣性，較常見的發(fā)酵微生物種類主要包括乳酸菌（Lactobacillus）、腸細菌（Enterobacteria）、酵母菌（Saccharomyce）及霉菌（Moulds）、葡萄球菌（Staphylococcus）和嗜冷桿菌（Psychrobacter）以及肉桿菌（Carnobacterium）的某些種。這些微生物可以被單獨或復合使用，存在著菌群效應。發(fā)酵肉制品加工中很多優(yōu)勢菌的產(chǎn)生對發(fā)酵肉制品特有品質的形成有積極作用，但也有一些微生物（主要為雜菌），若不能很好地控制，將會破壞發(fā)酵肉制品應有的品質和風味。

2 發(fā)酵肉制品中的生物胺

生物胺（biogenic amines，BAs）是有機堿性含氮的、低分子量、熱穩(wěn)定、不易揮發(fā)的生物活性化合物，存在于植物、微生物和動物細胞中，廣泛存在于食品中，尤其是發(fā)酵食品如發(fā)酵肉制品。包括色胺（tryptamine，TRP）、2-苯乙胺（2-phenylethylamine，PHE）、腐胺（putrescine，PUT）、尸胺（cadaverine，CAD）、組胺（histamine，HIS）、酪胺（tyramine，TYR）、亞精胺（spermidine，SPD）、精胺（spermine，SPE）等，生物胺的產(chǎn)生途徑在發(fā)酵肉制品中有兩條[24]。一是脂肪族生物胺在醛或酮的轉氨作用下產(chǎn)生，二是主要形成于微生物對氨基酸的脫羧作用中，在蛋白酶的作用下使大分子蛋白質分解成游離氨基酸，原料肉中本身存在的或是在發(fā)酵過程中污染了與產(chǎn)胺相關的微生物。它的形成必須具備3個條件：氨基酸脫羧酶由微生物分泌而成；有氨基酸和寡肽成分大量存在；適合微生物生長的環(huán)境條件。在微生物氨基酸脫羧酶作用下，組胺、酪氨、尸胺等是由相對應的氨基酸前體物質發(fā)生脫羧反應生成的產(chǎn)物，相比于腐胺、精胺和亞精胺的多步反應形成來說比較復雜，形成過程如圖1所示[25-27]。

圖1 生物胺的形成途徑Fig.1 Forming pathway of biogenic amine

生物胺（BAs）經(jīng)常被作為各種肉類、魚類、葡萄酒的質量指標，用以表征食品的新鮮度和/或變質程度[28]。BAs是一類對人體具有精神作用和一些精神類藥物的作用結合點，然而人類的解毒系統(tǒng)不能消除過量的BAs，因此可能會造成多種生理效應。人體食用BAs含量超標的發(fā)酵食品，會引起過敏反應，如頭疼、腹部痙攣、嘔吐等不良生理狀況反應，甚至會對人體的神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉造成極大的損傷和紊亂，甚至引起輕度抑郁[29-30]。但很難確定這些胺的毒性水平。此外，特別值得一提的是免疫力低下的脆弱人群，如老年人、兒童和嬰兒，可能對低水平的BAs不耐受，并表現(xiàn)出更嚴重的癥狀。BAs對熱不敏感，但若在含有亞硝酸鹽和硝酸鹽等固化劑以及經(jīng)過熱處理的條件下，有利于BAs和亞硝酸鹽相互作用形成亞硝胺[31-32]。我國傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品的種類繁多，形式多樣，地區(qū)來源不同、發(fā)酵和貯存條件不同，導致BAs的形成和降解途徑不同。同時又由于自然發(fā)酵的傳統(tǒng)肉制品生產(chǎn)條件難以控制，容易造成較大的產(chǎn)品質量差異，因此在工業(yè)化生產(chǎn)中傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品的產(chǎn)品安全把控會存在很多問題：第一是滋生污染食物的金黃色葡萄球菌；第二是產(chǎn)生引起食物中毒的肉類毒素；第三是制作過程中BAs的生產(chǎn)；第四是硝酸鹽、亞硝酸鹽、重金屬離子等產(chǎn)生的毒性[33]。另外，原料肉在進行加工之前就可能被微生物污染，肉制品中BAs的毒性潛能不僅取決于人體快速清除的能力，還取決于食品中BAs的質量和數(shù)量，這就增加了BAs產(chǎn)生的風險性。原料肉及肉制品中常見且豐富的生物胺是酪胺、腐胺和尸胺，部分肉制品含有低含量的組胺、色胺、精胺和亞精胺，其水平在不同類型的產(chǎn)品之間有很大差異。

總生物胺可作為質量或安全系數(shù)使用，美國食品和藥品管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）規(guī)定的生物胺限量標準建議總BAS＜1 000 mg/kg。KUNG等[34]對發(fā)酵香腸中的生物胺含量進行測定，結果發(fā)現(xiàn)13類產(chǎn)品中有2類BAs含量較高，其中有一種香腸的組胺含量為102 mg/kg，而美國對于發(fā)酵香腸中組胺含量規(guī)定為50 mg/kg，這遠遠超過FDA的標準。張海萍等[35-38]利用高效液相色譜丹磺酰氯柱前衍生法，分別以新疆自治區(qū)的44種熏馬腸、30種四川香腸、6種不同類型發(fā)酵肉制品和7?。ㄊ校┤拥?2個傳統(tǒng)中式香腸進行BAs含量的檢測，結果表明：部分樣品的BAs總量超過FDA規(guī)定的生物胺限量標準，其中色胺、酪胺和亞精胺含量均不同程度超過BAs的安全劑量標準，其中腐胺和尸胺含量與國外報道的生物胺含量安全標準范圍基本一致，精胺在火腿中含量最高，存在一定的安全隱患。丁洪流等[39]對江蘇省13市191批次腌臘肉制品進行抽檢，生物胺平均濃度在種間存在顯著差異。在191批次腌臘肉制品中，1批次組胺超過DB 3112004—2012《食品安全地方標準發(fā)酵肉制品》限量；1批次酪胺超過1 000 mg/kg，高達1 150 mg/kg。發(fā)酵肉制品由于原料和當?shù)丨h(huán)境的差異，形成了具有地方特色的風味，而風味的生成與BAs存在密切關系，因此，在保留發(fā)酵肉制品獨特風味的同時，如何控制發(fā)酵肉制品的生物胺含量是當今發(fā)酵肉制品的一大挑戰(zhàn)。

3 微生物與生物胺的相關性研究

食品中BAs與發(fā)酵肉制品環(huán)境污染、微生物腐敗以及貯藏環(huán)境衛(wèi)生有關。食品中BAs的生成與發(fā)酵食品中的微生物菌群或者發(fā)酵食品的食用品質、感官風味品質、安全品質有關。因而使得研究學者在解決BAs問題上止步不前。研究發(fā)現(xiàn)發(fā)酵肉制品的微生物菌群結構可以解釋發(fā)酵肉制品中BAs的測定濃度。原料肉及肉制品中常見的生物胺是酪胺、腐胺和尸胺，這些BAs主要由乳酸菌、腸桿菌、假單胞菌產(chǎn)生[40]。Halász等研究證明乳酸菌和乳酸片球菌均能產(chǎn)生多種胺類（組胺、尸胺、腐胺、酪胺、精胺和亞精胺），與BAs相關的芽孢桿菌屬中的許多菌株都顯示出一種或多種不產(chǎn)生物胺或降生物胺的能力，如弗氏檸檬酸（Citrobacter）、梭狀芽孢桿菌（Clostridium）、克雷伯氏菌（Klebsiella）、嗜冷桿菌（Psychrobacter）、大腸桿菌（Escherichia coli）、變形桿菌（Proteus species）、假單胞菌 （Pseudomonadaceae）、沙門氏菌（Salmonella）、志賀氏菌（Shigella Castellani）、片球菌（Pediococcus Claussen）、鏈球菌（Streptococcus）、腸球菌（Enterococcus）及弧菌（Vibrio），且發(fā)酵產(chǎn)品中生物胺的生成量與微生物之間存在內在聯(lián)系，菌株效應十分顯著。其中大腸桿菌和假單胞菌可積累組胺、腐胺和尸胺。因此，BAs含量與非發(fā)酵食品的衛(wèi)生質量差有關[41]。

自然發(fā)酵的傳統(tǒng)肉制品，原料肉中的初始微生物與自然環(huán)境中微生物的相互競爭、適者生存，適應主體環(huán)境的微生物成為優(yōu)勢菌株。研究學者目前關注的重點主要在于分析生物胺潛在的毒性作用和對食品新鮮度的指示程度[42]，對生物胺的安全性[43-44]、分析檢測[45-47]、形成及控制[48-50]均有較深入的研究。但對發(fā)酵肉制品的潛在危害物質——生物胺和微生物之間的內在關系缺乏足夠的認識。早在20世紀40年代，研究者就發(fā)現(xiàn)生物胺的合成反應與微生物的代謝作用息息相關。如Gabastou等[51]在一個人的病例報告中發(fā)現(xiàn)游離氨基酸作為前驅物質，部分微生物在生長數(shù)天后會產(chǎn)生生物胺。細菌可以產(chǎn)生生物胺，同時提示生物胺可能與人體的精神狀態(tài)有關[52]。微生物對生物胺的形成具有特異性，有研究表明組胺的形成離不開一些產(chǎn)氣腸桿菌和哈夫尼腸桿菌的作用[53-54]。Teresa曾指出，腸細菌和假單胞菌屬的增殖與尸胺、腐尸胺的形成有關[55]。近年來研究表明，微生物菌群結構在發(fā)酵香腸中的產(chǎn)胺能力各不相同，在不同環(huán)境下對生物胺含量有不同的影響，微生物菌群結構決定著發(fā)酵香腸生物胺的含量。如果自然環(huán)境中或食品自身存在某一特定菌株可能僅僅產(chǎn)生一種生物胺或同時代謝生成多種生物胺。添加單一或混合發(fā)酵劑可降低發(fā)酵肉制品的pH值和水分活度，從而改變其菌群結構[56-57]。Lu SHILING等[54]將乳酸菌+腐生葡萄球菌作為發(fā)酵劑對發(fā)酵香腸微生物菌群結構和生物胺的影響進行了研究，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵香腸中不同微生物產(chǎn)生物胺的能力不同，表明乳酸菌發(fā)酵劑可以有效抑制本地菌群，再一次證實了微生物菌群結構決定著發(fā)酵肉制品生物胺的含量這一結論。

食品中的BAs由于其生理和毒理學效應，成為一個潛在的公共衛(wèi)生問題。因此，選擇國內典型的傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品進行研究，分析發(fā)酵肉制品加工及貯藏工程中的微生物菌群結構和生物胺的變化規(guī)律，探索微生物菌群結構對發(fā)酵肉制品中生物胺變化機理與積累的相互關系，建立生物胺含量、菌群結構的構效關系，對發(fā)酵肉制品的工業(yè)化開發(fā)具有重要意義。我們目前研究的重點應集中于確定BAs對消費者在食品中構成的真正毒性風險，不應局限于單一的胺類或食品，而應涵蓋所有涉及的胺類和所有消費的食品。還應注意引起毒性的其它因素，如毒性增強劑（monoamine oxidase inhibitor，MAOI）的攝入、食物攝入所產(chǎn)生的協(xié)同作用等。雖然這些方面確實難以解決，但應該加以研究，并納入未來的法規(guī)，以確保食品安全和消費者的健康。因此科學有效地鑒別發(fā)酵肉制品對于維護人類健康安全有重大意義。

3.1 發(fā)酵肉制品與不產(chǎn)/降生物胺微生物

有研究學者參考篩菌分離選擇了不產(chǎn)/降生物胺的干酪乳桿菌后得出，干酪乳桿菌這株降生物胺的微生物菌株已被歐洲食品安全局列入安全合格推定（the qualifiedpresumptionofsafety，QPS）名單。其中ANL ERTAN[58]從冷熏豬肉香腸中篩選出了可以降解尸胺、腐胺的乳酸菌。陸永梅等[59]篩菌后選擇了不產(chǎn)生物胺的腸膜明串珠菌來發(fā)酵香腸。朱志遠等[60]在發(fā)酵香腸中添加了不同種類的發(fā)酵劑，研究分析成熟過程中生物胺生成量，結果表明添加混合發(fā)酵劑（香腸乳桿菌+肉糖葡萄球菌）可以有效抑制多種生物胺的生成，降低色胺、腐胺、尸胺、組胺的含量，混合發(fā)酵劑（腸膜明串珠菌+肉糖葡萄球菌）的添加可以抑制2-苯乙胺和酪胺的生成。Mah等[61]發(fā)現(xiàn)，木糖葡萄球菌可以協(xié)助其它菌株更好地發(fā)揮降胺效果。高文霞等[62-64]分別驗證得出木糖葡萄球菌有助于戊糖片球菌和肉葡萄球菌發(fā)揮作用，進一步降低生物胺含量。

3.2 發(fā)酵肉制品與產(chǎn)胺微生物

微生物被認為是發(fā)酵肉制品中生物胺積累的主要原因，生物胺濃度與特定的產(chǎn)胺微生物的種類以及數(shù)量呈明顯的正相關性。不同發(fā)酵肉制品其主要產(chǎn)胺微生物的種類有較大差異，不同地區(qū)的同一種發(fā)酵肉制品其產(chǎn)胺微生物的產(chǎn)生量也有很大差異。這可能是由于食品微生態(tài)引起的差異，而食品微生態(tài)主要包括原料不同、地區(qū)不同、加工工藝不同、以及貯藏環(huán)境不同所造成的。不新鮮的原料遇到某些微生物在低酸、低鹽度或特殊條件下對外界環(huán)境作出協(xié)同作用，使產(chǎn)胺微生物在加工或貯藏過程中正常生長，造成發(fā)酵肉制品生物胺含量的增加。文獻資料表明，發(fā)酵肉制品中產(chǎn)生生物胺的微生物種類繁多。一般主要從魚類產(chǎn)品和發(fā)酵食品中分離、篩選產(chǎn)胺微生物，包括腸細菌、乳酸菌、肉桿菌、葡萄球菌、酵母菌。劉蕾等[65]從市售的云南臘腸中共分離得到52株細菌，其中43株具有產(chǎn)生物胺能力，其中的7株細菌產(chǎn)尸胺和組胺的能力較強，部分菌株產(chǎn)酪胺。谷思靜[66]則在我國傳統(tǒng)臭豆腐中篩選出了一株高產(chǎn)生物胺的酵母菌，表明蛋白質含量較高的食品存在產(chǎn)生物胺的酵母菌。李蕊婷等[67]從新疆熏馬腸中篩選分離鑒定產(chǎn)胺微生物，發(fā)現(xiàn)的優(yōu)勢細菌中木糖葡萄球菌產(chǎn)苯乙胺量最高，含量為3831.50μg/mL。阮一凡等[68]在研究混菌發(fā)酵鴨腿時發(fā)現(xiàn)在貯藏35 d左右隨著大腸桿菌數(shù)量的增加，生物胺的總含量逐漸上升。

由此可見，生物胺的形成與微生物的活動密不可分。發(fā)酵肉制品中生物胺的積累不僅與微生物存在正相關或負相關關系，而且二者之間存在著復雜的關系。微生物影響發(fā)酵肉制品中生物胺的形成，進而影響生物胺的含量。目前，生物胺產(chǎn)生能力還不能按物種分類，只能歸屬到菌株，因此生物胺的種類和含量與微生物菌株的差異相關，與微生物的種類無關。發(fā)酵肉制品中檢出的微生物種類一覽見表1。

表1 發(fā)酵肉制品中檢出的微生物種類一覽Table 1 Microbial species detected in fermented meat products

4 結語

近年來隨著科技的進步，發(fā)酵肉制品在成為食品加工制品研究新熱點的同時，關于發(fā)酵肉制品中生物胺的研究逐漸增多。國內外研究者綜述了影響生物胺形成的各種因素，證明生物胺是一定能生成的，不受條件的限制。中國傳統(tǒng)的肉制品歷史悠久，可以滿足人們不同類型和口味的需求，不同的地域環(huán)境使得肉制品發(fā)酵及貯藏條件有所不同，發(fā)酵肉制品的外界環(huán)境導致肉中微生物菌群結構不同可能導致生物胺形成及降解途徑存在差異。但國內的相關研究主要集中于臭豆腐、海產(chǎn)品、腌干魚類、酒類、酸菜等，且僅僅局限于生物胺含量測定以及降生物胺菌株的篩選分離。隨著消費者對安全、高品質、少添加劑的加工產(chǎn)品的興趣越來越深厚，推動了食品工業(yè)和食品安全的發(fā)展，因此不添加化學物質且安全的加工肉制品變得越來越熱門，生物胺的降解及調控技術也將成為未來的研究重點。